胶原蛋白-硫酸肝素神经生物支架材料的制备

背景:有报道胶原-氨基聚糖材料基体植入周围神经组织节段性损伤处,可以促进神经轴突修复再生。硫酸肝素是细胞外基质的重要组成部分。目的:制备胶原蛋白-硫酸肝素神经组织工程生物支架,观察其生物相容性并用于神经损伤的修复。方法:将胶原蛋白-硫酸肝素悬浊液冷冻干燥,通过显微物镜、扫描电镜观察内部孔隙结构,测量孔的大小。选取SD大鼠12只制备5mm坐骨神经神经缺损模型,随机分为3组。硫酸肝素复合胶原支架移植桥接组、空白对照组(旷置)、正常对照组(自体神经移植)。移植术后经神经功能学观形态学检测其修复疗效。结果与结论:胶原蛋白复合硫酸肝素支架材料具有纵行的、平行排列的微管结构,高度仿生神经的内部空间三维结构。组织学染色、电镜观察证实再生神经纤维成功地长入组织工程材料内。部分大鼠运动功能恢复良好。结果提示,胶原蛋白复合硫酸肝素材料组织相容性良好,可以促进神经的再生并可用于神经损伤的修复。     

胶原蛋白复合硫酸肝素生物支架材料研制及其扫描电镜观察

目的：研制一种新型神经组织工程生物支架：胶原蛋白-硫酸肝素支架材料，用于神经损伤的修复。方法：将注有胶原蛋白-硫酸肝素悬浊液的硅胶管缓慢浸入-180℃液氮中，冷冻干燥，通过显微物镜、扫描电镜扫描观察所制胶原蛋白-硫酸肝素内部孔隙结构排列规律及走行方向，测量孔的大小。结果：制备的胶原蛋白复合硫酸肝素支架材料具有纵行的、平行排列的微管结构，高度仿生神经的内部空间三维结构。结论：胶原蛋白复合硫酸肝素生物支架材料作为新型神经组织工程材料基体，可用于周围神经损伤的修复。     

胶原蛋白-硫酸肝素神经生物支架材料的制备

背景：有报道胶原-氨基聚糖材料基体植入周围神经组织节段性损伤处,可以促进神经轴突修复再生。硫酸肝素是细胞外基质的重要组成部分。目的：制备胶原蛋白-硫酸肝素神经组织工程生物支架,观察其生物相容性并用于神经损伤的修复。方法：将胶原蛋白-硫酸肝素悬浊液冷冻干燥,通过显微物镜、扫描电镜观察内部孔隙结构,测量孔的大小。选取SD大鼠12只制备5mm坐骨神经神经缺损模型,随机分为3组。硫酸肝素复合胶原支架移植桥接组、空白对照组（旷置）、正常对照组（自体神经移植）。移植术后经神经功能学观形态学检测其修复疗效。结果与结论：胶原蛋白复合硫酸肝素支架材料具有纵行的、平行排列的微管结构,高度仿生神经的内部空间三维结构。组织学染色、电镜观察证实再生神经纤维成功地长入组织工程材料内。部分大鼠运动功能恢复良好。结果提示,胶原蛋白复合硫酸肝素材料组织相容性良好,可以促进神经的再生并可用于神经损伤的修复。     

自体变性骨骼肌-神经束复合体修复大鼠坐骨神经缺损的实验

目的:观察自体变性骨骼肌-神经束“并联”复合体桥接大鼠坐骨神经缺损的修复效果及可行性。方法:实验于2005-06/12在咸宁医学院神经组化研究室完成,将Wistar大鼠36只随机分为3组:复合桥组,神经桥组和肌桥组,每组12只。①模型制作:采用2%戊巴比妥钠溶液(0.1mL/50g)经腹膜腔注射麻醉后,显露并切去鼠的右侧坐骨神经一段使形成10mm缺损。另在复合桥组和肌桥组,切取股二头肌外缘纵行肌束,置于60℃水浴变性5min。②分组处理:复合桥组:将缺损远端神经行“束间分离”,等分为两束,切取10mm长的一束与自体变性骨骼肌束“并联”桥接于坐骨神经缺损处并用筋膜包裹;神经桥组:以自体神经原位桥接于神经缺损处;肌桥组:以自体变性骨骼肌束桥接于神经缺损处。③指标测试:术后24周,用肉眼观察桥接体及吻合口外形,取称大鼠双侧胫前肌湿质量,以术侧(右侧)与正常侧(左侧)湿质量百分比作为胫前肌湿质量恢复率;取移植体,以Bielschowsky镀银染色后,石蜡包埋,作纵、横切片,苏木精-伊红复染,光镜下观察和用彩色图像分析仪测量再生神经纤维的数目(密度)、平均直径及髓鞘厚度。结果:实验大鼠36只均进入结果分析,术后24周时,①大体观察:复合桥组和神经桥组的桥接段均有完整的神经外膜和清晰的神经折光横纹,与周围组织粘连轻,吻合处质软,表面光滑,而肌桥组则无完整的神经外膜和神经折光横纹,与周围组织粘连较重,吻合口处质硬,表面粗糙;胫前肌(湿质量)恢复率:复合桥组和神经桥组均较肌桥组高,其差异有显著性[复合桥组(72.19±7.23)%,神经桥组:(75.01±6.21)%,肌桥组:(63.98±6.41)%,P<0.05]。②再生神经纤维的数目(密度):复合桥组和神经桥组均较肌桥组多(密)[复合桥组:(77.78±6.76)×104根/μm2,神经桥组:(78.43±4.56)×104根/μm2,肌桥组:(68.88±2.39)×104根/μm2,P<0.05]。③再生神经纤维直径和髓鞘厚度:复合桥组和神经桥组也较肌桥组粗厚[复合桥组:(6.56±1.58)μm和(1.21±0.25)μm,神经桥组:(7.22±1.57)μm和(1.34±0.22)μm,肌桥组:(6.22±1.57)μm和(1.10±0.17)μm,P<0.05]。④复合桥组与神经桥组间各项检查指标比较差异均无显著性(P>0.05)。结论:缺损周围神经远段“束间分离”所得的自体神经与自体变性骨骼肌束“并联”复合桥体修复大鼠神经短距离缺损,其效果接近单纯的自体神经桥体而优于单纯的自体变性骨骼肌桥体,具有一定的临床应用价值。     

肌筋膜管桥接修复面神经缺损的作用

目的:观察肌筋膜管替代神经材料对面神经缺损的修复作用,为进一步提高面神经功能提供理论依据。方法:实验于2005-02/07在咸宁医学院神经组化研究室进行,选择日本大耳白兔24只,切去其双侧面神经上颊支0.5cm作为动物模型。肌筋膜管桥接组:以肌筋膜管桥接右侧面神经颊支的缺损;外膜直接缝合组:左侧面神经颊支被直接缝合,分别于术后5和8周进行大体观察,神经传导速度检测,组织学观察等,以比较两组(侧)面神经颊支的再生情况。结果:实验白兔24只均纳入结果分析。①术后5和8周形态及组织学观察显示肌筋膜管桥接组瘢痕明显少于神经直接缝合的对照组。②术后5周时组织图像分析显示桥接段再生有髓轴突数目和再生(恢复)率,肌筋膜管桥接组明显优于神经直接缝合组犤肌筋膜管桥接组:(1032±234)根/片和(23.72±7.26)%,外膜直接缝合组:(678±193)根/片和(15.70±5.23)%,t=2.52,P<0.01犦。③术后8周时电生理检测两组桥接段再生轴突的电传导速度显示肌筋膜管桥接组明显快于神经直接缝合组犤肌筋膜管桥接组:(17.69±0.14)m/s;外膜直接缝合组:(14.82±0.12)m/s,t=2.390,P<0.01犦。结论:在面神经损伤修复术中,肌筋膜管桥接治疗神经缺损的效果好于神经张力下直接缝合。     

神经干细胞与胶原蛋白－硫酸肝素生物支架生物相容性研究

目的：评价神经干细胞与胶原蛋白-硫酸肝素支架的生物相容性，探讨胶原蛋白-硫酸肝素支架作为中枢神经组织工程载体材料的可行性。方法：以冷冻干燥法制备胶原蛋白-硫酸肝素支架。体外培养新生小鼠海马神经干细胞。将神经干细胞与生物支架共培养，通过倒置相差显微镜、扫描电镜观察胶原蛋白-硫酸肝素支架内部结构和细胞生长状况。结果：制备的胶原蛋白-硫酸肝素支架材料具有纵行的、平行排列的微管结构。神经干细胞在支架上生长良好。结论：胶原蛋白一硫酸肝素支架与神经干细胞具有良好的生物相容性，有望作为中枢神经组织工程载体材料。     

自体变性骨骼肌-神经束复合体修复大鼠坐骨神经缺损的实验

目的：观察自体变性骨骼肌-神经束“并联”复合体桥接大鼠坐骨神经缺损的修复效果及可行性。 方法：实验于2005—06／12在咸宁医学院神经组化研究室完成，将Wistar大鼠36只随机分为3组：复合桥组，神经桥组和肌桥组，每组12只。①模型制作：采用2％戊巴比妥钠溶液（0．1mL／50g）经腹膜腔注射麻醉后，显露并切去鼠的右侧坐骨神经一段使形成10mm缺损。另在复合桥组和肌桥组，切取股二头肌外缘纵行肌束，置于60℃水浴变性5min。②分组处理：复合桥组：将缺损远端神经行“束间分离”，等分为两束，切取10mm长的一束与自体变性骨骼肌束“并联”桥接于坐骨神经缺损处并用筋膜包裹；神经桥组：以自体神经原位桥接于神经缺损处；肌桥组：以自体变性骨骼肌束桥接于神经缺损处。③指标测试：术后24周，用肉眼观察桥接体及吻合口外形，取称大鼠双侧胫前肌湿质量，以术侧（右侧）与正常侧（左侧）湿质量百分比作为胫前肌湿质量恢复率；取移植体，以Bielschowsky镀银染色后，石蜡包埋，作纵、横切片，苏木精-伊红复染，光镜下观察和用彩色图像分析仪测量再生神经纤维的数目（密度）、平均直径及髓鞘厚度。 结果：实验大鼠36只均进入结果分析，术后24周时，①大体观察：复合桥组和神经桥组的桥接段均有完整的神经外膜和清晰的神经折光横纹，与周围组织粘连轻，吻合处质软，表面光滑，而肌桥组则无完整的神经外膜和神经折光横纹，与周围组织粘连较重，吻合口处质硬，表面粗糙；胫前肌（湿质量）恢复率：复合桥组和神经桥组均较肌桥组高，其差异有显著性[复合桥组（72．19&;#177;7．23）％，神经桥组：（75．01&;#177;6．21）％，肌桥组：（63．98&;#177;6．41）％，P〈0．05]。②再生神经纤维的数目（密度）：复合桥组和神经桥组均较肌桥组多（密）[复合桥组：（77．78&;#177;6．76）&;#215;10^4根／μm^2，神经桥组：（78．43&;#177;4．56）&;#215;10^4根／μm^2，肌桥组：（68．88&;#177;2．39）&;#215;10^4根／μm^2，P〈0．05]。③再生神经纤维直径和髓鞘厚度：复合桥组和神经桥组也较肌桥组粗厚[复合桥组：（6．56&;#177;1．58）μm和（1．21&;#177;0．25）μm，神经桥组：（7．22&;#177;1．57）μm和（1．34&;#177;0．22）μm，肌桥组：（6．22&;#177;1．57）μm和（1．10&;#177;0．17）μm，P〈0．05]。④复合桥组与神经桥组间各项检查指标比较差异均无显著性（P〉0．05）． 结论：缺损周围神经远段“束间分离”所得的自体神经与自体变性骨骼肌束“并联”复合桥体修复大鼠神经短距离缺损，其效果接近单纯的自体神经桥体而优于单纯的自体变性骨骼肌桥体，具有一定的临床应用价值。     

海马神经干细胞与胶原蛋白海绵及明胶海绵的生物相容性

背景:在应用组织工程修复周围神经的研究中,载体的选择至关重要。理想的载体应与细胞外基质类似,与活体细胞有良好的生物相容性。目的:评价豚鼠海马神经干细胞与胶原蛋白海绵和明胶海绵的生物相容性,探讨它们作为周围神经组织工程载体材料的可行性。设计:随机对照实验。单位:郑州大学第一附属医院耳鼻咽喉科,郑州大学基础医学院解剖教研室。材料:实验于2005-07/2005-12在郑州大学基础医学院解剖教研室神经生物学研究室完成。健康新生(<24h)杂色豚鼠12只,清洁级,雌雄不限,体质量50-70g,由郑州大学医学院实验动物中心提供。方法:新生(<24h)豚鼠,10g/L水合氯醛腹腔麻醉,体积分数为0.75乙醇消毒,无菌操作分离出海马组织。体外无血清培养海马神经干细胞,传至第2代,将浓度调整为1×1010L-1后分别与胶原蛋白海绵、明胶海绵联合体外培养,一周后取材,进行细胞计数,倒置相差显微镜及扫描电镜观察,并测定两种材料与细胞的吸附率。主要观察指标:①观察神经干细胞在胶原蛋白海绵和明胶海绵上的生长、黏附情况,并测定其细胞总数与载体材料的吸附率。②免疫细胞化学染色分化细胞形态观察。结果:①神经干细胞可以在胶原蛋白海绵和明胶海绵上生长,逐渐黏附,胶原蛋白海绵细胞吸附率高于明胶海绵(37.17%和14.87%,χ2=4.819,P<0.05)。②对照组、胶原蛋白海绵组、明胶海绵组细胞总数差异无显著性犤(53.17±3.5)×104,(53.25±2.6)×104,(52.04±4.05)×104,F=0.233,P>0.05犦。结论:胶原蛋白及明胶两种材料,尤其是胶原蛋白,具有良好的神经干细胞相容性,可以作为周围神经组织工程的支架材料应用于临床。     

模拟动作电位微电场效应能直接始动髓鞘化

目的:探讨模拟动作电位微电场效应能否直接始动中枢神经轴突髓鞘化。方法:选取2根直径5μm碳纤维(中科院上海生命科学研究院神经科学研究所提供)。将正负极分别与2根碳纤维的导引铜丝相连,刺激频率1Hz,电压40mV,电流10μA,分波宽1×10-2s,1×10-3s,1×10-4s,1×10-5s4组。将碳纤维铺于神经元与胶质细胞共培养的培养皿底部,模拟神经轴索。通入1Hz,40mV,10μA的单相方波电流,30min/次,1次/d。连续10d,动态观察胶质细胞生长及包裹碳纤维情况。结果:①相差显微镜观察:波宽1×10-3s组,培养第7天,可见细胞团粘附于负极碳纤维,细胞团中生长出细胞膜样物质包绕碳纤维并沿纤维向两端延伸。波宽1×10-4s组,培养第12天始,可见小而圆的细胞靠近负极碳纤维。②SP免疫组化染色:波宽1×10-4s,1×10-3s组,有少突胶质细胞或其前体包裹碳纤维负极。结论:动作电位传导过程中造成的局部负电场能直接始动并参与中枢神经轴突髓鞘化。     

共聚比不同的两种聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物材料生物相容性观测

背景近年来,α-羟基酸及其衍生物合成的脂肪族聚酯,如聚乳酸、聚羟基乙酸等已广泛用于周围神经组织工程的支架材料研究,这种支架有可能克服因自体神经移植缺乏及供区的永久性失神经支配以及供受区神经匹配等问题,提高神经诱导作用.目的对共聚比为(8515)及(5050)的聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物材料的生物相容性及神经再生诱导作用进行对比观测.设计分组观察对比实验.单位解放军第三军医大学附属新桥医院骨科.材料清洁级健康成年Wistar大鼠66只,雌雄不拘,体质量180～200 kg;共聚比为(8515)及(5050)的聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物.方法实验于2001-11/2002-12在第三军医大学大坪医院野战外科研究所6室,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室完成.①许旺细胞的培养及与聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物膜的共培养观察将培养的许旺细胞接种于聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物膜上,应用扫描电镜观察细胞在共聚物膜上的生长情况.②聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物膜材料肌肉包埋组织学观察取Wistar大鼠15只,实验动物按随机数字法分以1,2,4,8和12周为时相点分为5组,每组3只.将共聚物材料(8515)裁剪成10 mm×5 mm×0.3 mm的膜,植入大鼠椎旁肌内,各时相点切取包含聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物膜在内的周围组织进行苏木精-伊红染色.③聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物管材料样品桥接大鼠坐骨神经缺损预实验取Wistar大鼠51只,分为共聚物8515管组、共聚物5050管组和硅胶管组,各组以2,4.6,8和12周为观察时相点,除12周为5只大鼠外,其余各时相点均为3只大鼠.于各时相点对各组材料进行大体观察及12周对大鼠进行再生神经运动传导速度测定,并取材桥接管中新生神经中段进行甲苯胺蓝染色,光镜观察.主要观察指标主要结局①大鼠肌肉包埋条件下聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物组织学观察.②坐骨神经缺损桥接大鼠实验模型应用组织学及神经电生理学检测聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物管神经诱导作用.次要结局许旺细胞和共聚物共培养条件下许旺细胞的生长行为观察.结果66只大鼠均进入结果分析.①大鼠肌肉包埋条件下聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物组织学观察结果聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物早期诱发以淋巴细胞及成纤维细胞为主的轻度的非特异性炎性反应,持续到10～12周时基本消退.②许旺细胞的培养及与聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物膜的共培养观察结果许旺细胞在聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物膜上能良好的生长并发生增殖.③大鼠体内神经桥接实验结果大体观察硅胶管促发有明显的纤维组织增生,而形成包囊包裹于管壁,而两种聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物管组未见类似现象;12周再生神经运动传导速度聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物8515管组与硅胶管组无显著差别[(17.03±0.66),(17.15±0.76)m/s,P＞0.05];共聚物8515管组髓鞘厚度、神经纤维直径、轴突数及神经组织面积比与硅胶管组均无显著差别[(0.45±0.16)μm,(3.96±1.73)μm,(10 135±1 053)个/mm2,(23.4±2.7)%比(0.45±0.19)μm,(4.07±1.86)μm,(9 879±1 491)个/mm2,(23.6±3.1)%,P＞0.05];而聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(5050)管体内神经桥接4周时即出现破裂,不能为坐骨神经桥接提供良好的支持作用.结论与硅胶管及聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(5050)相比,聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(8515)是一种异物反应小、生物相容性佳,生物降解速率合适的周围神经组织工程材料.     

骨髓源性神经干细胞周围神经移植的实验

背景由于周围神经只是神经元细胞的轴突,有关神经干细胞的研究几乎都集中在神经元细胞上,因此,关于周围神经修复的研究可以借鉴神经干细胞研究的某些经验.目的观察自体骨髓源性神经干细胞于周围神经损伤区移植后周围神经修复情况,以及所移植神经干细胞能否在周围神经损伤区以分化神经元的形式存活并迁移到脊髓.设计观察对比实验.单位南方医科大学珠江医院神经医学研究所.材料清洁级新西兰大白兔8只,体质量1.5～2.5 kg,雌雄不拘.方法实验于2004-04/10在南方医科大学珠江医院神经医学研究所完成.①取新西兰大白兔骨髓基质细胞体外培养及诱导分化为神经干细胞.②采用以溴脱氧尿嘧啶核苷标记细胞和免疫细胞化学SABC法检测观察培养细胞.③制备兔坐骨神经损伤模型,随机选择一侧坐骨神经损伤区为移植侧,注入生理盐水、胶原基质蛋白及细胞包埋液至0.01 mL(含干细胞1×1010L-1);另外一侧为对照侧,注入胶原基质蛋白悬液0.01 mL.移植后3个月灌注固定,行自体周围神经损伤区移植;移植区、脊髓区、对侧损伤区和正常神经区取材观察.主要观察指标神经干细胞移植区、脊髓区、对侧损伤未移植区神经纤维形态及神经元细胞.结果移植区生长的神经纤维密度及连续性明显比对侧未移植区高,光镜下可见较多的许旺细胞;放大至400倍视野下,还可见有髓神经纤维的郎飞氏结;神经纤维间隙也可见有黏液基质,并有少数成纤维细胞;移植区、脊髓区和对侧未移植坐骨神经损伤区均未见有神经元样细胞存在.结论自体骨髓源性神经干细胞周围神经缺损区移植有利于神经纤维的修复,不能在周围神经移植区、脊髓区和对侧缺损对照区以神经元的形式存活.     

许旺细胞增殖能力与基膜粘连蛋白和Ⅳ型胶原影响的关系

背景许旺细胞对周围神经的再生起着非常重要的作用,细胞外基质对许旺细胞生长也起着重要的作用.目的了解基膜粘连蛋白和Ⅳ型胶原对体外培养条件下许旺细胞的贴壁及增殖作用的影响.设计以细胞为研究对象,分组对照重复观察测量.单位解放军第四军医大学医院整形外科实验室.对象实验于1995-01/04在第四军医大学西京医院整形外科实验室完成.许旺细胞由新生日本大耳白兔制备获得.方法用基膜粘连蛋白和Ⅳ型胶原包被培养板,以结合了相应抗体的培养板及包被Ⅰ型胶原和多聚赖氨酸的培养板为对照,将培养的许旺细胞以相同浓度加入各组培养板内.测定2,6,24 h细胞贴壁率,培养72 h进行3H-TdR掺入试验,双道液体闪烁计数器测定各组的放射性计数.主要观察指标①细胞贴壁率计算结果.②3H-TdR计数结果.结果培养2 h基膜粘连蛋白和Ⅳ型胶原组早期贴壁率分别为66%和59%,较Ⅰ型胶原组(45%)和多聚赖氨酸组(43%)高,抗基膜粘连蛋白和抗Ⅳ型胶原组贴壁率较低.基膜粘连蛋白组、抗基膜粘连蛋白组、Ⅳ型胶原组、抗Ⅳ型胶原组、Ⅰ型胶原组、多聚赖氨酸组3H-TdR掺入试验计数分别为(10.0±2 7)×103,(1.3±0.3)×103,(10.4±2.4)×103,(1.4±0.5)×103,(5.8±2.7)×103,(3.3±1.0)×103 min-1.基膜粘连蛋白和Ⅳ型胶原组3H-TdR掺入量高于其他组.结论基膜粘连蛋白和Ⅳ型胶原对体外培养条件下的许旺细胞贴壁及增殖有促进作用,为发挥许旺细胞在神经组织工程中的作用奠定了实验学基础.     

聚乙烯醇-胶原凝胶研制及作为组织替代材料的生物相容性性

背景:聚乙烯醇对细胞黏附能力有限,在聚乙烯醇中加入胶原蛋白能否改善其细胞的黏附性?目的:研制一种新型的聚乙烯醇-胶原复合材料,并探讨其作为软组织替代材料的可行性.设计:单一样本观察.单位:暨南大学医学院附属广州市红十字会医院,广州市创伤外科研究所.材料:选用15只新西兰大白兔,体质量2.0～3.0 kg,雌雄不拘,由广东省医学实验动物中心提供.实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.广州市创伤外科研究所市级实验室完成.牛Ⅰ型胶原购自广州创尔生物技术有限公司,聚乙烯醇-124购自广州南方化玻仪器公司. 方法:实验于2003-07/2006-12在暨南大学医学院附属广州市红十字会医院完成.①聚乙烯醇-胶原材料制备:配制5g/L的牛Ⅰ型胶原与5%的聚乙烯醇-124以1:1混合,真空冷冻干燥成为凝胶状,扫描电镜观察其内部结构.②细胞毒性试验:聚乙烯醇-胶原材料剪成10mm×5mm×1 mm小片,γ射线消毒后,分别放入48孔平板中,每孔加入1×104个3T3细胞培养,扫描电镜观察细胞的生长状况.③体内埋植试验:将实验兔背部脊柱两侧各作2个纵切口,形成皮下腔隙.分别于手术形成的皮下腔隙植入4块聚乙烯醇-胶原材料,分别于术后1,4,8周各取3只实验共9块标本及其周围组织作病理观察.主要观察指标;扫描电镜观察凝胶膜内部结构、细胞毒性试验及体内埋植试验结果.结果:①聚乙烯醇-胶原材料内部结构:真空冷冻干燥的聚乙烯醇-胶原为白色的凝胶,扫描电镜见其表面和切面内部有贯通的三维孔隙.②细胞毒性试验结果; 313细胞在PVA-胶原材料上能三维生长、形态正常.③体内埋植试验结果:聚乙烯醇-胶原植入1周后,产生了正常的异物反应,材料与组织界限分明.4周后,只见极少量淋巴细胞浸润,大量的纤维母细胞增生形成胶原纤维和假单层立方上皮细胞包裹材料.8周未见淋巴细胞浸润、中性粒细胞和异物巨细胞,囊壁致密,大量的纤维母细胞增生形成包膜包裹材料.16周可见囊壁致密,胶原纤维变长,捧列规则,核变小,呈长卵圆形或长梭形,无新生小血管,无淋巴细胞、中性粒细胞和异物巨细胞浸润,囊壁稳定、变薄.结论:聚乙烯醇-胶原材料无毒副作用,具有良好的细胞相容性与组织相容性,可安全地应用于体内移植.     

氟伐他汀对大鼠肺间质纤维化及通气功能的影响

背景肺间质纤维化病理上可见以成纤维细胞(fibroblast,Fb)为主的大量间质细胞的增生及胶原分泌的增多,氟伐他汀对Fb等多种细胞具有增殖抑制作用.目的观察氟伐他汀对体外培养的大鼠肺Fb增殖的抑制作用和对博来霉素诱发的大鼠肺纤维化及肺通气功能的影响.单位解放军第四军医大学西京医院呼吸内科;解放军第四军医大学基础部病理学教研室;解放军第四军医大学西京医院骨科研究所.设计随机对照实验研究.材料本实验于200101/12在解放军第四军医大学西京医院呼吸内科实验室完成.实验选用健康雄性一级SD大鼠31只.干预取1只大鼠,摘取其肺组织,体外培养大鼠肺Fb,加入氟伐他汀,MTT法观察对培养细胞生长曲线的影响及不同浓度(0,1×10-7,1×10-6,1×10-5,1×10-4,1×10-3,1×10-2 mol/L,氟伐他汀0 mol/L为空白对照组)的氟伐他汀对培养细胞的抑制作用;计数法观察氟伐他汀对大鼠肺Fb分裂指数的影响;羟脯氨酸比色法检测氟伐他汀对培养的大鼠肺Fb胶原分泌的影响.随机将另30只大鼠分为正常对照组、博来霉素组及氟伐他汀组.氟伐他汀组根据治疗开始时间为模型制备后第1,15天和给药剂量为20,10 mg/kg(高、低剂量)分为4个治疗组第1天高、低剂量组,第15天高、低剂量组.28 d后处死动物,肺组织作HE、Masson和苦味酸天狼猩红染色,图像分析半定量测定并比较肺泡间隔Fb数量、肺泡间隔厚度、间质面积,肺组织匀浆测定组织胶原含量.主要观察指标氟伐他汀对体外培养的大鼠肺Fb生长曲线、分裂指数及培养上清液胶原含量的影响;氟伐他汀对博来霉素诱导的肺纤维化大鼠肺泡间隔Fb数量、肺泡间隔厚度、间质面积、肺组织胶原含量的影响.结果氟伐他汀对体外培养的大鼠肺Fb具有明显抑制作用(t=4.20～17.52,P<0.01),并随着药物剂量的增大其抑制作用逐渐增强,呈剂量依赖效应,1×10-4mol/L的氟伐他汀已可使培养细胞的增殖受到完全抑制,自第2天起各时间点A490值与第1天比较,差异无显著性意义(P>0.05);细胞分裂指数、培养细胞的胶原分泌在氟伐他汀的作用下也有明显降低(t=8.037,P<0.01;t=3.99～10.84,P<0.05或P<0.01).博来霉素组在肺泡间隔Fb数量、肺泡间隔厚度、肺间质面积及肺组织胶原含量均高于对照组(t=4.62～11.93,P<0.01),氟伐他汀组各组以上各观察指标均不同程度低于博来霉素组(t=2.69～7.65,P<0.05～0.01);博来霉素组基质胶原及Ⅰ,Ⅲ型胶原分布较对照组明显增多,氟伐他汀治疗组各组均有不同程度的减少.结论氟伐他汀对体外培养的大鼠肺Fb的增殖具有明显的抑制作用,并呈剂量依赖效应;氟伐他汀对博来霉素诱发的大鼠肺纤维化具有显著的治疗作用,并且早期治疗较晚期效果更为明显.     

外源性胶原对组织工程肌腱构建影响的体外形态学观察

背景:I型胶原抗原性低,具有为细胞移行、增殖和分泌提供支架结构的特殊功能。目的:利用I型胶原观察转化人胚腱细胞与人工材料复合后的形态学变化,为体外构建组织工程化肌腱提供实验依据。设计:随机对照观察。单位:四川大学华西医院骨科。材料:实验于1998-07/09在华西医科大学移植免疫室完成。实验设立人发复合胶原组、碳纤维复合胶原组、聚羟基乙酸复合胶原组作为实验组,设立人发未复合胶原组、碳纤维未复合胶原组、聚羟基乙酸未复合胶原组作为对照组。人工材料:健康成人头发(长约30cm,80g左右),碳纤维编织带(兰州碳素厂提供),聚羟基乙酸纤维束(美国Johnson)。方法:①人发复合胶原组选9根健康成人头发,经处理后3根为一股编织成腱,长约0.8cm,直径约0.4cm,两端自身打结。②碳纤维复合胶原组将购买的碳纤维编织带分开,制成直径及长度与人发腱相同的人工材料,两端用5/0丝线捆扎。③聚羟基乙酸复合胶原组将3根聚羟基乙酸纤维束互相编织成束,直径及长度与人发腱相同,两端用5/0丝线捆扎。④各对照组编织支架材料过程与其对应实验组相同。⑤各组支架材料均制备5根。实验组支架材料60Co灭菌后,无菌条件下置于I型胶原溶液中0.5h,取出后室温干燥备用。对照组支架材料均不与I型胶原复合。⑥各组分别与细胞密度为3×106/mm3的转化人胚腱细胞培养基进行体外联合培养,于培养后不同时间点对细胞数量及形态进行倒置显微镜和扫描电镜观察。主要观察指标:①细胞生长情况及附着情况倒置显微镜观察结果。②细胞形态及与材料附着情况扫描电镜观察结果。结果:①细胞生长情况及附着情况倒置显微镜观察结果:培养2h后,各实验组均可见细胞向材料周围聚集,附着于材料的部分细胞呈圆形;培养3d后,附着于材料上的细胞开始增多,形态由圆形向椭圆形演变,可见圆形与椭圆形细胞“共存”现象;而各对照组培养2h和3d后,3种材料上细胞附着均较少。培养5d后,各实验组材料上细胞形态向梭形演变,细胞数量进一步增多,且碳纤维材料之间可观察到大量梭形细胞生长;而各对照组细胞形态大部分仍为圆形及椭圆形,细胞数量少于各自对应实验组。②细胞形态及与材料附着情况扫描电镜观察结果:体外培养5d后,各实验组材料表面腱细胞绝大部分呈梭形,同时腱细胞伸出突起,沿材料纵轴生长,其间有丝状及片状物质,相互交织。而对照组细胞明显较各自对应实验组附着少,细胞也呈梭形或圆形,但未见材料间的丝状及片状物质,也未见细胞伸出突起。结论:人发、碳纤维、聚羟基乙酸表面复合I型胶原后,有利于细胞附着,材料周围的细胞不仅数量增多,且出现圆形与椭圆形细胞“共存”现象,细胞形态向梭形演变,说明外源性胶原有助于细胞对材料的附着以及细胞自身的增殖。     

聚乙烯醇-胶原凝胶研制及作为组织替代材料的生物相容性[英文]

背景：聚乙烯醇对细胞黏附能力有限,在聚乙烯醇中加入胶原蛋白能否改善其细胞的黏附性？目的：研制一种新型的聚乙烯醇-胶原复合材料,并探讨其作为软组织替代材料的可行性。设计：单一样本观察。单位：暨南大学医学院附属广州市红十字会医院,广州市创伤外科研究所。材料：选用15只新西兰大白兔,体质量2.0~3.0kg,雌雄不拘,由广东省医学实验动物中心提供。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。广州市创伤外科研究所市级实验室完成。牛I型胶原购自广州创尔生物技术有限公司,聚乙烯醇-124购自广州南方化玻仪器公司。方法：实验于2003-07/2006-12在暨南大学医学院附属广州市红十字会医院完成。①聚乙烯醇-胶原材料制备：配制5g/L的牛Ⅰ型胶原与5%的聚乙烯醇-124以1∶1混合,真空冷冻干燥成为凝胶状,扫描电镜观察其内部结构。②细胞毒性试验：聚乙烯醇-胶原材料剪成10mm×5mm×1mm小片,γ射线消毒后,分别放入48孔平板中,每孔加入1×104个3T3细胞培养,扫描电镜观察细胞的生长状况。③体内埋植试验：将实验兔背部脊柱两侧各作2个纵切口,形成皮下腔隙。分别于手术形成的皮下腔隙植入4块聚乙烯醇-胶原材料,分别于术后1,4,8周各取3只实验共9块标本及其周围组织作病理观察。主要观察指标：扫描电镜观察凝胶膜内部结构、细胞毒性试验及体内埋植试验结果。结果：①聚乙烯醇-胶原材料内部结构：真空冷冻干燥的聚乙烯醇-胶原为白色的凝胶,扫描电镜见其表面和切面内部有贯通的三维孔隙。②细胞毒性试验结果：3T3细胞在PVA-胶原材料上能三维生长、形态正常。③体内埋植试验结果：聚乙烯醇-胶原植入1周后,产生了正常的异物反应,材料与组织界限分明。4周后,只见极少量淋巴细胞浸润,大量的纤维母细胞增生形成胶原纤维和假单层立?     

成年兔雪旺细胞与医用组织引导再生胶原膜联合培养后植入体内的实验研究

目的：探索用组织工程方法构建人工神经的可行性。方法：应用医用组织引导再生胶原膜作为支架与成年兔雪旺细胞培养2周,以雪旺细胞胶原膜复合物的形式修复自体神经缺损,8周后对所获得的组织工程神经移植物进行形态学研究。结果：成年兔雪旺细胞在医用组织引导再生胶原膜上生长良好并均匀分布于支架表面,形成bungner带,且基质分泌旺盛,神经已通过移植物长入远端,胶原膜已吸收,结论：雪旺细胞可以在医用组织引导再生胶原膜上得到扩增,形成的三维立体结构具有人工神经的基本特性,本研究为组织工程方法修复长段神经缺损打下基础。     

激活态许旺细胞在胶原几丁糖膜上的生长规律

背景新型组织工程材料和许旺细胞扩增后置入生物合成管内去修复周围神经的缺损,是人工生物材料管的两大进展.目的以胶原几丁糖为支架,以激活态的许旺细胞为种子细胞,观察二者的亲和性以及激活态的许旺细胞在胶原几丁糖膜上的生长规律,为人工神经的预构做准备.设计开放性实验.单位复旦大学附属华山医院手外科.材料实验于2003-07/2003-12在卫生部手功能重建重点实验室完成.选取清洁级雄性SD大鼠4只.胶原几丁糖膜(上海其胜生物材料技术研究所提供),许旺细胞激活液(自制).方法大鼠麻醉后坐骨神经切断预变性7 d,再次麻醉后引颈处死,迅速切取双侧坐骨神经,置于含青霉素和链霉素的D-HANK'S液中,剔除神经外膜,剪碎成1 mm的小段,移入盛有质量浓度为5g/L的胰蛋白酶和0.6g/L的胶原酶的离心管中,每2 mL液体中加入激活液0.5 mL,复合酶分步消化法获激活态许旺细胞,以浓度为2×107 L-1激活态的许旺细胞200 μL接种于胶原几丁糖膜上和培养皿上,2周后通过相差显微镜和扫描电镜观察细胞生长情况,S-100染色鉴定细胞的纯化程度.主要观察指标①绘制细胞生长曲线,确定体外倍增时间.②激活态许旺细胞倒置相差显微镜下观察结果.③激活态许旺细胞接种于胶原几丁糖膜上扫描电镜观察结果.结果①体外倍增时间的确定激活态的许旺细胞接种于胶原几丁糖膜和培养皿上时的浓度均是2×107 L-1,2周后细胞浓度分别达到30×107 L-1和20×107 L-1.根据DT=(t-t0)lg2/(lgn-lgn0)算出激活态许旺细胞在胶原几丁糖膜上的倍增时间为4 d.②激活态许旺细胞倒置相差显微镜下观察结果接种于培养皿上的激活态许旺细胞24 h后大多数由圆球形变成长梭形,有突起,多为双极,也有的呈三极状;接种于膜上的激活态许旺外形上和培养皿中无明显差异,但膜上的激活态许旺细胞在相差显微镜下犹如"刻在沙地上的文字"一般.S-100染色见激活态许旺细胞成棕色,纯度达95%以上.③激活态许旺细胞接种于胶原几丁糖膜上扫描电镜观察结果激活态许旺细胞多数生长于胶原几丁糖膜的凹陷中或紧贴膜表面,呈有规律的首尾相接贴附于膜上,胞体呈纺锤形,直径在4～6 μm,长度为60～80 μm,细胞呈梭形,有许多细小分枝.1周时膜的形态仍然完整.结论胶原几丁糖膜和高度纯化的激活态许旺细胞有良好的亲和性,以其为工艺材料制成的组织工程支架很有可能在促进周围神经再生中发挥优势作用.