甘草酸合成生物学元件初探：甘草法呢基焦磷酸合酶基因的克隆及序列分析

甘草酸是中药甘草的主要有效成分,法呢基焦磷酸合酶（FPS）是甘草酸合成途径中关键酶之一。根据甘草转录组数据设计引物,对FPS 基因进行克隆,获得甘草FPS 基因的全长编码序列。甘草FPS 基因编码区全长1 029 bp,编码342 个氨基酸残基。将甘草FPS 基因与GenBank 中其他植物FPS 基因序列进行比对分析,发现其核酸序列与鹰嘴豆、苜蓿、蒺藜苜蓿、大豆、百脉根的序列相似度最高,分别达到94%、94%、93%、93%、92%。进一步的系统进化分析表明FPS 基因具有较高的保守性,其序列进化树与植物分类一致。     

三七法呢基焦磷酸合酶的基因克隆及序列分析

目的对三七法呢基焦磷酸合酶(FPS)进行基因克隆及序列分析。方法采用cDNA末端快速扩增法,以三七根总RNA为模板扩增出三七FPS基因。结果序列分析表明,所克隆的cDNA序列全长1 409 bp,开放阅读框共编码343个氨基酸残基,推测的氨基酸序列与积雪草、灰白银胶菊、黄花蒿的FPS的氨基酸序列同源性最高,分别达95%、87%、86%。结论首次分离并报道了三七FPS cDNA克隆,为进一步研究三萜皂苷生物合成机制及其在提高植物药用价值方面的应用奠定基础。     

甘草酸合成生物学元件初探：甘草法呢基焦磷酸合酶基因的克隆及序列分析＊

甘草酸是中药甘草的主要有效成分,法呢基焦磷酸合酶（FPS）是甘草酸合成途径中关键酶之一。根据甘草转录组数据设计引物,对FPS基因进行克隆,获得甘草FPS基因的全长编码序列。甘草FPS基因编码区全长1029 bp,编码342个氨基酸残基。将甘草FPS基因与GenBank中其他植物FPS基因序列进行比对分析,发现其核酸序列与鹰嘴豆、苜蓿、蒺藜苜蓿、大豆、百脉根的序列相似度最高,分别达到94%、94%、93%、93%、92%。进一步的系统进化分析表明FPS基因具有较高的保守性,其序列进化树与植物分类一致。     

濒危药用植物茅苍术法呢基焦磷酸合酶基因克隆及其表达分析

目的克隆茅苍术Atractylodes lancea倍半萜类成分生物合成关键酶法呢基焦磷酸合酶(FPPS)基因全长并分析其表达规律。方法以茅苍术总RNA为模板,运用同源克隆法和RACE技术克隆茅苍术FPPS基因(Al FPPS)的c DNA全长,并进行生物信息学分析;用q RT-PCR和GC-MS分析不同生长阶段FPPS在茅苍术根茎中的表达及倍半萜类成分量变化,并分析二者的相关性。结果获得Al FPPS基因全长c DNA为1 320 bp(Gen Bank accession no.KX443242),含一个长1 029 bp的开放阅读框,编码342个氨基酸,包含5个保守功能域,其中2个富含天冬氨酸(DXXDD)。q RT-PCR及GC-MS结果显示不同时期茅苍术Al FPPS基因表达量与倍半萜类成分量呈显著正相关。结论首次克隆获得Al FPPS基因的全长c DNA,初步证明Al FPPS基因是茅苍术倍半萜类成分生物合成途径中的重要调控位点,为茅苍术倍半萜类成分生物合成途径阐明与生物工程应用提供科学依据。     

温郁金法呢基焦磷酸合酶（CwFPPS）基因的克隆、亚细胞定位及表达分析

目的 克隆温郁金Curcuma wenyujin萜类生物合成中的限速酶法呢基焦磷酸合酶（farnesyl pyrophosphate synthase，FPPS）的全长cDNA序列。方法 根据温郁金转录组数据设计特异引物，PCR扩增FPPS全长cDNA序列并对其进行生物信息分析；构建"基因-GFP"融合表达载体，利用农杆菌介导烟草叶片进行亚细胞定位分析；实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测基因在植物组织中的特异性表达。结果 温郁金CwFPPS基因全长1196 bp，包含1个长为1071 bp的开放阅读框，编码356个氨基酸，GenBank登入号为MT489462；CwFPPS编码蛋白属于类异戊二烯生物合成酶超级家族（C1）成员，包含5个保守的功能域，其中2个是富含天冬氨酸（DDXXD）的活性中心；亚细胞定位显示该蛋白位于泡质、细胞膜或细胞核上。qRT-PCR分析表明，CwFPPS基因在根茎中特异表达，相对表达水平是叶片中的13.7倍。结论 克隆获得的温郁金CwFPPS基因全长及其特异表达信息，可为后续进行基因功能鉴定及倍半萜成分的代谢工程研究提供依据。     

罗汉果法呢基焦磷酸合成酶基因的克隆及其序列分析

目的 对罗汉果甜苷V生物合成途径的关键酶法呢基焦磷酸合成酶(Farnesyl pyrophosphate synthase,FPPS)基因的全长cDNA序列进行克隆,为研究罗汉果甜苷V生物合成与基因调控奠定基础.方法 根据植物FPPS基因保守功能域设计简并引物,通过PCR和RACE方法克隆罗汉果FPPS基因的全长cDNA.结果 获得罗汉果FPPS (SgFPPS)基因的全长cDNA序列共1354个核苷酸,包含一个1026核苷酸的开放阅读框架(open reading frame,ORF),cDNA编码的蛋白包含342个氨基酸,推断蛋白质相对分子质量为3.92×104.NCBI Blastx结果显示,SgFPPS基因编码的蛋白与苹果树来源FPPS具有最高同源性,氨基酸一致度达85.1％.SgFPPS具有异戊烯基转移酶的5个典型保守功能域.进化树分析结果显示,SgFPPS基因与苹果树的FPPS具有较近的亲缘关系.结论 首次克隆SgFPPS基因的全长cDNA序列,为分析SgFPPS基因表达特性及其在罗汉果甜苷V生物合成中的功能奠定基础.     

丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶基因的克隆与分析

目的:获得丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶基因(GGPS),并进行生物信息学分析和初步的表达特性研究.方法:根据GGPS蛋白序列保守区域设计简并引物,利用同源扩增和cDNA末端快速扩增技术从丹参根中获得目的基因;利用BLAST进行序列比对,ORF Finder寻找开放阅读框,Prosite分析蛋白质的基本结构域,Target P 1.1分析信号肽序列,MEGA4.0比对已有GGPS蛋白序列,并构建进化树;用半定量RT-PCR检测其在丹参子叶期根、叶和花期根、茎、叶、花蕾、花中的表达情况;设计特异引物,从丹参基因组DNA中扩增,获得编码完整的GGPS基因,初步分析该基因结构.结果:得到1条长1298 bp的GGPS cDNA序列,其ORF框长1 095 bp,编码1段含有52个氨基酸质体定位信号肽的364个氨基酸序列,具有多聚异戊二烯基合成酶的特异序列,与已报道的GGPS基因有60%以上的同源性;RT-PCR半定量分析表明该基因在所分析的各组织中均有表达,尤以花期叶片中的表达最强;基因结构分析表明该基因有1个397 bp的内含子.结论:首次得到丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶基因,为其功能研究提供了基础.     

膜荚黄芪苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与序列分析

目的对膜荚黄芪苯丙氨酸解氨酶基因进行克隆及序列分析。方法应用RT-PCR和cDNA末端快速扩增法,以膜荚黄芪根总RNA为模板克隆PAL基因。结果所克隆的膜荚黄芪苯丙氨酸解氨酶基因命名为AmPAL,Genbank登录号为EF567076。序列分析表明,AmPAL全长为2650bp,含有一个完整的2154bp开放读码框。AmPAL是植物苯丙氨酸解氨酶家族的一个新成员,推测其编码718个氨基酸的多肽,相对分子质量为7.805×104,等电点为5.96,与豆科植物已知的PAL氨基酸序列的同源并且相似性都大于80%。结论首次成功地从膜荚黄芪中克隆出了PAL基因,为有效利用该基因调控药用植物苯丙烷代谢途径奠定了基础。     

红树林植物杯萼海桑法呢基焦磷酸合酶的基因克隆及序列分析

目的 对杯萼海桑Sonneratia alba萜类化合物生物合成途径的关键酶法呢基焦磷酸合成酶(Farnesyl pyrophosphate synthase,FPS)基因的编码cDNA序列进行克隆,为研究杯萼海桑萜类化合物生物合成与基因调控奠定基础.方法 结合杯萼海桑根的转录组注释,根据编码区序列设计引物,通过PCR方法克隆杯萼海桑FPS (SaFPS)基因的编码区cDNA.结果 PCR扩增了一个长1 029 bp的基因片段,该片段编码由342个氨基酸组成的SaFPS.同源性比对结果显示基因编码蛋白与甘草的FPS具有氨基酸一致性达86％.其具有异戊烯基转移酶的2个典型保守功能域.进化树分析结果显示,与甘草Glycyrrhiza uralensis、苜蓿Medicago truncatula、羽扇豆Lupinus albu具有较近的亲缘关系.实时荧光定量PCR结果显示SaFPS基因在花中表达量较高,果实、茎、叶中表达量相对较低.结论 首次从红树林植物杯萼海桑中克隆FPS基因获得其编码区序列,SaFPS基因具有组织表达特异性.本研究为分析基因表达特性及其在生物合成中的功能奠定基础.     

刺五加法尼基焦磷酸合酶基因的克隆、 生物信息学及表达分析

目的:克隆刺五加的法尼基焦磷酸合酶(farnesyl diphosphate synthase,FPS)基因,并对其进行生物信息学和表达分析.方法:采用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆刺五加FPS基因的全长cDNA序列.运用生物信息学方法对该基因进行分析,预测其编码蛋白的结构与功能.并通过RT-PCR法检测FPS在不同器官中的表达情况.结果:刺五加FPS基因的cDNA全长为1 499 bp,开放阅读框长1 029 bp,编码342个氨基酸的蛋白,包含2个富含天冬氨酸(DDXXD)的保守功能域.FPS蛋白无跨膜区域,定位于细胞质中.RT-PCR的结果显示,刺五加FPS基因在各器官中均有表达,但表达最具有显著差异(P＜0.05).结论:首次分离并报道了刺五加FPS的cDNA克隆,并证实其在不同器官中的表达量不同,为进一步研究FPS对刺五加皂苷合成的影响和表达调控奠定了基础.     

膜荚黄芪化学成分研究

目的研究膜荚黄芪Astragalus membranaceus根的化学成分。方法采用硅胶、ODS、聚酰胺、Sephadex LH-20等柱色谱方法对化合物进行分离,运用核磁共振波谱方法鉴定化合物的结构。结果从膜荚黄芪根的乙醇提取物中分离得到23个化合物,包括14个黄酮类化合物:2′-methoxyisoliquiritigenin(1)、刺甘草查耳酮(2)、甘草查耳酮B(3)、3′,4′,7-trihydroxyflavone(4)、4′,7-dihydroxyflavone(5)、3′,7,8-trihydroxy-4′-methoxyisoflavone(6)、毛蕊异黄酮(8)、芒柄花素(9)、2′,4,4′-trihydroxychalcone(10)、pendulone(11)、liquiritigenin(12)、pratensein(13)、毛蕊异黄酮苷(14)、芒柄花苷(15),8个三萜皂苷类化合物:黄芪甲苷(16)、cyclocanthoside E(17)、异黄芪皂苷II(18)、黄芪皂苷II(19)、黄芪皂苷III(20)、异黄芪皂苷I(21)、brachyoside B(22)、cycloaraloside A(23)及1个苯丙酸类化合物:4-hydroxycinnamic acid(7)。结论化合物1~7为首次从该属植物中分离得到。     

枸骨法尼基焦磷酸合酶IcFPS2基因克隆与原核表达分析

目的 克隆枸骨Ilex cornuta三萜皂苷生物合成途径中关键酶法尼基焦磷酸合酶（farnesyl diphosphate synthase,FPS）基因,对其进行组织特异性表达分析,构建原核表达载体并进行重组蛋白诱导表达,探究其参与调控三萜皂苷生物合成的功能。方法 结合枸骨转录组数据设计特异性引物,采用PCR技术从枸骨叶中扩增得到了IcFPS2基因的c DNA序列,对其进行生物信息学分析;通过实时荧光定量进一步分析其组织表达特异性,构建原核表达载体pET32a-IcFPS2,并转化至大肠杆菌E. coli BL21(DE3)pLysS感受态细胞,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组蛋白的表达。结果 IcFPS2基因长1259 bp,开放阅读框为1050 bp,编码350个氨基酸,其蛋白质相对分子质量和等电点分别为40 200、5.54。氨基酸序列比对分析表明枸骨与栀子、杜仲、甘草、绞股蓝、竹节参的FPS氨基酸序列具有较高的同源性。系统进化树分析显示,IcFPS2蛋白与西洋参、人参、竹节参FPS蛋白聚为一支,表明枸骨FPS蛋白可能与双子叶植物五加科FPS蛋白在功能上较为...     

刺五加功能基因密码子偏好性的分析

目的 分析刺五加功能基因密码子的使用方式及其影响因素.方法 以刺五加的17条功能基因为材料,利用CodonW和SPSS软件进行多元统计分析和对应性分析.结果 刺五加功能基因密码子3个位置的GC量依次为51.03％、41.23％和40.04％,三者均与整个编码区的GC量显著相关(P＜0.05),GC12与GC3的相关系数为0.262,未达到显著水平.同义密码子的相对使用频率大于1的密码子共27个,其中22个以A或T碱基结尾.对应性分析的结果表明,第1轴显示了22.78％的差异,与GC3、密码子适应指数和密码子偏好指数均极显著相关(P＜0.01),相关系数分别为0.786、0.686和0.617,与有效密码子数的相关性未达显著水平.第2轴显示了19.28％的差异,且仅与有效密码子数极显著相关(r=0.635).确定了刺五加功能基因的17个最优密码子.结论 刺五加的功能基因偏好使用以A或T碱基结尾的密码子,其使用模式受选择和突变的共同影响.     

川贝母转录组密码子使用偏好性分析

研究川贝母表达基因的密码子的使用模式,探讨其密码子使用偏好性特点,为运用基因工程技术实现贝母碱的异源生物合成提供理论依据。以川贝母转录组9 843条全长转录本序列为数据来源,使用Codon W软件对川贝母表达基因的密码子GC含量特点、有效密码子数和同义密码子相对使用频率各项参数进行计算、统计,分析发现,川贝母表达基因密码子偏好程度整体水平不高。该研究确定了15个密码子为川贝母最优密码子UUG,CUU,AUU,GUU,UCA,CCU,CCA,ACU,ACA,GCA,UAU,CAU,AAU,AGA和GGA,最优密码子偏好A/T结尾。计算结果显示26个川贝母生物碱合成相关基因中大肠杆菌和酿酒酵母稀有密码子所占比例较低。根据稀有密码子比例,逐个分析26个关键酶基因在大肠杆菌和酿酒酵母体系中表达时可采用的密码子优化方案。该研究为通过合成生物学手段异源合成川贝母生物碱奠定了前期研究基础。     

川西獐牙菜牻牛儿基焦磷酸合成酶基因的克隆及表达分析

目的从川西獐牙菜Swertia mussotii中克隆牻牛儿基焦磷酸合成酶(Sm GPPS)编码基因,并进行生物信息分析及该基因的表达研究。方法根据川西獐牙菜转录组Sm GPPS基因序列,设计特异性引物,通过RT-PCR扩增得到c DNA序列,通过生物信息对该序列进行分析;构建原核表达载体p ET-28a-Sm GPPS,转入大肠杆菌BL-21(DE3)中,在37℃、1 mmol/L IPTG诱导下进行表达。采用半定量RT-PCR方法检测Sm GPPS基因在川西獐牙菜不同组织中的表达强度。结果 Sm GPPS c DNA全长1 119bp,编码372个氨基酸。并对其蛋白二级、三级结构进行了分析和预测。Sm GPPS蛋白与其他植物中GPPS蛋白具有高度的相似性。SDS-PAGE结果表明所表达蛋白与预期蛋白大小一致。半定量RT-PCR结果表明Sm GPPS在叶中表达量最高。结论为进一步研究该基因的功能和利用基因工程手段提高川西獐牙菜中环烯醚萜类化合物产量提供了基础。     

恒山黄芪粉碎度与黄芪多糖得率关联度研究

目的 研究恒山黄芪粉碎度与黄芪多糖得率之间的关系.方法 采用超微粉碎机对恒山黄芪进行超细化处理并按不同粒度分组,比较各组别恒山黄芪在不同温度、不同料液比条件下,水法提取与CaO法提取黄芪多糖的得率.结果 恒山黄芪粉体粒度≥600目(破壁前),黄芪多糖得率同等粉碎度CaO法提取优于水法提取,≤800目(破壁后)得率趋于一致.无论是采用水法还是CaO法提取,恒山黄芪在粉碎粒度为800目时,选择提取温度80℃,料液比1∶8,黄芪多糖得率达到最高,分别为8.36％和8.49％.结论 恒山黄芪多糖得率与粉碎度存在关联性.     

香鳞毛蕨4CL基因密码子使用特性及表达预测分析

目的研究蕨类植物中4CL基因的表达与分析,为蕨类植物次级代谢产物的积累和调控奠定理论基础。方法运用CHIPS、CUSP和Codon W在线程序对自主克隆的香鳞毛蕨4CL基因(Df4CL)序列进行分析,并与大肠杆菌、酵母菌、拟南芥、烟草等基因进行比较,对了解Df4CL基因密码子使用特性,为其选择合适的表达系统具有重要意义。结果 Df4CL基因对ATGC选择没有偏向性,并且与小立碗藓的密码子使用偏好性相一致。在密码子使用频率上,Df4CL基因与拟南芥的差异小于与烟草、大肠杆菌、酵母的差异;基于4CL基因的密码子使用偏性的系统聚类分析表明,香鳞毛蕨与小立碗藓、拟南芥聚为一类。结论预示Df4CL基因更适合在拟南芥中外源表达。