人外周血树突状细胞的诱导与鉴定

目的：体外诱导、培养人外周血单核细胞获得不同成熟阶段的树突状细胞（DCs）。方法：用贴壁法从健康人外周血浓缩白细胞获取单核细胞,第一阶段在GM-CSF+IL-4存在的条件下培养7 d,获得未成熟DCs;第二阶段在GM-CSF+TNF-α联合诱导下培养至14 d,获得成熟的DCs。对DCs的形态进行显微镜下观察,用流式细胞仪检测其表型,用MTT的方法对DCs的功能进行检测。结果：获得的未成熟DCs中度表达CD1a、共刺激分子,高表达HLA-DR分子,在DCs的成熟期共刺激分子、HLA-DR及CD83、CD25分子均高度表达,刺激同种异型T淋巴细胞增殖的能力强。结论：成功地建立了诱导人外周血单核细胞获得不同发育阶段DCs的方法,并获得了大量纯度较高的DCs。     

不同成熟状态小鼠树突状细胞的体外诱导

目的：体外诱导小鼠骨髓来源的不同成熟状态树突状细胞(dendritic cells，DCs)。方法：rmGM—CSF体外培养小鼠骨髓细胞，5～6d后，利用磁性细胞分离器(MACS)分离CD11C^ 细胞，部分细胞加入rmTNFα继续培养1～2d，通过流式细胞仪检测分别检测细胞表面标志，同种混合淋巴细胞反应检测细胞的体外刺激能力。结果：小鼠骨髓细胞经rmGM-CSF培养5～6d，再经过MACS分离可获得大量未成熟DCs，细胞表面出现少量短而粗的突起，低水平表达MHCI／分子和共刺激分子CD80、CD86及CI40，刺激同种CD4^ T细胞的混合淋巴细胞反应能力较弱：加入rmTNFα继续培养可获得成熟DCs，细胞表面出现大量细长突起，细胞表面高水平表达MHC Ⅱ分子和共刺激分子CD80、CD86及CI40，刺激同种CI4^ T细胞的混合淋巴细胞反应能力较强。结论：通过rmGM-CSF或rmGM-CSF rmTNFα体外培养体系可以获得大量未成熟DCs或成熟DCs，为进一步研究DCs的生物学功能提供实验基础。     

含CEA片段的重组腺病毒转染DCs诱导特异性T细胞对结直肠癌细胞株的体外杀伤作用

目的:探讨人外周血单核细胞来源的树突状细胞转染含CEA片段的重组腺病毒后所诱导的特异性T细胞对直肠癌细胞株LOVO和SW480的体外杀伤作用。方法:抽取HLA表型为A11的健康志愿者外周血,分离单核细胞,体外培养,使用含CEA片断的重组腺病毒转染未成熟DCs,诱导特异性T细胞。检测体外培养的DCs和CTL活性,并使用MTT法检测CTL对LOVO细胞的杀伤作用。结果:转染或未转染的体外培养的成熟DCs高表达CD40、CD86,IL-12,诱导的CTL细胞高表达IFN-γ;转染后DCs诱导特异性CTL可有效识别并杀伤HLA-A11阳性的LOVO细胞。结论:重组腺病毒转染DCs,不明显改变DCs表型和刺激淋巴细胞增殖、分化功能,可诱导自体CTL增殖,含CEA片断的腺病毒转染DCs诱导自体CTL对LOVO细胞有明显杀伤作用。     

树突状细胞的制备及其辅佐功能的实验研究

目的 探讨应用外周血体外扩增树突状细胞(DC)的方法及DC的辅佐功能。方法 分离人外周血单核细胞，应用GM—CSF，IL—4及TNF—α培养观察，并应用MTT法检测DCs在同种混合淋巴细胞反应(MLR)中激发同种T淋巴细胞增殖的能力。结果 经体外诱导扩增，可将外周血单核细胞定向诱导大量的具有典型DC形态的树突状细胞。混合淋巴细胞反应结果提示，只需少量DC，即可强烈激发同种T淋巴细胞增殖。结论 (1)用GM—CSF、IL—4及TNF—α能从人外周血诱导、扩增出DC；(2)DC具有高效的刺激静止T淋巴细胞活化增殖的能力。     

小鼠骨髓源性树突状细胞体外诱导培养体系的构建

建立一种体外诱导培养小鼠骨髓源性的树突状细胞(DCs)方法,在镜下可观察到培养出的未成熟树突状细胞(imDCs)比成熟树突状细胞(mDCs)细胞突起少。流式细胞术检测 CD80、CD86、MHC-Ⅱ分子在 imDCs 的表达显著低于在 mDCs 上的表达。同种异基因混合淋巴细胞反应显示DCs 刺激 T 细胞增殖的能力随着 DCs 所占比例的增大而增强,在相同比例条件下对刺激 T 细胞增殖的能力,imDCs 显著低于成熟 mDCs。该诱导方法可获得大量符合科研要求的小鼠骨髓源性 DCs。     

白血病细胞抗原负载脐血DCs体外诱导抗白血病特异性CTLs应答研究

目的：探讨体外诱导脐血产生特异性细胞毒淋巴细胞的可行性。方法：通过体外联合细胞因子体外诱导10份脐血单个核细胞分化为树突状细胞（ dendritic cells,DCs）,同时让DCs细胞负载U937冻融抗原;使成熟DCs刺激同源的脐血T淋巴细胞生成细胞毒性T细胞（ cytotoxic T lymphocytes,CTLs）从而进行杀伤效应实验。 MTT法测定杀伤活性。结果：10份脐血标本均可培养出形态典型、功能成熟的DCs。经DCs诱导效应细胞DC-CTLs,在不同效靶比对U937细胞系、K562细胞株和对照组中,杀伤率以U937组最高（ P〈0.05）。结论：特定抗原负载的脐血DCs细胞有特异性的杀伤效应。     

反义bcl-2的表达诱导癌细胞凋亡致敏树突状细胞的免疫应答

目的 观察树突状细胞（DCs)对反义bcl-2的逆转录病毒表达载体诱导的凋亡胆管癌细胞获取抗原后，抗肿瘤免疫应答及对胆管癌细胞的特异性免疫杀伤效果。方法 用粒－巨噬细胞集落刺激因子（GM－CSF）加白介素－4（IL－4）从人外周血分化，诱导DCs，反义bcl-2的逆转录病毒表达载体在体外诱导培养的人胆管癌细胞凋亡，将DCs，T淋巴细胞和凋亡胆管癌细胞区培养，同时设计不同类型肿瘤细胞（坏死胆管癌细胞及培养胆管癌细胞）作对照，7d后，分离，富集DCs，T淋巴细胞进行免疫应答及肿瘤细胞杀伤试验。结果 DCs高表达共刺激分子B7和CD1a，表面具有典型不规则突起，反义bcl-2表达诱导癌细胞凋亡形成的凋亡小体被DCs捕捉，吞噬，负载抗原的DCs可以有效提呈胆管癌细胞抗原，有强烈的免疫应答，刺激的细胞毒T淋巴细胞（CTLs)特异性地杀伤胆管癌细胞。结论 反义bcl-2的逆转录病毒表达载体诱导癌细胞凋亡可以致敏rhGM-CSF加rhIL-4从人外周血单核细胞诱导，扩增出的DCs并产生显著的杀伤胆管癌细胞的免疫反应，可望成为特异性免疫治疗肿瘤的一条新途径。     

人外周血单核细胞体外诱导树突状细胞及鉴定

目的：建立从人外周血单核细胞体外诱导培养树突状细胞（dendritic cell,DC)的方法。方法：分离人外周血单个核细胞,以细胞因子粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（GM－CSF）,白细胞介素－4（IL－4）,肿瘤坏死因子α（TNF－α）诱导培养获得DC,电镜及共聚集显微镜观察其形态,流式细胞术检测细胞表面抗原,体外同种混合淋巴细胞反应检测DC刺激T细胞的增殖活性。结果：从正常外周血分离得到的单核细胞,体外经重且人GM－CSF,IL－4,TNF－α的共同诱导培养,得到大量成熟DC,形态学观察可见典型DC特征,荧光激少在细胞分离器（FACS）检测表明,诱导的DC高表达HLA－DR（96％）,CD83（94．2％）,CDla(94.2%)分子,同时也高表达CD40（97．7％）,CD80（98．2％）分子,同种混合淋巴细胞反应显示,诱导的DC具有很强的激发同种T细胞增殖的能力。结论：人外周血单核细胞体外经细胞因子贯序诱导培养,可以生成大量功能成熟的DC,为进一步开展DC的基础研究和临床应用提供了可能。     

α-干扰素联合GM-CSF体外诱导培养脐血树突状细胞及其功能的测定

目的 探讨重组人α-干扰素(rhIFN-α)联合重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)体外诱导培养脐血树突状细胞(DCs)的实验方法。方法 人脐血贴壁单个核细胞加入rhIFN-α及rhGM-CSF诱导培养,镜下观察培养细胞形态;流式细胞术检测培养细胞CD83、CD86的表达;MTT法检测诱导培养的DCs体外刺激同种异体T淋巴细胞增殖的活性。结果 人脐血贴壁单个核细胞经rhIFN-α联合rhGM-CSF共同培养后,第7d镜下可见有表面呈树状突起的DCs;细胞免疫表型检测结果示培养细胞有成熟DCs特异性标记CD83及共刺激分子CD86表达;rhIFN-α为600U／ml、rhGM-CSF为2000U／ml时为脐血DCs诱导培养的合适浓度(培养细胞CD83^ CD86^ 细胞比率最高);以诱导培养7d的脐血细胞(含DCs)作为刺激细胞与同种异体T淋巴细胞(反应细胞)以不同比例混合培养时,DCs均可刺激其增殖,其中以反应细胞：刺激细胞为20：1时最明显。结论 rhIFN-α联合rhGM-CSF细胞因子体外诱导人脐血贴壁单个核细胞,可生成具有典型形态及功能的成熟DCs。     

人外周血树突状细胞的分离培养及鉴定

目的从外周血中分离单个核细胞 ,经体外诱导培养获取高纯度的树突状细胞。方法淋巴细胞分离液分离外周血的单个核细胞 ,经贴壁 2h后加入GM CSF、IL 4诱导 7天 ,观察细胞形态 ,用流式细胞仪检测其表面标志 ,采用混合淋巴细胞培养法检测其刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力。结果经诱导生成的细胞具有典型的DCs形态特征 ,高表达CD83 、CD86和MHCⅠ、Ⅱ类分子 ,在体外能诱导强烈的同种异体淋巴细胞增殖反应。结论本研究所建立的经济、简便的从外周血获取大量成熟DCs的方法 ,为DCs的进一步研究奠定了基础。     

成熟与未成熟小鼠树突状细胞的生物免疫学特性研究

目的 研究小鼠骨髓成熟树突状细胞(mDC)与未成熟树突状细胞(imDC)的生物免疫学特性.方法 体外诱导培养小鼠骨髓imDC,经肿瘤坏死因子-α(TNF-α)刺激获得mDC.用小鼠CD11c免疫磁珠纯化DC.电镜观察DC的细胞形态.流式细胞术(FCM)检测细胞表面分子MHCⅡ、CD80、CD86的表达.用细胞增殖检测试剂(CCK-8)检测混合淋巴细胞反应(MLR)中DC刺激同种异基因T细胞的增殖能力.实时荧光定量PCR(QPCR)检测DC上细胞因子mRNA的表达.ELISA检测DC培养上清中的细胞因子表达.结果 电镜观察:imDC比mDC细胞突起少、短.胞质内有更多吞饮泡及溶酶体.FCM检测imDC上MHC-Ⅱ(27.2％)、CD80(27.6％)、CD86(29.5％)的表达水平均显著低于mDC MHC-Ⅱ(97.7％)、CD80(97.2％)、CD86(96.4％).MLR中相同反应比例imDC刺激T细胞的增殖能力,1∶5(1.63±0.04),1∶10(1.50±0.08),1∶20(1.28±0.07),1∶40(1.19±0.04),显著低于mDC 1∶5(2.21±0.09),1∶10(1.92 ±0.02),1∶20(1.64±0.01),1∶40(1.45±0.06),两组间差异均有统计学意义(均P＜0.01).QPCR检测imDC上IL12p35(0.66±0.13)、IL12p40(0.57±0.10)、IFN-γ(0.74±0.08)mRNA相对表达量(mDC为对照)显著低于mDC(1.00±0.00,P＜0.05),而TGF-β(1.35±0.09)显著高于mDC(1.00±0.00,P＜0.05).ELISA法检测imDC分泌IL12p70(6 ±4)、IFN-γ(56±15)显著低于mDC IL12p70(120±22)、I FN-γ(90±15,P＜0.05),而TGF-β(176±23)显著高于mDC TGF-β(55±18,P＜0.05).结论 imDC低表达共刺激分子、MHC-Ⅱ和Th1类细胞因子,高表达TGF-β,不能活化T细胞,具有耐受原性.mDC高表达共刺激分子、MHC-Ⅱ和Th1类细胞因子,可激活初始T细胞,具有免疫原性.     

落新妇苷对小鼠骨髓来源树突状细胞成熟及免疫功能的抑制作用

目的：探讨落新妇苷对小鼠骨髓来源树突状细胞（dendritic cell, DC）成熟和免疫功能的影响。 方法：采用体外条件培养法得到小鼠骨髓来源未成熟树突状细胞,加入脂多糖刺激细胞成熟。落新妇苷（低浓度25 μg/mL、中浓度50 μg/mL、高浓度100 μg/mL）处理细胞后,流式细胞仪分析各组细胞凋亡,细胞表面主要组织相容性抗原复合物分子Ⅰa和共刺激分子CD40、CD80和CD86表达;异硫氰酸荧光素标记葡聚糖内吞实验分析各组DC抗原吞噬功能;酶联免疫吸附测定法检测各组DC培养液上清白细胞介素12亚单位p40（p40 subunit of interleukin-12,IL-12p40）水平;氚-胸腺嘧啶核苷掺入法检测体外混合淋巴细胞反应（mixed lymphocyte reaction, MLR）中各组DC刺激同种反应性T细胞的增殖能力,酶联免疫吸附测定法检测MLR上清IL-2、IL-4、IL-10、γ干扰素水平。 结果：各组DC凋亡率差异无统计学意义（P＞0.05）。与脂多糖组相比,高、中、低浓度落新妇苷组细胞表面主要组织相容性抗原复合物分子Ⅰa和共刺激分子表达明显降低,抗原吞噬能力明显升高,分泌IL-12p40明显减少,刺激同种反应性T细胞增殖的能力显著下降（P〈0.05）。与脂多糖组相比,高、中、低浓度落新妇苷组MLR上清中IL-2和γ干扰素水平明显降低（P〈0.05）,而IL-4、IL-10水平比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。 结论：落新妇苷（25、50、100 μg/mL）能够剂量依赖性地抑制体外培养小鼠骨髓来源DC的成熟,并对其免疫功能具有一定的负性调节作用。     

Generation of dendritic cells from healthy human peripheral blood]

OBJECTIVE: To get high quality and sufficient numbers of mature dendritic cells (DC) from healthy human peripheral blood. METHODS: Cultured plastic-adherent monocytes were isolated from healthy human peripheral blood by use of granulocyte-monocyte clony-stimulating factor and Interleukin-4 for 7 days without fed with fresh medium and cytokine. RESULTS: A large number of DCs with high purity were generated. These DCs expressed HLA-I, II molecules, Costimulating molecules and adherent molecules highly, showing the characteristics of mature DC. These DCs could stimulate proliferation of allogenic T lymphocytes and had active endocytosis ability which peaked at the third day in culture but decreased afterwards. CONCLUSION: These results provide evidence that CD monocytes isolated from peripheral blood monocytes exhibit dendritic cells characteristics and may facilitate further studies of DC and its clinical application.     

小鼠脾脏来源树突状细胞的体外扩增培养

目的:对体外诱导小鼠脾脏单个核细胞分化成的树突状细胞(DC)的生物学表型及功能进行检测,并与骨髓来源的DC进行比较.方法:分离小鼠脾脏单个核细胞,在体外培养的条件下通过添加25 ng·ml-1的粒-单核细胞集落刺激因子和25 ng·ml-1的白细胞介素-4(IL-4)将其诱导为DC,分别从细胞形态、表型以及功能3个方面对其进行检测,并与骨髓来源的DC进行比较.结果:小鼠脾脏来源的DC经磷酸脂多糖(LPS)刺激成熟后其表面显示出明显的树枝状突起,高表达CD11c、CD86及MHC-Ⅱ类分子,并具有极强的刺激同种异基因淋巴细胞增殖的能力,其特征与骨髓来源的DC相差无几.结论:小鼠脾脏单个核细胞能够被诱导为具有正常形态、表型、功能的DC,为DC的功能研究以及进一步制备相应的肿瘤疫苗提供又一可靠来源.     

丹参多酚酸盐负性调节小鼠骨髓来源树突状细胞成熟及其部分免疫功能

目的:观察丹参多酚酸盐对小鼠骨髓来源树突状细胞(bone marrow-derived dendritic cells,BMDC)成熟及其部分免疫学功能的影响。方法:小鼠BMDC体外培养时加入促成熟剂脂多糖(DCLPS)或同时加入脂多糖及丹参多酚酸盐(DCSV),其中丹参多酚酸盐设3个浓度:低浓度50μg/ml(SVL)、中浓度100μg/ml(SVM)、高浓度200μg/ml(SVH)。流式细胞仪分析各组细胞表面MHC-Ⅱ分子及共刺激分子CD40、CD80、CD86的表达;FITC-Dextran内吞实验分析各组DC抗原吞噬功能;酶联免疫吸附实验(enzyme linked i mmunosorbent assay,ELISA)检测各组DC培养液上清白细胞介素(interleukin,IL)-12 p40水平。[3H]-TdR掺入法检测各组DC体外混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reactions,MLR)刺激同种反应性T细胞的增殖能力;ELISA法测定MLR上清IL-10、IL-2、干扰素(interferon,IFN)-γ水平。结果:与DCLPS相比,SVL、SVM、SVH细胞表面M...     

慢性髓系白血病来源的树突状细胞生物学特性的研究

目的:体外诱导慢性髓系白血病(CML)原代细胞分化生成树突状细胞(Dendritic cells DCs),并研究其生物学特性和功能.方法: 分离初诊13例CML患者的骨髓单个核细胞和5例正常人外周血的单个核细胞,用rhGM -CSF 1 000 U/ml、rhIL-4 500 U/ml和TNF-α50 U/ml联合培养10 d;形态学(Wright染色、倒置显微镜、透射电镜),免疫学(CD80、CD86、CD83、CD 1a、HLA-DR)鉴定,荧光原位杂交(FISH)进行细胞遗传学分析,ELISA检测分泌IL- 12的能力和混合淋巴细胞反应(MLR)检测抗原递呈功能.结果:慢性白血病细胞体外诱导后,大部分细胞呈现树突状细胞的典型形态,而且有免疫标记的明显上调(CD 86 24.49±25.87 vs 61.73±28.54;CD1a 10.41±9.52 vs 47.26±3 5.60,P<0.05);FISH证实这类DC还携带有白血病克隆,并且具有分泌IL-12和刺激T淋巴细胞增殖的能力.结论:在体外可成功地将CML细胞诱导分化成树突状细胞 ,这类DC与正常DC无论在形态学和免疫学表达方面均相似,但是功能较弱.     

脐静脉内皮细胞诱导脐血单个核细胞向树突状细胞的分化

目的探讨人脐静脉内皮细胞对人脐血单个核细胞(UBMCs)向树突状细胞(DC)分化的影响,建立更便捷、更经济体外培养DC的方法。方法胶原酶消化分离出脐静脉内皮细胞(HUVEC),经鉴定和体外培养扩增后,使其平铺生长于Tran-swell板上室底部,将UBMCs接种到Transwell小室内,同时加入EC9706细胞冻融形成的蛋白质抗原,与HUVEC共培养,使UBMCs与HUVEC紧密接触并从Transwell板上室迁移到下室,收集Transwell板下室细胞,流式细胞术检测下室细胞DC相关表面标志CD80、CD40、CD83、CD1a和MHC分子;通过MTT法检测肿瘤负载的UBDC诱导CTL对靶细胞的特异性杀伤作用。结果经HUVEC诱导并负载了肿瘤细胞抗原的DC CD80、CD40、CD83、CD1a和MHC-Ⅱ类分子表达增加,产生的细胞毒性T细胞(CTL)可特异性杀伤食管癌细胞EC9706;与细胞因子诱导DC活化的CTL对EC9706的杀伤率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论利用Transwell小室以人原代脐静脉内皮细胞诱导脐血单个核细胞分化的DC是可行的一种实验方法。