重组丙型肝炎病毒在7721细胞中的复制

目的 探讨构建的重组丙型肝炎病毒(HCV)能否在易感细胞系中复制和表达。方法 用人工构建的HCV感染易感细胞系7721,培养72h后利用RT-PCR检测HCV的RNA表达,并应用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察免疫荧光标记的HCV核心抗原和胞膜抗原E1在细胞中的表达。结果 人工构建的HCV感染7721细胞72h后,RT-PCR检测细胞内可检出HCV正链及负链RNA,细胞培养上清中可检出HCV正链RNA,CLSM检测HCV核心抗原和E1抗原在细胞内的分布呈胞浆型。结论 构建的HCV72h内可以在易感细胞系7721中复制和表达。     

人肝癌细胞系7721与原代人胎肝细胞用于体外培养HCV的对比研究

目的 研究丙型肝炎病毒（HCV）在体外培养原代人胎肝细胞和人肝癌细胞系7721中复制和表达的异同,探讨HCV体外培养条件。方法 原代人胎肝细胞系7721分别与HCV感染血清共孵育后,用逆转录-聚合酶链反应、原位杂交、免疫组化检测细胞和培养上清中的HCV RNA和抗原表达。结果 从孵育的2～3天,即可在细胞内和/或培养上清中间断地检出HCV RNA（其中HCV在7721细胞株中的复制至少可达66d,HCV在 人胎肝细胞中的复制持续25d）;HCV抗原可在感染细胞内得到稳定表达,感染细胞内存在HCV负链RNA杂交信号,且多位于细胞浆。结论 两种肝细胞对HCV易感,尤其是7721细胞可以稳定地支持HCV体外复制,可用于HCV体外长期培养的靶细胞。     

丙型肝炎病毒感染细胞模型的实验研究

目的 建立接近体内自然感染状态并能长期复制的丙型肝炎病毒(HCV)感染细胞模型．方法 用HCV阳性血清感染人肝癌细胞株HepG2、SMMC 7721及胎肝细胞株L02，继续培养60d，用巢式逆转录-聚合酶链反应(nested RT-PCR)检测培养细胞及上清中正、负链HCV RNA。结果 HepG2、SMMC 772l在感染后第2-30d，L02在感染后第3-30d细胞中可以间断检出HCV正链RNA；3株细胞的细胞内HCV负链RNA均在感染后第3-30d可以间断检出，检出率与正链RNA接近。3株细胞以HepG2细胞中HCV RNA正、负链检出率较高，并在第3l—60d仍可间断检出，但复制程度逐渐减弱。3株细胞的培养上清中HCV正链RNA感染后也呈间断阳性，检出率与细胞内正链RNA基本一致。培养上清中均末检出HCV负链RNA。结论 HePG2、SMMC772l及L02细胞均对HCV易感，并能支持HCV长期复制。而HePG2细胞是较为理想的HCV体外感染细胞模型。     

多抗原肽免疫血清体外阻断丙型肝炎病毒感染树鼩肝细胞的初步研究

目的：探讨多抗原肽（MAP）免疫血清在体外能否阻断丙型肝炎病毒（HCV）感染树Gu感染树Gu肝细胞，为研制HCV分子疫苗提供实验基础。方法：用兔抗MAP血清分别与两分感染血清按一定比例混合后接种于原代培养的树Gu肝细胞中，用逆转录聚合酶链反应（RR－PCR），免疫组化，原位杂交分别检测细胞内或上清中正负链RNA，细胞内HCV NS3抗原的表达情况，以及原位检测细胞内HCV负链RNA，结果：1份HCV RNA阳性血清与兔抗MAP血清按1：1混合后接种于培养的树Gu肝细胞中，细胞内可检出HCV正负链RNA，并有HCV NS3抗原的表达，而另外1份HCV RNA阳性血清与兔抗MAP血清按1：1，5：1，10：1混合后接种于培养的树Gu肝细胞中，细胞内未检测出HCV正负链RNA，也未见特异性抗原表达，结论：兔抗MAP血清在体外能部分阻断HCV感染。     

ALT与HCV核心抗原及HCV—RNA相关性研究

目的研究ALT与HCV核心抗原、HCV—RNA间关系。方法对81例HCV—RNA阳性标本检测HCV核心抗原和ALT水平。结果81例HCV—RNA阳性标本检出HCV核心抗原阳性32例,灰区26例,ALT水平超过临床参考值56例,ALT检测水平与HCV核心抗原阳性程度呈正相关性。结论HCV—cAg仅与HCV—RNA复制密切相关,与复制水平无关。HCV核心抗原可联合HCV抗体检测提高血液标本HCV感染检出率,结合ALT可以评测感染状态。     

siRNA抑制感染细胞模型中HCV复制的研究

目的:探讨siRNA能否有效抑制丙型肝炎病毒(HCV)感染细胞中HCV的复制.方法:用HCV JC1质粒体外制备HCV RNA转录体,转染Huh-7.5.1细胞,收集细胞上清,再次孵育Huh-7.5.1细胞以建立HCV感染细胞模型,并用间接免疫荧光检测细胞内HCV核心蛋白的表达.将针对HCV NS5B基因的siRNA转染HCV感染细胞(浓度为4、40和200 nmol/L,时间为24 h、48 h和72 h),将4、40和200 nmol/L siRNA转染正常Huh-7.5.1细胞,并设空白对照、脂质体对照、无关siRNA对照以及IFNα-2b(1 000 IU/ml)组,用荧光定量PCR检测细胞内HCV RNA和PKRmRNA水平.结果:HCV感染的Huh-7.5.1细胞中检测出HCV核心蛋白表达.40 nmol和200nmol/L siRNA 24 h组及4、40、200 nmol/L siRNA 48 h和72 h组,HCV RNA水平分别降至58％、54％、29％、17％、17％、33％、22％、19％,明显低于对照组(P＜0.05或P＜0.01).1 000 IU/mlIFN的各时间组HCV RNA水平均明显低于对照组(P＜0.05或P＜0.01).各浓度siRNA组的PKR mRNA的表达与对照组无明显差异(P＞0.05).结论:针对HCV NS5B区的siRNA能够明显抑制HCV感染细胞中HCV的复制,而不引起双链RNA依赖的蛋白激酶(PKR)基因表达的激活.     

体外感染细胞表达HCV-NS5和复制HCV RNA的实验研究

为了研究 HCV- NS5 和 HCV RNA在体外感染细胞培养系统中的表达和复制情况 ,选用 HCV RNA水平为2× 10 4拷贝 / m l的阳性血清感染人肝癌细胞株 (Hep G2细胞株 )。应用胶体金标免疫电镜法和原位杂交法检测 HCV在被感染细胞中 NS5 蛋白表达和 RNA复制的情况。结果在细胞浆内有电子密度大的金标颗粒的吸附 ,在感染后的第 1至第 9代细胞中均有发现。感染后的细胞超微结构完整 ,未发现 HCV颗粒。在感染后的第 1至第 7代细胞内出现特异性杂交信号 ,HCV RNA阳性物呈蓝紫色细小颗粒分布在细胞浆和细胞核内。因此 ,HCV能够在 Hep G2细胞中表达 NS5抗原和复制 RNA,而细胞超微结构完整。     

体外培养人肝癌细胞系7721中HCV复制和表达特性

建立支持ＨＣＶ体外长期复制的细胞培养体系,研究其体外复制和表达特性。方法：将ＨＣＶ感染血清接种人肝癌细胞系７７２１后,以逆转录－聚合酶链反应、免疫组化、原位杂交检测细胞内ＨＣＶ的感染和复制情况。结果细胞内和培养上清中在孵育后的３月余均可间断地检测出ＨＣＶ正链和／或负链ＲＮＡ,多种ＨＣＶ抗原在细胞内能稳定有达;ＨＣＶ ＲＮＡ和抗原多位于胞浆中,结论ＨＣＶ在７７２１细胞系中的复制和表达与体内感染状态接     

丙型肝炎阳性血清直接感染HepG2细胞的初步研究

目的 :用丙型肝炎 (丙肝 )阳性血清 (抗HCV阳性及HCVRNART PCR阳性 )感染HepG2细胞 ,以期建立稳定的HCV感染的细胞模型。方法 :采用丙肝阳性血清连续感染法感染HepG2细胞 ,用逆转录多聚酶链反应检测传代HepG2细胞内HCVRNA正链和负链 ,电镜观察感染后的细胞内的病毒颗粒 ,免疫组化方法检测感染后的细胞内丙肝病毒蛋白抗原 (HCVNS5、HCVcapsid)的存在。结果 :感染后传代的第一代至第三代细胞内检出HCVRNA正链及负链 ;在感染后传代的细胞内发现球形、密集分布的类丙肝病毒颗粒 ,直径为 30～ 6 0nm ;免疫金银染色发现部分细胞内有聚集的银染颗粒 ;免疫电镜检查在细胞胞浆的囊泡样结构中发现聚集的金颗粒。结论 :HCV可在HepG2细胞内复制 ,可形成病毒颗粒 ,可随细胞传代。本研究初步建立了用丙肝阳性血清感染HepG2细胞的丙肝病毒感染细胞模型     

Characteristics of HCV replication and expression in a cultured human liver carcinoma cell line in vitro

ProgressonhepatitisCresearchhasadvancedquickly.However,theabsenceofcellculturesystemofHCVinfectionhashamperednotonlytheunder-standingofitslifecycle,butalsotheanalysisofthemoleculardeterminantsofitspersistence.Toidentifycriticalepitopesthatelicitaneutralizingantibodyre-sponseandtounderstandthepathogenesisofpersis-tentHCVinfection,efficientcellmodelsofHCVin-fectionisneeded[1].HumanT-lymphocytecelllines[2-5],humanfibroblastcells[6](VH3),peripheralbloodmono-nuclearcells[7](PBMCs)andhepatocy…     

乙型丙型肝炎病毒合并感染细胞模型的建立

目的：本文拟利用慢病毒载体,在可感染丙型肝炎病毒（HCV）的Huh7.5.1细胞中过表达人肝细胞乙型肝炎病毒（HBV）受体钠离子牛磺胆酸共转运蛋白（sodium taurocholate cotransporting polypeptide, NTCP）编码基因,建立Huh7.5.1- hNTCP细胞模型,使其可以被HBV、HCV共同感染。方法：使用携带人NTCP编码基因、GFP（green fluorescent protein）基因、嘌呤霉素抗性基因的GV358重组慢病毒载体,以50的感染复数（MOI）感染Huh7.5.1细胞。经过嘌呤霉素筛选获得稳定表达人NTCP基因的Huh7.5.1-hNTCP细胞株,并通过Western-blotting验证NTCP蛋白的表达。使用HepAD38细胞来源的HBV感染Huh7.5.1-hNTCP细胞,通过ELISA及qPCR等方法检测HBV感染后不同时间点HBsAg、HBeAg的表达以及HBV DNA的复制。HBV感染后24小时予以HCV-JFH1感染,检测合并感染状态下HBV DNA以及HCV RNA的复制。结果：Western-blotting 结果表明Huh7.5.1-hNTCP细胞株可稳定表达HBV受体NTCP。HBV感染Huh7.5.1-hNTCP细胞后ELASA、qPCR结果显示：HBsAg、HBeAg、HBV DNA合成逐渐增加,并在第9天达峰。HBV/HCV合并感染Huh7.5.1-hNTCP细胞后,qPCR检测结果显示不同时间点HBV DNA、HCV RNA复制逐渐增加。结论:建立了Huh7.5.1-hNTCP细胞模型,该模型可被HBV/HCV合并感染。     

重组腺病毒载体转染p16基因对肝癌细胞的生长抑制作用

目的：通过腺病毒转染p16基因观察对肝癌SMMC-7721细胞的杀伤作用。方法：克隆人p16基因全长cDNA序列，构建携带p16基因的增殖缺陷型重组腺病毒p16(AdV-p16)，以AdV-p16感染人肝癌SMMC-7721细胞，观察p16基因的表达及其对细胞的生长抑制或杀伤作用。结果：AdV．p16能介导外源基因p16在肝癌SMMC-7721细胞系中高效表达。在感染AdV-p16后随重复感染度(MOI)升高p16基因阳性表达率升高，四甲基偶氮唑蓝染色法(MTT)实验结果表明，SMMC-7721细胞的生长受抑制。结论：腺病毒能够介导p16基因在肝癌细胞中高效表达，促进细胞周期阻滞和诱导肿瘤细胞凋亡。     

In Vitro Expression of Hepatitis C Virus Non-structure 5 Antigen in the HepG2 Cell Line

ItisofgreatsignificancetoestablishasensitivepropagationsystemofHCVinvitroforstudyingthefeaturesofHCV,pathogenesisofHepatitisC,thetreatmentofanti--virusandstudyofvaccine.Wede-tectedthepositiveandnegativelineofHCVinTlymphcellsofhumaninndroinpreviousstudyLI],andpresentedinthispaPeristhefurtherstudyoninvljroexpressionofHCV.lMATERMisANDMETHODS1'1PositiveInocuIumsofHCVRNATheserumofHCVRNAwith1evelof2X10'copy/mlwasselected,anddefinedbyfluorescentquantificationmethed(Thereagentkitwa…     

丙型肝炎阳性血清直接感染HepG2细胞的初步研究

目的：用丙型肝炎（丙肝）阳性血清（抗ＨＣＶ阳性及ＨＣＶＲＮＡ ＲＴ－ＰＣＲ阳性）感染ＨｅｐＧ２细胞,以期建立稳定的ＨＣＶ感染的细胞模型。方法：采用丙肝阳性血清连续感染法感染ＨｅｐＧ２细胞,用逆转录多聚酶链反应检测传代ＨｅｐＧ２细胞内ＨＣＶＲＮＡ正链和负链,电镜观察感染后的细胞内的病毒颗粒,免疫组化方法检测感染后的细胞内丙肝病毒蛋白抗原（ＨＣＶＮＳ５、ＨＣＶ ｃａｐｓｉｄ）的存在。结果：感染后传代的     

In vitro expression of hepatitis C virus non-structure 5 antigen in the HepG2 cell line

Summary To establish a cell line as a model system for HCV infection and propagationin vitro, a human HepG2 cell line was incubated with a HCV RNA positive serum. The sABC immunological techniques and gold-labeled colloid electron microscopy method were employed to examine the viral proteins in those cells. The HCV non-structure 5 antigen was first detected in the HepG2 cells 72 h after incubation. The antigen was continuously observed in the cytoplasm as well on the membrane of the HepG2 cells even after 1, 2, 3 and 4 weeks after incubation. The observation of HCV non-structure 5 antigen continuously expressed in the HepG2 cells strongly indicates that the cells may have been infected by HCV virus. Therefore, the HepG2 cell line may serve as a potential host for establishment of HCV infection and propagationin vitro. This project was supported by a grant of the National Educational Committee for return scholars (No.)