核酶在肿瘤基因治疗中的应用

核酶(ribozyme)是一类具有核酸内切酶活性的RNA分子，可特异性地与靶RNA序列结合并加以切割，人工设计合适的核酶可实现对失控基因或有害基因表达的有效阻断，从而对疾病进行基因治疗。本文对核酶的结构与作用原理及核酶在肿瘤基因治疗中的应用作一综述。     

血管内皮生长因子165核酶的合成及其体外活性

目的 探讨抗血管内皮生长因子165（VEGF165）核酶的设计合成及其生物学活性。方法 利用计算机辅助设计针对VEGF165的锤头状核酶，构建核酶的自剪切转录载体pGEMRz212，体外转录合成核酶Rz212及其相应的底物VEGF165mRNA，在无细胞体系中观察核酶对靶RNA的切割作用。结果 构建的自剪切转录载体在转录的过程中发生了自身剪切，并释放出目的核酶Rz212，该核酶具有切割VEGF165 mRNA的作用。结论 计算机辅助设计的VEGF165锤头状核酶体外可有效切割靶RNA，具有较高的生物活性。     

核酶在抗病毒基因治疗中的设计策略

核酶 (ribozyme)是一类具有催化活性的RNA分子 ,可通过碱基配对特异地与相应的RNA底物结合 ,并在特定的位点切割底物RNA分子。自美国科学家Cech和Altman等发现核酶至今的 2 0多年来 ,人们利用核酶可以特异性地切割靶RNA序列的特点 ,通过设计合适的核酶阻断特定基因的表达 ,已相     

抗人组织金属蛋白酶抑制剂1的核酶高表达载体的构建及体外活性鉴定

目的:构建特异性切割人组织金属蛋白酶抑制剂1(tissue inhibitor of metalloproteinases1,TIMP-1)的锤头状核酶的真核表达载体并在体外进行活性鉴定,为应用于瘢痕基因治疗奠定基础.方法:设计并合成针对人组织TIMP-1 mRNA的锤头状核酶基因Rz182、Rz358和Rz412及相应的点突变核酶基因,将核酶基因克隆于可在体内高表达核酶的载体pBSKneoU6中,制备嵌合于U6 snRNA分子的核酶基因克隆.逆转录聚合酶链式反应获得全长TIMP-1 mRNA基因片段并克隆至T载体.体外转录法大量制备以α-32P UTP 标记的核酶及靶RNA,进行体外切割实验.结果:核酶基因克隆制备正确,在体外成功转录出嵌合于U6 snRNA的核酶和靶RNA. 37℃的生理温度下,U6Rz182和U6Rz358成功切割了靶RNA,U6Rz182切割效率为49.23%,Km=29.7 nmol/L,Kcat=0.32 min-1.U6Rz358切割效率为55.21%.Km=39.6 nmol/L,Kcat=0.21 min-1.U6Rz412及突变核酶均未显示切割活性.结论:本研究中制备的U6Rz182和U6Rz358有良好的特异催化切割活性,有望在瘢痕成纤维细胞内抑制人TIMP-1的表达,成为新的抗瘢痕核酸药物.     

抗c—erbB—2 ribozyme的计算机设计

设计能特异性切割人癌基因ｃ－ｅｒｂＢ－２ｍＲＮＡ的核酶。概据Ｓｙｍｏｎｘ的“猛士锤头结构”,以人癌基因ｃ－ｅｒｂＢ－２ｍＲＮＡ为靶ＲＮＡ,用计算机对其可能为核酶切割的位点进行分析以寻找最佳切点。对底物及核酶的二级结构进行预测。     

抗肿瘤多药抗性核酶转录质粒的构建及其体外切割研究

目的 探讨体外核酶对肿瘤多药抗性相关基因mdr1靶RNA分子的切割作用及其影响因素。方法 利用计算机软件设计能特异切割mdr1 mRNA的锤头状核酶（ribozyme）,并构建抗mdr1-ribozyme和靶分子的体外转录质粒,进行体外切割实验。结果 发现抗mdr1-ribozyme能较好地切割mdr1 mRNA。 结论 抗肿瘤多药抗性核酶的体外研究为其体内应用提供了参考,ribozyme有可能成为逆转肿瘤多药抗性的新药物。     

丁型肝炎病毒核酶在分子水平对丙型肝炎病毒RNA的反式剪切活性

锤头状核酶(hammerhead ribozyme)和发夹状核酶(hairpin ribozyme)能特异性定点剪切靶RNA分子,可用于抗病毒、抗肿瘤等基因治疗［1］。但假结样核酶（pseudoknot ribozyme）,如丁型肝炎病毒（HDV）核酶,包括基因组核酶（genomic ribozyme）和抗基因组核酶（antigenomic ribozyme）,是否具有抗病毒等活性,迄今研究鲜见［2］。本研究旨在评价基因组核酶对丙型肝炎病毒（HCV）RNA在分子水平的剪切活性。     

c-myc基因mRNA核酶对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的：构建特异性切割c-myc基因mRNA的锤头状核酶（Ribozyme)真核表达载体。探讨核酶对血管平滑肌细胞（VSMCs)增殖的影响。方法：计算机分析大鼠c-myc基因mRNA的二级结构，选择第2029位点作为锤头状核酶的切割位点并设计相应的核酶。采用DNA合成仪合成核酶基因，以克隆技术将核酶基因构建人pGEM3Zf( )体外转录载体，以Sanger双脱氧末端终止法测定核酶基因的序列后，通过亚克隆将核酶基因构建入pcDNA3真核表达载体；核酶真核表达载体以阳离子脂质体LipofectAMINE作为介导，转染体外培养的第5代SD大鼠VSMCs，经G418筛选出细胞克隆，流式细胞仪测定VSMCs的细胞周期。结果：核酶基因准确克隆入pGEM3Zf( )载体，DNA序列测定表明所克隆入的核酶基因序列正确；经过亚克隆将核酶基因准确克隆入pcDNA3载体（pcDNA-Rz);pcDNA-Rz转染VSMCs经G418筛选出多个抗性细胞克隆，扩大培养获得转染细胞；细胞周期分析显示，pcDNA-Rz转染细胞的细胞周期有明显变化，S期和G2/M期比率明显减少，细胞生长阻滞于G0/G1期，细胞增殖指数明显降低。结论：特异性切割c-myc基因mRNA核酶对体外培养VSMCs的增殖具有明显的抑制作用。     

抗HIF-1αmRNA锤头状核酶设计及其基因克隆

目的 设计一个抗缺氧诱导因子1α(HIF-1α)mRNA的锤头状核酶，并构建它的基因表达载体，以便用于肿瘤的基因治疗。方法 用RNA结构分析软件预测HIF-1α mRNA的二级结构并选择合适的核酶作用靶点，以选定的靶点设计相应的锤头状核酶，合成编码核酶的DNA并克隆到载体pSP72上，酶切及DNA测序鉴定核酶序列。结果 HIF-1α mRNA的72位含有GUC三联体，可以作为核酶的切割靶点，设计的核酶包括22nt的催化活性中心和16nt的侧翼序列。计算机辅助预测证明此位点为合适的靶点，限制性内切酶和DNA测序证实核酶基因正确插入载体pSP72上。结论 成功设计并构建抗HIF-1α mRNA锤头状核酶基因表达载体，为进一步运用核酶切割HIF-1α mRNA基因，从而抑制肿瘤生长提供了必要条件。     

c-myc脱氧核酶对白血病细胞端粒酶活性的抑制作用

目的:探讨c-myc脱氧核酶的切割作用及对白血病细胞端粒酶活性的影响.方法:合成针对c-myc mRNA的"10～23"型脱氧核酶DzMycI及其类似物DzMycI'提取总RNA在细胞外切割c-myc mRNA;转染白血病细胞系HL-60后,用RT-PCR扩增c-myc基因片段和端粒酶蛋白亚基hTERT的片段,用PCR-ELISA法测定端粒酶活性.结果:脱氧核酶DzMyel在细胞外和细胞内均能够有效地切割c-myc mRNA;在转染HL-60后,DzMycI显著抑制白血病细胞生长(P<0.05),下调端粒酶蛋白亚基hTERT的表达,显著降低HL-60细胞端粒酶活性(P<0.05).DzMycI催化中心的一个碱基被替换后形成的脱氧寡核苷酸DzMycI'在胞外和胞内均不表现对c-myc mRNA的切割作用.结论:脱氧核酶DzMycI确实能够高效特异地切割c-myc mRNA,降低白血病细胞端粒酶活性,抑制白血病细胞生长,有可能作为c-myc抑制剂用于白血病的基因治疗领域中.     

锤头状核酶对大鼠肺动脉平滑肌NHE-1活性的影响

目的 探讨锤头状核酶对大鼠肺动脉平滑肌细胞Na^ /H^ 交换器（NHE）-1表达和活性，pHi的影响。方法 构建含锤头状核酶序列的pLXSN反转录病毒重组载体，将其转染体外培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞，G418筛选后获取含有重组载体的细胞克隆。检测细胞NHE-1mRNA表达，pHi和Na^ /H^ 交换活性变化。结果 与转染pLXSN空载体的细胞和正常对照组细胞比较，转染了重组载体的肺动脉平滑肌细胞中NHE-1mRNA表达减少，Na^ /H^ 交换活性降低，同时伴有pHi降低。结论 所设计的锤头状核酶可对NHE-1mRNA进行特异性切割，减少其表达，使其活性下降，从而诱导细胞酸化。     

核酶抗病毒和抗肿瘤作用的研究进展

核酶是一类具有酶活性的RNA分子，可序列特异性定点地切割靶RNA，从而在分子水平实现对失控基因或有害基因表达的有效阻断。文章就近几年来核酶在抗病毒、抗肿瘤治疗中的应用进行简要介绍。     

丁型肝炎病毒核酶在分子水平对丙型肝炎病毒RNA的反式煎切活性

锤头状核酶 (ｈａｍｍｅｒｈｅａｄｒｉｂｏｚｙｍｅ)和发夹状核酶 (ｈａｉｒｐｉｎｒｉｂｏｚｙｍｅ)能特异性定点剪切靶ＲＮＡ分子 ,可用于抗病毒、抗肿瘤等基因治疗[1] 。但假结样核酶 (ｐｓｅｕｄｏｋｎｏｔｒｉｂｏｚｙｍｅ) ,如丁型肝炎病毒 (ＨＤＶ )核酶 ,包括基因组核酶 (ｇｅｎｏｍｉｃｒｉｂｏｚｙｍｅ)和抗基因组核酶 (ａｎｔｉｇｅｎｏｍｉｃｒｉｂｏｚｙｍｅ) ,是否具有抗病毒等活性 ,迄今研究鲜见[2 ] 。本研究旨在评价基因组核酶对丙型肝炎病毒 (ＨＣＶ)ＲＮＡ在分子水平的剪切活性。一、材料与方法1.核酶ｃＤＮＡ及引物由…     

人类核糖核酸酶P的研究进展

人类核糖核酸酶P是具有酶活性的核糖核蛋白复合体。根据靶RNA设计的外部引导序列（EGS）能与靶RNA碱基互补结合，形成类似前体tRNA的二级结构，从而引导人类核糖核酸酶 P对靶RNA进行特异切割。因此，基于人类核糖核酸酶P的EGS技术能在mRNA水平抑制病毒及肿瘤靶基因的表达，在抗肿瘤、抗病毒等基因治疗领域具有广阔的应用前景。     

反义寡核苷酸技术研究进展

反义寡核酸技术，是应用反义寡核苷酸类药物通过Waston-Crick碱基配对与细胞内核酸（DNA或RNA）特异结合形成杂交分子，从而在转录和翻译水平抑制特定基因表达的基因治疗技术，是一种新的药物开发方法。其机制是：①反义寡核苷酸与靶mRNA结合形成DNA-RNA杂合分子，可以激活RNase H。该酶可以切割杂合分子中的RNA链，导致靶mRNA降解。②不能激活RNase H活性的反义寡核苷酸可以通过空间位阻效应阻止核糖体结合来抑制靶mRNA的翻译：另外还可以通过封闭剪接位点有选择的促进蛋白某个可变剪接体的表达，从而纠正错误的剪接。     

核酶切割per基因所致的缓解吗啡成瘾作用研究

目的：探讨per基因与阿片类成瘾的相关性，进而寻找治疗阿片成瘾的基因戒毒疗法。方法：设计并合成特异性per锤头状核酶基因和per核酶靶mRNA组分基因，并分别重组人体外转录质粒，而后将经体外转录反应得到per核酶RNA和地高辛标记的per核酶靶mRNA组分。将转录产物混合，在不同条件下进行体外切割反应后，采用地高辛化学发光法检测per核酶的体外切割效率。小鼠脑室注射直接导入脂质体包裹的重组质粒pcDNA 3.1-per RZ DNA，按剂量递增法建立吗啡依赖动物模型，用纳洛酮催瘾，观察戒断反应的变化。结果：per核酶对per核酶靶mRNA组分的体外切割效率达到60％。重组质粒组小鼠的刻板跳跃、“湿狗”样抖动和打洞次数与空质粒组、生理盐水组相比明显减少，但并不抑制小鼠的体重下降。结论：per核酶具有体外定点切割per基因mRNA组分的活性。经小鼠吗啡成瘾模型检测，该重组质粒能成功转染活体小鼠脑细胞并在脑组织内稳定表达per核酶，发挥阻断per基因表达的作用，有效地减轻吗啡成瘾的戒断症状。     

10-23脱氧核酶对新生大鼠心肌细胞ET-1mRNA表达的影响

目的:将体外筛选具有切割内皮素-1(endothelin-1,ET-1)mRNA的10-23脱氧核酶转染原代培养新生大鼠心肌细胞,观察其对心肌细胞ET-1 mRNA的影响.方法:体外转录ET-1全长RNA底物,设计并合成5条ET-1 10-23脱氧核酶(DZ1～DZ5),其5‘及3‘端各有2个核苷酸硫代修饰,体外切割ET-1 RNA底物,筛选有效脱氧核酶;5‘标记荧光素FAM的10-23脱氧核酶瞬间转染新生大鼠心肌细胞以观察对10-23脱氧核酶的摄取;采用半定量RT-PCR检测ET-1基因的表达.结果:DZ2、DZ3、DZ4及DZ5在体外均可切割RNA底物,其中DZ4两侧结合区结合自由能之差最大,其切割效率最高,达83.5%,而DZ3两侧结合区结合自由能之差最小,其切割效率亦最低(47.3%);瞬间转染新生大鼠心肌细胞24h,心肌细胞内可见10-23脱氧核酶的分布,半定量RT-PCR结果显示转染24h后的DZ4(0.2μmol/L)可减少血清诱导肥大心肌细胞ET-1mRNA及细胞总蛋白,降低细胞活力与蛋白质合成速率(P＜0.05).结论:本研究设计的10-23脱氧核酶能切割体外转录的ET-1全长RNA底物,转染心肌细胞后,可抑制ET-1 mRNA的表达,减缓血清诱导心肌细胞肥大,10-23脱氧核酶两侧结合区自由能的差值与切割效率有关.     

“10～23”型脱氧核酶的研究进展

脱氧核酶是利用体外分子进化技术获得的一种具有酶活性的单链DNA分子。迄今为止，利用该技术已筛选出多种具有催化功能的脱氧核酶分子，其中研究最多的是具有RNA切割活性的脱氧核酶，尤其是10～23型脱氧核酶，该酶能催化RNA特定部位的切割反应，从mRNA水平使基因灭活，从而调控蛋白质的表达，在抗肿瘤、抗病毒等基因治疗领域具有广阔的应用前景。     

核酶及突变核酶在体外对HBV mRNA的切割作用

目的：探讨多位点核酶对乙型肝炎病毒（HBV）信使核糖核酸（mRNA)的切割作用，以及保守碱基突变后对切割活性的影响。方法：利用计算机辅助设计针对HBV C区基因的多位点核酶及保守碱基突变的双位点核酶，构建多位点核酶及双位点突变核酶的自剪切载体（pGEMRz123,pGEMmRz12)，观察核酶及突变核酶对RNA的切割作用。结果：构建后的多位点串联核酶及突变核酶的自剪切转录载体在体外转录后，其顺式核酶可发生自剪切，并可将目的的核酶释放出来。多位点核酶对HBV mRNA有明确的切割作用，而保守碱基突变后对HBV mRNA则无切割作用。结果 ：抗HBV多位点酶在体外可明确切割HBV靶RNA，突变后的核酶无切割活性，保守碱基为核酶保持活性所必需。     

核酶对大鼠肺动脉平滑肌NHE-1活性及细胞增殖的作用

目的 探讨锤头状核酶对大鼠肺动脉平滑肌细胞Na^ /H^ ’交换器-1表达和活性、pHi的影响，及其与细胞增殖的关系.方法 构建含锤头状核酶序列的pLXSN反转录病毒重组载体，将其转染体外培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞，G418筛选后获取含有重组载体的细胞克隆。检测细胞NHE-1mRNA表达、PHi、pHi恢复速率、^22Na摄取量和^3H—TdR掺入量变化.结果 与转染pLXSN空载体的细胞和正常对照组细胞比较，转染了重组载体的肺动脉平滑肌细胞中NHE—1 mRNA表达、^22Na摄取量减少，同时伴有pHi降低、pHi恢复速率下降和^3H—TdR掺入量减少。结论 所设计的锤头状核酶可对NHE—1mRNA进行特异性切割，减少其表达，使其活性下降，从而诱导细胞酸化，抑制肺动脉平滑肌细胞增殖。