特异性切割大鼠c—myc癌基因mRNA核酶的设计

核酸(ribozyme)为具有催化活性的RNA分子,能序列特异性地切割靶RNA.与传统的蛋白质酶所不同的是,核酶通过两侧的引导序列与底物以碱基互补形成杂交链,具有更高的底物特异性;核酶切割完靶RNA后即从杂交链上解离下来,可对新的靶RNA进行切割.因此,核酸成为近年来基因治疗的一种新方法.锤头状核酶具有分子小、设计简单、易于合成的特点,人们对核酸在基因治疗中作用的研究大部分是采用锤头状核酸.我们以Forster等总结的由13个保守碱基和3个螺旋区组成的锤头状核酸为模型,选择大鼠c-myc癌基因mRNA为靶RNA,在计算机辅助下设计了能特异性切割大鼠c-myc癌基因mRNA的核酸.     

c—erbB—2特异性核酶基因体外转录载体的构建与快速鉴定

构建ｃ－ｅｒｂＢ－２特异性的核酶基因及其靶基因的体外转录载体并探讨快速简便的筛选方法；在原设计的核酶ＲＺ１基因的３‘端加上新的限制性酶切位点ＥｃｐＲＶ，合成修饰后的ＲＺ１基因并将之定向克隆于载体ｐＧＥＭ３Ｚｆ，经用ＥｃｏＲＶ正筛选和ＸｂａＩ负筛选鉴定出重组子并测定鉴定。     

睑板腺癌nm23基因mRNA和c—myc基因的表达

目的：探讨nm323和c-myc基因表达与睑板腺癌生物学行为的关系。方法：采用原位杂交技术和免疫组化SABC法对33例睑板腺癌石蜡切片中睑板腺癌nm323和c-myc基因的表达进行研究。结果：睑板腺癌睑板腺癌nm23基因mRNA阳性表达率为48．5％（16／33）,c-myc基因阳性表达率为54．5％（18／33）。Ⅱ-Ⅲ度睑板腺癌睑板腺癌nm23基因mRNA阳性率为63．6％（14／22）,Ⅰ度为18．2％（2／11）,二者比较P＜0．05,中、低分化睑板腺癌nm23基因mRNA阳性表达率为60．95（14／23）,高分化癌nm23基因mRNA阳性率为20％（2／10）,P＜0．05。Ⅱ-Ⅲ度睑板腺癌c-myc基因阳性表达率为（68．2％）（15／22）,Ⅰ度为27．3％（3／11）,P＜0．05）;中低分化睑板腺癌c-myc基因阳性表达率为69．6％（16／23）,高分化癌为20％（2／10）,P＜0．05。nm23基因c-myc基因表 关性检验,P＞0．05。结论：睑板腺癌nm23和c-myc基因与睑板腺癌的发生、发展有关,与睑板腺癌分化程度密切相关,可能是判断其恶性程度的指标之一。     

c-myc基因核酶对靶mRNA的切割作用

目的：构建c—myc基因核酶及其靶mRNA的体外转录载体，探讨核酶对靶mRNA的体外切割作用。方法：通过计算机分析c—myc基因mRNA的二级结构，设计核酶基因序列，采用DNA合成仪合成核酶基因，以克隆技术将核酶基因构建入pGEM3Zf( )体外转录载体，将大鼠c—myc基因第2外显子及部分第3外显子的基因片段克隆入pGEM7Zf(-)体外转录载体，分别进行体外转录获得核酶及靶mRNA。在含有Mg^2 的反应体系中，进行核酶对靶mRNA的体外切割反应。结果：经限制性内切酶酶切鉴定，核酶基因准确克隆入pGEM3Zf( )载体，经DNA自动序列分析仪测序分析，大鼠c—myc基因第2外显子及部分第3外显子的基因片段准确克隆入pGEM7Zf(-)载体。核酶对靶mRNA的体外切割活性约为64．5％。结论：该核酶具有切割靶mRNA的活性，可进一步用于细胞内和体内研究。     

大鼠脑损伤时神经细胞c—fos,c—jun和c—myc基因表达变化

目的 观察大鼠脑损伤不同时间皮质神经细胞早期快反应基因ｃ－ｆｏｓ、ｃ－ｊｕｎ、ｃ－ｍｙｃ表达变化。方法 应用 Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交、原位杂交和免疫组织化学方法检测皮质神经细胞中ｃ－ｆｏｓ、ｃ－ｊｕｎ、ｃ－ｍｙｃ的表达。结果 脑损伤后１５ｍｉｎ,伤测皮质神经细胞出现上述３种基因ｍＲＮＡ的表达,随时间的延长,表达逐渐增加,于伤后３ｈ达高峰并持续至伤后２５ｈ伤后,伤后７２ｈ恢复至对照水平ｃ－ｆｏｓ、ｃ－     

c-myc基因mRNA核酶对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的：构建特异性切割c-myc基因mRNA的锤头状核酶（Ribozyme)真核表达载体。探讨核酶对血管平滑肌细胞（VSMCs)增殖的影响。方法：计算机分析大鼠c-myc基因mRNA的二级结构，选择第2029位点作为锤头状核酶的切割位点并设计相应的核酶。采用DNA合成仪合成核酶基因，以克隆技术将核酶基因构建人pGEM3Zf( )体外转录载体，以Sanger双脱氧末端终止法测定核酶基因的序列后，通过亚克隆将核酶基因构建入pcDNA3真核表达载体；核酶真核表达载体以阳离子脂质体LipofectAMINE作为介导，转染体外培养的第5代SD大鼠VSMCs，经G418筛选出细胞克隆，流式细胞仪测定VSMCs的细胞周期。结果：核酶基因准确克隆入pGEM3Zf( )载体，DNA序列测定表明所克隆入的核酶基因序列正确；经过亚克隆将核酶基因准确克隆入pcDNA3载体（pcDNA-Rz);pcDNA-Rz转染VSMCs经G418筛选出多个抗性细胞克隆，扩大培养获得转染细胞；细胞周期分析显示，pcDNA-Rz转染细胞的细胞周期有明显变化，S期和G2/M期比率明显减少，细胞生长阻滞于G0/G1期，细胞增殖指数明显降低。结论：特异性切割c-myc基因mRNA核酶对体外培养VSMCs的增殖具有明显的抑制作用。     

肾癌c—myc部基因产物p62的表达与临床意义

采用ABC法免疫组化技术，检测8例正常肾组织，46例肾癌石蜡包埋标本中p62的表达，并用显微分光光度计测得每例肾癌标本p62的表达强度。结果发现正常肾组织标本中p62染色阴性，46例肾癌标本中29例p62染色阳性p62的表达位于细胞核内，p62的表达强度与肾癌的病理分级，临床分期呈正相关。与预后呈负相关。     

维甲酸对大鼠胃粘膜癌变DNA含量,c—myc基因mRNA表达及细胞凋亡的影响

目的：研究维甲酸对大鼠胃粘膜癌变DNA含量,c-myc基因mRNA表达及细胞凋亡的影响。方法：采用MNNG,酒精及10％NaCl混合液建立大鼠胃癌模型,设立正常空白组,模型组及维甲酸治疗组,分别采用Feulgen染色,原位杂交及TUNEL法检测大鼠胃粘膜NDA含量,c-myc基因表达及细胞凋亡。结果。治疗组癌变发生率低于模型组,c-myc基因mRNA表达与细胞凋亡受抑制和胃粘膜癌变的发生,呈递增趋势,并且两者具有一定的相关性。结论：维甲酸抗癌,下调c-myc基因表达,促进细胞凋亡是其重要机制之一。     

卵巢恶性肿瘤细胞端粒酶表达和hTERT基因，c—myc基因的调控

目的　研究端粒 (TL M)在卵巢恶性肿瘤中的表达和相互关系。　方法　 (1)采用 PCR- EL ISA半定量方法研究端粒酶活性在卵巢恶性肿瘤、癌旁组织、交界性肿瘤、良性肿瘤、正常卵巢及卵巢肿瘤细胞株的表达情况。(2 )采用 RT- PCR方法检测人端粒酶逆转录酶 (h TERT)基因 m RNA和 c- myc基因m RNA在上述标本中的表达情况 ,分析端粒酶活性、h TERT基因、c- myc基因间的关系。(3)用顺铂对卵巢肿瘤细胞株 HO-8910、COC1 进行处理 ,同步检测 h TERT和 c- myc基因 m R-NA、端粒酶活性表达情况 ,分析 h TERT和 c- myc基因 m R-NA水平改变与端粒酶活性的相互影响。　结果　 (1)卵巢良性肿瘤组织与正常卵巢端粒酶活性差别无显著性 (P>0 .0 5 ) ,正常卵巢端粒酶活性 0 .2 2为上限 (0 .2 13± 0 .0 70 ,可信区间97.5 % ) ,恶性卵巢肿瘤组织端粒酶活性表达率 91.30 % ,明显高于交界性卵巢肿瘤组织 2 0 .0 0 % (P<0 .0 1)、良性卵巢肿瘤组织 7.13% (P<0 .0 1)和正常卵巢 0 (P<0 .0 1)。交界性卵巢肿瘤组织端粒酶活性表达率与后两者差异具有显著性 (P<0 .0 1)。端粒酶活性值在恶性卵巢肿瘤组织表达中临床分期 、 期明显高于 、 期 (P<0 .0 5 ) ,分化程度低者高于分化高者 (P<0 .0 5 ) ,恶性卵巢肿瘤组织端粒酶活性明显高     

胰岛素对血管平滑肌细胞增殖及原癌基因c－fos，c－myc异常表达的实验研究

我们观察了不同浓度的胰岛素对体外培养人血管平滑肌细胞增殖的影响，及其该过程中原癌基因ｃ－ｆｏｓ，ｃ－ｍｙｃ的表达。结果表明，胰岛素能促进血管平滑肌细胞（ＳＭＣ）增殖，即：ＳＭＣ数目的增多，ＳＭＣＤＮＡ的合成；胰岛素能促进原癌基因ｃ－ｆｏｓ和ｃ－ｍｙｃ的异常表达；且以上作用均存在着剂量－效应关系。这些结果提示，高胰岛素血症促进动脉粥样硬化（ＡＳ）发生、发展可能是通过促进某些原癌基因异常表达，进而促进ＳＭＣ增殖而实现的。这也许是某些基因治疗ＡＳ的基础。     

针对bcl─2RNA核酶体外切割反应的琼脂糖凝胶电泳

目的：用琼脂糖凝胶电泳检测体外ｂｃｌ┐２ｃＤＮＡ和ＲＺＤＮＡ转录物与鉴定核酸的体外切割活性．方法：琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳．结果：琼脂糖凝胶电泳可见核酶和ｂｃｌ－２ＲＮＡ转录物及其切割ｂｃｌ－２ＲＮＡ后的产物．结论：琼脂糖凝胶电泳是一种可用于外转录物与初步鉴定核酸切割活性的简便方法     

应用PCR检测HL－60细胞诱导分化前后c－myc癌基因的扩增

应用ＰＣＲ方法研究了维甲酸（ＲＡ）和二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）诱导ＨＬ－６０细胞分化过程中ｃ－ｍｙｃ基因扩增的变化。结果：ＨＬ－６０细胞内ｃ－ｍｙｃ基因扩增为１１，经ＲＡ诱导６ｄ后，其扩增程度无明显变化，而ＤＭＳＯ诱导３ｄ后，ｃ－ｍｙｃ基因扩增出现下降，至５ｄ，较未诱导分化前下降约３０％。提示了ＲＡ和ＤＭＳＯ对ＨＬ－６０细胞不同的诱导分化机制。     

致敏豚鼠气道及肺组织c—myc基因的表达与哮喘发病的关系

研究原癌基因在哮喘发病中的作用。方法以卵蛋白致敏诱发豚鼠哮喘建立实验模型。用分子杂交技术分别观察正常及哮喘发作后ｃ－ｍｙｃ在豚鼠气道及肺组织中的表达水平。结果：原癌基因ｃ－ｍｙｃ在豚鼠哮喘发作后即刻表达增强，且呈时间依赖关系，并可被糖皮质激素部分抑制。     

Comparison of cleavage activity in vitro between two ribozymes targeted against different sites of PDGF receptor β subunit

Objective: To compare the cleavage activity of ribozymes directed against 2 sites of PDGF receptorP subunit cDNA gene in vitro. Methods: The 608 bp fragment of PDGF receptor β subunit cDNA was clonedinto T-vector under the control of T7 promoter, named pPDGFR-β. Two ribozymes were designed to cleavethe CUU sequence at codon 45 and codon 252 of PDGF receptor β subunit mRNA respectively. These 2 ham-merhead ribozyme genes were cloned into vector PI. 5 between 5' -cis ribozyme and 3' -cis ribozyme to gener-ate the plasmids of pRZ1 and pRZ2. The pPDGFR-β, pRZl and pRZ2 were linearized and then transcribedwith T7 promoter in vitro. Results: The RZ1 showed high cleavage activity in vitro, but the RZ2 showed nocleavage activity under the same condition. Conclusion: The cleavage site selection is an important factor in-fluencing the cleavage activities of ribozymes.     

骨骼肌肿瘤中c—myc癌基因的改变及其预后意义

探讨ｃ－ｍｙｃ癌基因在骨骼肌肿瘤中的改变及其预后意义。方法，运用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和ＲＮＡ打点杂交技术分析１８例骨骼肌肿瘤及相对应瘤组织中ｃ－ｍｙｃ癌基因的发迹并对术后患者进行３年随访。结论：ｃ－ｍｙｃ癌基因以扩增，重排及高表达方式参与骨骼肌肿瘤的发生发展，检测有无ｃ－ｍｙｃ癌基因的异常可辅助判断骨骼肌肿瘤的预后。     

Bcl-2、c-myc与胃癌细胞凋亡的关系

目的：探讨癌基因Ｂｃｌ ２、ｃ ｍｙｃ对细胞凋亡的影响。方法：用免疫组化ＬＳＡＢ法检测两者在６０例胃癌中的表达，并在光镜下对受检组织ＨＥ片进行凋亡细胞计数。结果：Ｂｃｌ ２、阳性胃癌的细胞凋亡指数明显低于阴性胃癌（０４１±０２９比０．８６±０．５１，Ｐ＜００５），ｃ ｍｙｃ阳性组织较阴性组织有更高的凋亡指数（０７１±０．３１比０．３２±０．２０，Ｐ＜００５）。结论：Ｂｃｌ ２与ｃ ｍｙｃ对胃癌细胞凋亡有相反的调控作用。     

VP-16诱导PC-3细胞凋亡和bcl-2及c-myc基因表达的研究

目的　研究 VP- 1 6诱导 PC- 3细胞凋亡和癌基因 bcl- 2及 C- myc表达的关系。方法　用末端标记法(TUNEL )和流式细胞术 (FCM)研究 PC- 3细胞凋亡 ,以免疫组化方法研究 bcl- 2及 C- myc蛋白的表达。结果　 TUNEL和FCM检测表明 ,PC- 3细胞的凋亡率随 VP- 1 6作用浓度增加和作用时间延长而升高 ;免疫组化结果显示 :bcl- 2和 c- myc基因表达的阳性百分率随 VP- 1 6作用浓度增加和作用时间延长而降低。结论　VP- 1 6能够诱导 PC- 3细胞凋亡和抑制其bcl- 2和 c- myc基因的表达 ,且具有作用浓度和作用时间依赖性。