人神经生长因子基因真核细胞表达载体的构建与鉴定

目的：构建携带人神经生长因子（ｈ Ｎ Ｇ Ｆ） 基因的真核细胞表达载体,为应用 Ｎ Ｇ Ｆ 进行老年性痴呆（ Ａ Ｄ） 等疾病基因治疗打基础。方法：应用基因重组技术将ｈ Ｎ Ｇ Ｆｃ Ｄ Ｎ Ａ 克隆到逆转录病毒载体ｐ Ｌ Ｘ Ｓ Ｎ 中,用限制性内切酶酶切分析重组质粒ｐ Ｌ Ｎ Ｇ Ｆ Ｓ Ｎ 中ｈ Ｎ Ｇ Ｆ基因的插入方向,用 Ｐ Ｃ Ｒ、斑点杂交和 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交对重组质粒ｐ Ｌ Ｎ Ｇ Ｆ Ｓ Ｎ 作进一步鉴定。结果：ｈ Ｎ Ｇ Ｆｃ Ｄ Ｎ Ａ已正确地克隆到逆转录病毒载体ｐ Ｌ Ｘ Ｓ Ｎ 中,而构建成重组逆转录病毒载体ｐ Ｌ Ｎ Ｇ Ｆ Ｓ Ｎ。结论：真核细胞表达载体ｐ Ｌ Ｎ Ｇ Ｆ Ｓ Ｎ 的成功构建,为进一步开展 Ｎ Ｇ Ｆ基因治疗 Ａ Ｄ 等中枢神经系统疾病奠定了基础。     

BPI23—Fcγ1重组蛋白核表达载体的构建、表达和生物学活性的测定

目的：构建ｐＢＶ－ＢＰＩ６００－Ｆｃγ１７００重组表达载体,转化大肠杆菌ＤＨ５α,诱导表达ＢＰＩ２３－Ｆｃγ１抗菌重组蛋白。方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ技术,从ＨＬ－６０细胞和正常人白细胞ｍＲＮＡ中扩增编码ＢＰＩ２３和ＩｇＧ１Ｆｃ（Ｆｃγ１）的基因;通过连接反应构建重组克隆载体和重组表达载体;转化感受态大肠杆菌ＤＨ５α,通过温控诱导表达ＢＰＩ２３－Ｆｃγ１重组蛋白;测定ＢＰＩ２３－Ｆｃγ１重组蛋白的抗菌及免疫学活性。结果：⑴ＲＴ－ＰＣＲ获得预期的扩增产物－ＢＰＩ６００ｂｐ和Ｆｃγ１７００ｂｐ基因片段;⑵成功构建ｐＵＣ１８－ＢＰＩ１８０、ｐＵＣ１８－ＢＰＩ４２０和ｐＵＣ１８－Ｆｃγ１７００重组克隆载体,ＤＮＡ测序结果与文献报道一致;⑶成功构建ｐＢＶ－ＢＰＩ６００－Ｆｃγ１７００重组表达载体,酶切图谱分析与预期结果相符;     

强化表达分泌型酵母载体YEp5101和YEp5102的构建

采用ＰＣＲ二段扩增法，从酵母基因组中获取６３５ｂｐ完整的ＭＦα（α─ｍａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ）基因及１８０ｂｐ的ＵＡＳＰＧＫ（３─磷酸甘油酸激酶基因的上游激活序列）ＤＮＡ片段。首先，将４３０ｂｐ的ＭＦα基因启动子和信号序列与１８０ｂｐＵＡＳｐＧＫ片段分别克隆到ＰＵＣ１８载体上；然后，从含有ＭＦα基因启动子和信号序列的阳性重组子ｐＭＦα１与含有ＵＡＳＰＧＫ阳性重组子ｐＵＡＳ８质粒中，分别获得ＭＦα基因启动子和信号序列及ＵＡＳＰＧＫ片段，构建成含ＭＦα基因启动子和信号序列的表达分泌型载体ＹＥｐ５１０１及含ＭＦα启动子和信号序列与ＵＡＳＰＧＫ的强化表达分泌型载体ＹＥｐ５１０２。这两种载体可用于外源基因表达的比较研究，探讨ＵＡＳ对外源基因表达的调控作用。     

切割bcl─2RNA核酶的逆转录病毒载体的构建与鉴定

目的：构建逆转录病毒载体介导的切割ｂｃｌ－２ＲＮＡ的核酶（ＲＺ）基因真核细胞表达载体．方法：合成带有和表达载体克隆位点相匹配酶切位点的ＲＺ基因，先克隆于ｐＧＥＭ－３Ｚｆ（－）的ＨｉｎｃⅡ位点，命名为３ＺＲＺ（＋）／（－），用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧链终止法进行测序，体外转录，进行体外切割反应．ＲＺ基因酶切回收后，定向克隆于逆转录病毒载体ｐＤＯＲ－ｎｅｏ中．结果：ＲＺ基因序列正确，具有切割活性，经酶切鉴定ＲＺ基因已被克隆于ｐＤＯＲ－ｎｅｏ的ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ位点，重组逆转录病毒载体命名为ｐＤＲＺ－ＲＺ．结论：体外合成ＲＺ基因后，可定向克隆逆转录病毒载体，为细胞内合成ＲＺ提供了手段     

强化表达分泌型酵母载体YEp5101和YEp5102的构建

采用ＰＣＲ二段扩增法，从酵母基因组中获取６３５ｂｐ完整的ＭＦα（α－ｍａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）基因及１８０ｂｐ的ＵＡＳＰＧＫ（３－磷酸甘油酸激酶基因的上游激活序列）ＤＮＡ片段。首先，将４３０ｂｐ的ＭＦα基因启动子和信号序列与１８０ｂｐＵＡＳＰＧＫ片段分别克隆到ＰＵＣ１８载体上；然后，从含有ＭＦα基因启动子和信号序列的阳性重组子ｐＭＦα１与含有ＵＡＳＰＧＫ阳性重组子ｐＵＡＳ８质粒中，分别获得ＭＦα     

含HSV－tk基因的人大肠癌特异性逆转录病毒载体的构建

目的：为使自杀基因在大肠癌细胞中特异性表达，以达到靶向基因治疗的目的，首先构建以ＣＥＡ基因转录调控序列驱动的重组逆转录病毒载体。方法：将目的基因片段ＨＳＶ－ｔｋ定向克隆入ｐＵＣ１１８质粒载体中，以相应的内切酶取出合适的酶切片段后，与来自ｐＣＥＡ４２４／２ＣＡＴ质粒的ＣＥＡ５＇转录调控序列相连接，克隆入逆转录病毒载体中。结果：经鉴定及筛选，构建成重组逆转录病毒载体Ｇ１ＣＥＡｔｋＮａ。结论：Ｇ１ＣＥＡｔｋＮａ的成功构建，为进一步研究大肠癌组织特异性基因治疗奠定了基础。     

H—2K^b cDNA的克隆及其在多种真核细胞中的表达

目的 克隆Ｈ－２Ｋ＾ｂｃＤＮＡ及研究其在多种真核细胞中的表达。 方法 ＲＴ－ＰＣＲ法扩增Ｈ－２Ｋ＾ｂｃＤＮＡ,克隆入双顺反子逆转录病毒载体ｐＧＣＥＮ,ＰＡ３１７包装出重组病毒后,分别感染ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＯＳ７及ＭＭ４５Ｔ．Ｌｉ,ＰＣＲ和ＲＴ－ＰＣＲ分析目的基因表达,ＦＡＣＳ分析Ｈ－２Ｋ＾ｂ在细胞膜上的表达。结果 以双顺反子逆转录病毒载体ｐＧＣＥＮ介导,分别建立了Ｈ－２Ｋ＾ｂ基因转导细胞：ＮＩＨ３Ｔ     

rhG-CSF cDNA高表达质粒的构建及其在COS7细胞中的表达

目的：构建一个能在哺乳动物细胞中高表达人粒细胞集落刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）ｃＤＮＡ的重组质粒。方法：利用化学合成引物，进行ＰＣＲ，对人Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ５＇ＡＵＧ侧翼序列进行翻译优化突变。测序确证后，重组入表达载体ｐＥＤ，构建成质粒ｐＥＤ－ＧＣＳＦ，用ＤＥＡＥ－Ｄｅｘｔｒａｎ法转染ＣＯＳ７细胞，ＥＬＩＳＡ法定量测定ｒｈＧ－ＣＳＦ表达水平。结果：转染ＣＯＳ７细胞后４８ｈ收集的上清ｒｈＧ－ＣＳＦ表达量为５２ｎｇ／ｍｌ，７２ｈ为２３０ｎｇ／ｍｌ，显示ｒｈＧ－ＣＳＦ获得了暂时性高表达。结论：ｐＥＤ－ＧＣＳＦ是一个能在哺乳动物细胞中高效表达ｒｈＧ－ＣＳＦ的真核表达质粒。     

rhG—CSF cDNA表达质粒的构建及其在COS7细胞中的表达

目的：构建一个能在哺乳动物细胞中高表达人粒细胞集落刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）ｃＤＮＡ的重组质粒。方法：利用化学合成引物，进行ＰＣＲ，对人Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ５ＡＵＧ侧翼序列进行翻译优化突变。测序确证后，重组人表达载体ｐＥＤ，构建成质粒ＰＥＤ－ＧＣＳＦ，用ＤＥＡＥ－Ｄｅｘｔｒａｎ法转染ＣＯＳ７细胞，ＥＬＩＳＡ法定量测定ｒｈＧ－ＣＳＦ表达水平。结果：转染ＣＯＳ７细胞后４８ｈ收集的上清ｒｈＧ－ＣＳＦ表达量为５     

甲胎蛋白特异启动元件介导的肝癌靶向性基因治疗的体外实 …

目的 采用体外培养的肿瘤细胞系探讨甲胎蛋白特异启动元件介导的靶向性肝癌基因治疗。方法 将２．２ｋｂ的重组人甲胎蛋白（ＡＦＰ）基因顺式调控元件克隆于胞嘧啶脱氨酶（ＣＤ）基因的上游,构建逆转录病毒载体ＬＸ２．２ＣＤ。再以此载体和另一不含ＡＦＰ基因调控元件的逆转录病毒载体ｐＣＤ２分别转染３种肝癌细胞系和１种肺腺癌细胞系,筛选出整合ＣＤ基因的抗Ｇ４１８克隆,并进行细胞生长抑制实验。     

编码耐热邻苯二酚2,3—双加氧酶的pheB基因在大肠杆菌中的…

构建ｐｈｅＢ基因高表达菌株。研究酶的耐热机制。通过ＰＣＲ扩增方法，对位于质粒ｐＦＤＡ１３上ｐｈｅＢ基因进行扩增，克隆于ｐＵＣ１１８Ｎ和ｐＵＣ１１９Ｎ上，经双向测序，证明ＰＣＲ过程中并未发生突变，然后亚克隆于高表达载体ｐＪＬＡ５０３，转化Ｅ．ｃｌｉ ＴＧ１，经４２℃诱导，获得了高表达的基因产物，表达量占细菌总蛋白的３４．６％。     

重组TNF－α基因逆转录病毒转移系统的构建

将人ＴＮＦ－αｃＤＮＡ功能片段０．９ｋｂ克隆于逆转录病毒载体ＰＬＪ，构建成重组逆转录病毒载体ＰＬＪ－ＴＮＦ；在磷酸钙介导下，将其导入包装细胞ψＣＲＩＰ和ψＣＲＥ中，经克隆筛选，获得了病毒滴度为１０６ＣＦＵ／ｍｌ能稳定、高效分泌含ＴＮＦ－α基因重组病毒颗粒的细胞株ＰＬＪＣ－５。     

重组人促红细胞生成素cDNA在CHO-dhfr-细胞中的高效表达

目的：使重组人促红细胞生成素（ｒｈＥＰＯ）在ＣＨＯ细胞中获得高效表达。方法：利用基因重组构建了两个人促红细胞生成素ｃＤＮＡ重组表达质粒ｐＥＤ－ＥＰＯ和ｐＥＦ－ＥＰＯ，分别用ＤＥＡＥ－ｄｅｘｔｒａｎ法转染ＣＯＳ７细胞，作瞬时高表达，选ｐＥＦ－ＥＰＯ用磷酸钙共沉淀法转染ＣＨＯ－ｄｈｆｒ－细胞，加入氨甲喋呤（ＭＴＸ）扩增、选择，作稳定性高表达。结果：ｐＥＤ－ＥＰＯ和ｐＥＦ－ＥＰＯ转染ＣＯＳ７细胞后７２ｈ表达量分别为１７．８和２１．０ｎｇ／ｍｌ，ｐＥＦ－ＥＰＯ转染ＣＨＯ－ｄｈｆｒ－细胞，随着ＭＴＸ浓度的增加，ＣＨＯ－ｄｈｆｒ＋的克隆数减少，而混合克隆的ＥＰＯ表达量逐渐升高。筛选了一株稳定性高表达ｒｈＥＰＯ的细胞株，其３ｄ表达量为１６μｇ／ｍｌ。结论：ｒｈＥＰＯ在ＣＨＯ细胞中获得了高表达     

含HSV—tk基因的人大肠癌特异性逆转录病毒载体的构建

为使自杀基因在大肠癌细胞中特异性表达，以达到靶向基因治疗的目的，首先构建以ＣＥＡ基因转录调控序列驱动的重组逆转录病毒载体。将目的基因片段ＨＳＶ－ｔｋ定向克隆入ｐＵＣ１１８质粒载体中，以相应的内切酶取出原酶切片段后，与来自ｐＣＥＡ４２４／２ＣＡＴ质粒的ＣＥＡ５‘Ｌ志录调控充列相连接，克隆入逆转录病毒载体中。     

pCDM8-GFP报告载体的构建及鉴定

1　实验资料　ｐＤＭ 8 ＰＢＬｃＤＮＡ文库由Ｊａｃｋｓｏｎ博士惠赠 ,ｐＥＧＦＰ Ｎ3真核表达载体购自Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司 .ＮｏｔＩ、ＨｉｎｄⅢ和Ｔ4ＤＮＡ连接酶购自大连宝生物公司 .ＣＯＳ7细胞为本室冻存。ｐＣＤＭ8 ＧＦＰ载体的构建方法参照文献 .提取 ｐＣＤＭ8 Ｘ(Ｘ表示载体中插入的未知ｃＤＮＡ片段 )和 ｐＥＧＦＰ Ｎ3质粒 ,分别用ＮｏｔＩ和ＨｉｎｄⅢ进行双酶切 ,回收酶切片段 ,用Ｔ4连接酶进行连接 ,转化感受态宿主菌。挑单菌落培养 ,提取质粒用ＮｏｔＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切进行阳性克隆鉴定 .提取重组ｐＣＤＭ8 ＧＦＰ载…     

PDGF—B基因的膜型表达产物促进血管平滑肌细胞增殖和胶原合成

考察ＰＤＧＦ－Ｂ基因的膜型表达产物对血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣｓ）增生、胶原合成的影响。制备供转导人ＰＤＧＦ－Ｂ基因的重组逆转录病毒，感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞，受染ＮＩＨ３Ｔ３细胞经筛选、扩增后，制备细胞膜上表达产物ＰＤＧＦ－ＢＢ以观察其对ＶＳＭＣｓ生长的影响，并以３Ｈ－ＰｒｏＬｉｎｅ掺入率评估该重组蛋白对ＶＳＭＣｓ胶原合成的影响。结果：重组逆转录病毒介导ＰＤＧＦ－Ｂ基因转移并表达出具有生物学活性的重组ＰＤＧＦ－ＢＢ，免疫荧光细胞化学染色证实其表达；该膜型重组蛋白可促进ＶＳＭＣｓ增殖和胶原合成。     

切割bcl—2RNA核酶的逆转录病毒载体的构建与鉴定

构建逆转录病毒载体介导的切割ｂｃｌ－２ＲＮＡ的核酶（ＲＺ）基因真核细胞表达载体，方法：合成带有和表达载体克隆位点相匹配酶切位上的ＲＺ基因，先克隆于ｐＧＥＭ－３Ｚｆ（－）的ＨｉｎｃⅡ位点，命名为３ＺＲＺ（＋）／（－），用Ｓ ａｎｇｅｒ以脱氧链终止法进行测序，体外转录，进行体外切割反应，ＲＺ基因酶切回收后，定向克隆于逆转录病毒载体ｐＤＯＲ－ｎｅｏ中，结果：ＲＺ基因序列正确，具有切割活性，经酶切鉴定ＲＺ     

双诱导模式原核表达系统的建立与应用

将ｙＧ－ＣＳＦ ｃＤＮＡ片段克隆于Ｔ７噬菌体ＲＮＡ聚合酶启动子系统的表达载体ｐＪＧＷ１中，并与可热诱导Ｔ７ＲＮＡ聚合酶产生的质粒ｐＧＰ１－２共同转化大肠杆菌ＤＨ５α，经化学诱导或温度诱导，ｈＧ－ＣＳＦ重组蛋白表达率〉３０％，并具有特异的生物活性。     

逆转录病毒介导的TNFa基因在胶质瘤细胞系（C6）中的表达及对肿瘤细胞恶性生长的影响

利用逆转录病毒载体ＬＸＳＮ构建了含有完整编码ＴＮＦｃＤＮＡ的重组逆转录病毒质粒ｐＬＸＳＮ－ｔｎｆ，用Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ将重组质粒导入病毒包装细胞ｐＡ３１７，经Ｇ４１８筛选培养获得抗性克隆，用ＮＩＨ３Ｔ３细胞测定病毒滴度，获得滴度为５×１０５ＣＦＵ／ｍｌ的细胞克隆。利用病毒上清液感染大鼠胶质瘤细胞系Ｃ６，得到Ｇ４１８抗性克隆细胞Ｃ６ｐＬＸＳＮ－ｔｎｆ，经ＰＣＲ检测，ＴＮＦｃＤＮＡ完整地整合在细胞基因组中。测定Ｃ６ｐＬＸＳＮ－ｔｎｆ细胞上清中ＴＮＦ的生物活性，结果显示ＴＮＦ有相对稳定的表达（４８～１８０Ｕ／ｍｌ１０６ｃｅｌｌｓ／２４ｈ）。实验还显示经ＴＮＦ基因转导的Ｃ６ｐＬＸＳＮ－ｔｎｆ细胞生长速度较之亲本肿瘤细胞Ｃ６明显下降，基因修饰后的肿瘤细胞在Ｗｉｓｔａｒ大鼠体内形成肿瘤的能力明显受到抑制。进一步用超离心法浓缩病毒对胶质瘤移植模型进行了体内治疗研究。     

小鼠GM─CSFcDNA重组逆转录病毒的构建及在成纤维细胞中的表达

为探索粒－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）基因治疗的可能性，将小鼠ＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ重组于缺陷型逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ中，重组质粒转染病毒包装细胞ＰＡ３１７，经Ｇ４１８筛选，用其抗性克隆培养上清液感染小鼠成纤维细胞ＮＩＨ３Ｔ３，筛选出抗Ｇ４１８的转化细胞克隆，用ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证明转化细胞的基因组中整合有ＮｅｏＲ基因和ＧＭ－ＣＳＦ基因，原位杂交显示转化细胞有较强的ＧＭ－ＣＳＦｍＲＮＡ表达，用骨髓细胞增殖法和ＣＦＵ－ＧＭ检测也表明转化细胞分泌有较多的ＧＭ－ＣＳＦ，该研究为下一步在动物体内进行ＧＭ－ＣＳＦ基因治疗的研究奠定基础