胎鼠大脑皮质神经元的分离培养和鉴定

目的探讨胎鼠皮质神经元分离和培养的方法,并对分离得到的细胞进行鉴定。方法分离17d胎鼠大脑皮质,切碎后经0.3%胰蛋白酶和DNaseI消化得到细胞悬液,用含N1添加剂和10%胎牛血清的MEM培养基进行培养,相差显微镜下观察神经元的生长情况。培养第3和6d以微管相关蛋白-2(MAP-2)和神经元核心抗原(NeuN)为标志物,用免疫细胞化学的方法对分离培养的细胞进行鉴定。结果培养第5~6h时神经元已贴壁,长出数个小突起,培养第3d可见突起增多、延长,培养第6d细胞突起明显延长,相邻细胞的突起交错形成网络;培养第3dMAP2免疫反应阳性细胞率(87.5±3.5)%,与培养第6d的阳性细胞率(90.2±5.1)%无明显差异(P>0.05);培养第3dNeuN免疫反应阳性细胞率(92.4±2.7)%,与培养第6d的阳性细胞率(88.7±4.6)%无明显差异(P>0.05)。结论本方法分离培养的神经元纯度高,在含N1的完全培养基中培养神经元存活状态良好,未见胶质细胞明显增生。     

阿魏酸及其酯化产物与体外培养大鼠大脑皮质神经元的存活

背景：大量体外筛选中得到的中药脑神经保护活性成分,多因脂溶性低难以透过血脑屏障而限制了其临床应用。 目的：比较阿魏酸及其酯化产物阿魏酸甲酯、乙酯对原代培养的大鼠大脑皮质神经元体外存活的保护作用。 方法：出生1 d内的乳鼠采用酶消化法分离培养大脑皮质神经元。培养6 d后,分别进行阿魏酸、阿魏酸甲酯及乙酯干预,继续培养1 d。 结果与结论：形态学观察结果显示细胞生长良好,NSE染色检查表明培养6 d的存活细胞大部分均为神经元。MTT比色法测量结果显示,与空白对照组比较,阿魏酸仅在质量浓度为200 mg/L时有明显促进大脑皮质神经元存活的作用,而阿魏酸甲酯、乙酯在质量浓度为0.16~20 mg/L时均能明显促进神经元体外存活,且作用趋势、作用强度相近。表明阿魏酸的酯化产物阿魏酸甲酯和阿魏酸乙酯均能促进原代培养的大脑皮质神经元体外存活,显示出较好的脑神经元保护作用,且活性比阿魏酸更强。     

原代培养的皮质神经元缺血性损伤模型的建立

目的建立方便有效的神经元拟缺血性损伤的离体模型。方法以原代培养Wistar大鼠乳鼠大脑皮层神经元为研究对象,不同浓度H2O2及Glu与细胞作用24h后,检测细胞活力,LDH漏出量及细胞形态学改变。结果6．25μmol/L～200μmol/L H2O2及12．5μmol/L～50μmol/L Glu均可降低神经元生长能力,增加乳酸脱氢酶漏出量；细胞形态有不同程度病理变化。结论H2O2与Glu引起的细胞损伤模型是两种方便有效的神经元拟缺血性损伤模型。     

脑缺血早期大脑皮质区神经元内一氧化氮合酶活性的变化

建立大鼠ＭＣＡＯ局灶脑缺血模型,利用ＮＡＤＰＨ－ｄ组织化学方法检测脑缺血早期大脑皮质缺血区神经元内一氧化氮合酶活性的变化。结果显示脑缺血早期３０ｍｉｎ神经元内一氧化氮合酶活性开始至高峰,随后下降,脑缺血后６０ｍｉｎ,降至正常。     

一种小鼠背根神经节原代神经元细胞分离与培养的优化方法

目的 探索一种可以大量快速培养活力好且卫星胶质细胞污染少的原代神经元细胞的方法。方法 混合酶溶液消化体式显微镜下提取的背根神经节(DRG),随后接种于纤维连接蛋白提前包被的培养皿中,8 h后更换含5-氟尿嘧啶的维持培养基,抑制非神经元细胞增殖。结果 分离培养的感觉神经元细胞在培养过程中可维持15 d左右,部分细胞可维持更长时间。原代细胞于第3天即可观察到交错的轴突网络,接种细胞密度大,卫星胶质细胞污染情况少,细胞在7 d之内可投入使用,操作者经短时间训练后即可快速掌握方法。结论 新方法在传统方法的基础上进行了改良,可获取较多数量细胞活性好、纯度高的原代神经元细胞,相较传统方法具有可操作性高,重复率高的优势。     

内皮素-1诱导培养大鼠大脑皮质神经元凋亡的初步研究

目的观察内皮素(endothelin,ET)-1有无直接诱导原代培养神经元凋亡的作用,以及其作用通过的ET受体亚型。方法神经元培养取自新生SD大鼠大脑皮质。培养5 d后分别加入0.2 nmol/L,20 nmol/L ET-1处理24 h,用Annexin V、Hoechst 33258染色半定量测定细胞凋亡。再用流式细胞仪分别定量检测ET受体A拮抗剂(BQ123)或ET受体B拮抗剂(BQ788)对20 nmol/L ET-1诱导神经元凋亡的效果。结果0.2 nmol/L ET-1未显示诱导培养神经元凋亡的作用;20 nmol/L ET-1处理后24 h,培养神经元凋亡率明显高于对照组(P<0.01);BQ123和BQ788分别部分阻断了20 nmol/L ET-1诱导神经元凋亡的作用(P<0.01),但阻断效果不完全。结论20 nmol/L ET-1可直接诱导培养大鼠大脑皮质神经元凋亡,其作用可能是通过其A受体和B受体亚型共同实现的。     

新生大鼠螺旋神经元的培养及免疫细胞化学鉴定

目的 建立酶解分离培养新生大鼠耳蜗螺旋神经元（SGN）的方法。方法 对出生后2～5d的SD大鼠的螺旋神经元进行酶解分离与培养,用荧光倒置相差显微镜观察SGN的生长与分化过程,用免疫荧光染色法对SGN进行鉴定。结果 新生SD大鼠SGN在酶解分离、体外培养条件下,可获得良好的细胞形态及表形分化,表现出稳定的神经元可塑性。结论 酶解分离方法可获得良好状态的SGN细胞,可以满足体外多种实验需要。     

体外培养原代神经元损伤模型的建立及损伤后脑红蛋白的表达

目的建立原代神经元机械性损伤的体外细胞模型并探讨神经元损伤后脑红蛋白（NGB）的表达变化。方法取出生12h内Wistar鼠的大脑皮质，培养10-12d后，采用所设计的标准模板，直视下进行损伤，采用免疫组化方法和图像分析技术观测损伤前、后不同时间点神经元的NGB免疫组化反应及其阳性信号的灰度值。结果皮质神经元损伤2h后，NGB阳性信号强度即开始增加，16h后达高峰，随后逐渐下降，128h后恢复至损伤前水平。结论皮质神经元体外损伤模型可用于在体外观察神经元受到机械性损伤后细胞内蛋白表达变化的一些分子事件，简单实用。机械性损伤可以诱导神经元NGB在损伤后一定时间段内表达上调。     

神经干细胞诱导分化神经元培养方法的建立

目的:诱导大鼠神经干细胞(NSCs)向神经元细胞系分化,建立体外培养神经元的模型。方法:从Wistar大鼠胚胎大脑分离、培养NSCs,小剂量碱性成纤维生长因子(bFGF)无血清条件培养基诱导NSCs定向分化,以免疫组化技术检测,与直接培养的海马细胞中NF200阳性细胞数以及神经元生长情况进行比较。结果:应用小剂量bFGF无血清培养基诱导NSCs定向分化7、10d,神经元生长良好,通过免疫组化检测到NF200阳性神经元数量多于直接培养的海马神经元(P<0.01)。结论:应用小剂量bFGF无血清条件培养基对NSCs进行定向诱导分化,培养的神经元生长良好,可作为体外神经元培养模型之一。     

大鼠胚胎中脑多巴胺神经元的分离培养与鉴定*

背景：神经细胞移植治疗是最有希望治愈帕金森病的方法之一。 目的：探讨大鼠胚胎中脑多巴胺神经元分离、培养与鉴定的方法。 方法：解剖分离E14d SD大鼠胚胎中脑组织,制备单细胞悬液,以神经细胞培养液培养,观察其生长情况并进行RT-PCR和免疫组织化学鉴定。 结果与结论：在神经细胞培养液中,细胞生长良好。RT-PCR和免疫组织化学结果显示大多数细胞表达多巴胺神经元特异性分子标志。证实实验成功建立了大鼠胚胎中脑多巴胺神经元分离培养与鉴定的方法。     

嗅鞘细胞对培养脊髓神经元生长状态的影响

目的研究嗅鞘细胞(OECs)对体外培养脊髓背根神经节神经元生长状态的影响。方法取新生大鼠脊髓背根神经节细胞与嗅鞘细胞共培养,在显微镜下观察神经元生长发育情况,染色后进行细胞计数,并测定细胞活性。结果共培养组细胞密度明显高于对照组,神经元胞体大而饱满,突起较长,细胞活性较高。结论嗅鞘细胞可明显促进体外培养脊髓背根神经节神经元的生长,提高细胞活性。     

苯妥英对缺氧大鼠大脑皮质神经元钙激活钾通道的影响

目的 :研究苯妥英对缺氧大鼠大脑皮质神经元钙激活钾 [K(Ca) ]通道的影响。方法 :应用膜片钳单通道技术记录苯妥英对缺氧大鼠大脑皮质神经元上K(Ca)通道电流活动。电流信号经放大、滤波及转换后输入微机进行采样、储存和分析。结果 :苯妥英对缺氧大脑皮质神经元K(Ca)通道具有明显的激活作用 ,主要是增加通道的开放概率 (openprobability,Po)。结论 :苯妥英激活大脑皮质神经元K(Ca)通道 ,产生超极化电位 ,从而稳定细胞膜 ,降低细胞兴奋性 ,延缓缺氧除极的发生 ,这可能是苯妥英抗缺血脑损伤的另一个重要机制     

体外羊膜间充质干细胞分离培养及向神经元样细胞的分化

背景：胎盘组织作为寻找人类间充质干细胞的新来源,已成为备受人们关注的研究热点。从胎盘组织中羊膜层分离、培养细胞,因其来源广泛、不受伦理限制等优越性而具有广阔的应用前景。 目的：观察人羊膜间充质干细胞体外分离培养的方法,及向神经元样细胞分化的能力。 方法：用酶消化法从羊膜中分离和培养间充质干细胞,并通过形态的均一性及流式细胞术检测其表面标志以鉴定纯度。应用DMEM-LG+20 g/L DMSO+100 µmol/L BHA+10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子诱导分化,通过免疫荧光染色鉴定诱导后的细胞。 结果与结论：可从羊膜组织成功分离培养出间充质干细胞,细胞贴壁生长,在体外短期内可以稳定增殖和传代。具有与骨髓间充质干细胞相似的表面标志,体外可以诱导分化为神经元样细胞,胶质纤维酸性蛋白与神经元特异性烯醇化酶免疫荧光染色均为阳性。提示羊膜间充质干细胞可以在体外分离培养并诱导分化为神经元样细胞,羊膜组织可以作为干细胞研究以及神经组织疾病细胞治疗的一个全新的细胞来源。     

神经干细胞原代培养及GABA能神经元的诱导分化

目的探讨神经干细胞的原代培养及γ-氨基丁酸(GABA)能神经元的诱导分化.方法取孕16 dWistar大鼠的胚鼠全脑,进行体外培养,并对培养的神经干细胞以及诱导分化的GABA能神经元进行鉴定.结果培养24h后,出现2～4个细胞的细胞球.分化2d后,神经球贴壁后伸出细长突起,并可和周边神经球伸出的突起连接.神经球周边可见大量散在贴壁的双极或多极细胞.免疫荧光染色可见神经球均有nestin、NF200、GFAP阳性细胞.取第3代神经球行GABA能神经元定向分化.分化24h后,实验组细胞球贴壁.3d后,实验组细胞球周边有大量散在分布细胞贴壁生长,胞体圆形较大,有1～2个细长突起.免疫荧光显示,实验组周边散在的贴壁细胞多为GAD65阳性细胞.GAD65阳性细胞分化率实验组(85.97±2.78)%、对照组(18.16±2.29)%,P<0.01.结论本实验利用寡核苷酸序列特异性阻断了bHLH基因家族的调控因子之一Hes1,解除了其对bHLH的抑制,促进了神经干细胞向神经元的分化.实验还发现,阻断Hes1后大大提高了神经干细胞向GABA神经元分化的比率.     

原代培养海马神经元及雄激素的神经保护作用

中文摘要：目的：了解培养中的海马神经元的形态学特点和雄激素对自由基损伤的海马神经元的保护作用。方法：应用SD乳鼠培养原代海马神经元,测量细胞的活性和细胞存活率,免疫细胞化学计数MAPII和NSE染色的阳性细胞数,暴露于浓度为100μmol/L的H2O2,检测细胞的活力和存活率,NO和SOD的含量,另外一组在暴露于H2O2之前24小时,给予10nM的睾酮,然后再暴露于H2O2检测细胞的活力,细胞存活力,NO和SOD的活力。结果：原代培养的细胞呈MAPII和NSE染色阳性细胞,阳性率可达到93.06%, 91.59%.海马神经元活力,存活率,SOD值在给予H2O2后下降,NO值上升,而暴露于H2O2前给予睾酮可以使其效果部分逆转。结论：海马神经元可以在Neurobasal+B27培养基中生长,对于H2O2造成的自由基损伤模型,应用雄激素可以起到保护神经元的作用。     

体外培养大鼠脑皮质神经元离心损伤模型的建立

目的建立体外培养大鼠脑皮质神经元离心损伤模型，观察离心损伤后神经元的形态学变化和培养液中乳酸脱氢酶（LDH）的含量变化。方法把培养神经元的六孔培养板的孔内，置入与孔大小相当的200目钢网，并在钢刚上放置6g重物，通过变速离心培养板，造成神经元损伤的作用。使用倒置相差显微镜，电镜观察损伤后神经元的形态改变，并测量培养液中乳酸脱氢酶（LDH）的含量变化。结果光镜可见神经元破碎、轴索肿胀、轴索球、轴索部分崩解。电镜可见细胞骨架发生变化。从神经元损伤15min后，培养上清液中LDH活性增高。损伤组LDH升高有两个时相，第一峰在30min出现，第二峰在72h出现，损伤后30min，24h，48h，72h，损伤组与对照组同时间相比，LDH含量均有显著统计学意义（P〈0．01），第一峰值可能是原发性损伤造成的细胞膜破损，LDH释放量升高引起的，第二峰值可能是继发性损伤导致细胞膜破损，LDH漏出所引起的。结论实验建立的神经元损伤模型操作简便，能较好地模拟脑外伤。     

大鼠大脑皮质神经元氧糖剥夺/复氧模型的建立

目的 体外大鼠大脑皮质神经元氧糖剥夺/复氧试验模型的建立.方法 取 Wistar 大鼠乳鼠脑组织,采用过滤、消化、离心等技术获取大脑皮质神经元并培养,通过倒置显微镜、免疫细胞化学鉴定,采用MTT 法、酶学检查、光学显微镜等评价该模型.结果 (1)形态学、免疫细胞化学(NSE)鉴定所培养的细胞为神经元;(2)氧糖剥夺/复氧前后细胞形态结构变化显著,MTT 法及LDH释放测定均提示神经元损伤随氧糖剥夺时间呈时间依赖关系,与正常对照组有显著差异(P<0.05).结论 成功地建立体外大脑皮质神经元的氧糖剥夺/复氧模型.     

高糖诱导大鼠海马神经元细胞模型建立及细胞凋亡的影响

目的通过不同葡萄糖浓度和不同作用时间诱导SD大鼠海马神经元,建立稳定的糖尿病脑病细胞模型,探讨高糖对海马神经元凋亡情况的影响。方法 (1)海马神经元的原代培养及纯度鉴定。(2)最适高糖浓度探索:CCK-8法检测海马神经元各组细胞活性。(3)最适浓度下高糖作用时间的探索:Western blot检测海马神经元细胞Bcl-2、Bax的表达情况。(4)最适浓度和作用时间下,流式细胞术检测细胞的凋亡率。结果 (1)成功培养海马神经元,神经元细胞经鉴定纯度达85%以上。(2) 45 mmol/L组海马神经元存活率均 80%。(3) 45 mmol/L-48 h为最适作用时间组,细胞内Bcl-2表达下降、Bax表达升高(P 0. 01)。(4)最适高糖组细胞凋亡率显著升高(P 0. 01)。结论高糖浓度为45 mmol/L、作用时间48 h为理想的糖尿病脑病细胞模型,且高糖通过影响Bcl-2、Bax的表达导致海马神经元凋亡率升高。     

凝血酶对原代培养海马神经元游离钙浓度的影响

目的研究原代培养的海马神经元内游离Ca2 水平及凝血酶的影响.方法大鼠海马神经元进行体外原代培养,用钙离子指示剂Fura-2双波长法测定海马神经元内游离[Ca2 ]i及不同浓度的凝血酶作用后细胞内[Ca2 ]i.结果原代培养的海马神经元生长旺盛,密度高,符合实验要求.在胞外Ca2 浓度为0.0 mmol/L时,静息状态下海马神经元游离[Ca2 ]i为(79.83±18.78)nmol/L.当胞外Ca2 浓度为1.3 mmol/L时,海马神经元游离[Ca2 ]i为(106.41±22.53)nmo1/L.(1～40)U/ml凝血酶可使海马神经元内游离Ca2 水平显著升高,与对照组相比均有显著性差异(P＜0.01).随凝血酶浓度的增加,胞内游离[Ca2 ]i之呈剂量依赖性增加.结论凝血酶可使原代培养的海马神经元内游离Ca2 浓度明显升高.