2种类型膜荚黄芪主要药效成分含量及关键酶基因表达量差异研究

目的以2年生2种类型膜荚黄芪Astragalus membranceus(绿茎有毛膜荚黄芪、紫茎有毛膜荚黄芪)根、茎、叶为实验材料,探究其主要药效成分含量及其生物合成途径中关键酶基因表达量的差异,为药材膜荚黄芪资源合理利用及其优良品种选育选育提供科学的理论参考。方法使用HPLC检测膜荚黄芪根、茎、叶中黄芪甲苷与毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量,使用紫外分光光度计检测膜荚黄芪根、茎、叶中总皂苷含量,采用实时荧光定量PCR检测其根中皂苷生物合成过程中关键酶乙酰辅酶A乙酰基转移酶(AATC)、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶(HMGS)、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)、异戊二烯焦磷酸异构酶(IDI)、法尼基焦磷酸合酶(FPS)、鲨烯合酶(SS)、鲨烯环氧酶(SE)、环阿尔庭烷合酶(CAS)基因的表达量。结果紫茎膜荚黄芪根中黄芪甲苷含量始终高于绿茎膜荚黄芪;在生殖生长期时,绿茎膜荚黄芪根中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量高于紫茎膜荚黄芪,而枯萎期二者变化浮动较大;绿茎膜荚黄芪根中总皂苷含量普遍高于紫茎膜荚黄芪。AACT、FPS、HMGS基因表达量与绿茎膜荚黄芪总皂苷含量呈显著相关(P0.05),IDI基因表达量与总皂苷含量呈极显著相关(P0.01),说明这4个基因在绿茎膜荚黄芪总皂苷合成中具有重要影响;HMGR基因与紫茎膜荚黄芪总皂苷呈显著相关(P0.05),其他基因与紫茎膜荚黄芪皂苷含量均有相关性,但未达到显著水平。结论探究了2种类型黄芪3种主要药效成分的动态变化和皂苷类化合物关键酶基因的表达,为黄芪皂苷类化合物合成生理生态机制的明晰、膜荚黄芪资源合理利用及优良品种选育提供了科学的理论依据。     

黄芪皂苷生物合成对短期水分变化的响应

以一年生盆栽膜荚黄芪为材料,探究水分变化对膜荚黄芪根中总皂苷、黄芪甲苷含量及关键酶基因表达量的影响。测定其黄芪甲苷、总皂苷含量,采用实时荧光定量PCR分析黄芪皂苷合成途径中8个关键酶乙酰辅酶A乙酰基转移酶(AATC)、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶(HMGS)、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)、异戊二烯焦磷酸异构酶(IDI)、法尼基焦磷酸合酶(FPS)、鲨烯合酶(SS)、鲨烯环氧酶(SE)、环阿尔庭烷合酶(CAS)基因表达量。结果表明,随着土壤水分的下降,黄芪甲苷及总皂苷含量呈增加趋势,在第15天达到最高,分别为1.46,6.80 mg·g~(-1);膜荚黄芪中8个关键酶基因对水分调控的响应方式各不相同,AACT,IDI,SS基因呈现先升高后降低再升高,复水后降低的变化趋势,HMGS,HMGR,FPS基因呈现持续增加复水后下降的趋势,而SE,CAS基因呈现先增加再降低,复水后继续降低的趋势。相关性分析显示,处理组HMGR基因与总皂苷含量呈极显著正相关,CAS基因与总皂苷含量呈显著负相关;FPS,SE,CAS基因与黄芪甲苷含量呈极显著负相关系。因此,HMGR,FPS,SE,CAS基因在水分调控下对黄芪皂苷含量调控作用明显,是主要调控基因。处理第15天,黄芪甲苷和总皂苷总量达到最高,可以定为最佳采收期。     

蒙古黄芪叶绿体全基因组特征解析及亲缘性分析

目的 以蒙古黄芪Astragalus membranaceus var. mongholicus为材料,解析其叶绿体基因组的序列特征,并进行系统发育分析。方法 利用Illumina NovaSeq测序平台对蒙古黄芪叶绿体全基因组进行测序,完成其组装、注释、特征分析,构建系统发育树。结果 蒙古黄芪叶绿体基因组全长为123 349 bp,GC含量为34.09%,由于缺失反向重复IR区,Circos图呈现出非典型四分体结构,属于IRLC群体。获得注释基因109个,其中蛋白编码基因76个,rRNA基因4个,tRNA基因29个。蒙古黄芪叶绿体基因组的密码子偏好性较弱,密码子偏向使用A碱基和U碱基。MISA检测出263个SSR位点,以A/T重复为主;叶绿体全基因组比较分析可知17种豆科植物叶绿体基因组的基因区间组成差异较小;但trnF-GAA～trnTUGU、trnfM-CUA～psbC、trnE～trnD、psbM～rpoB、ycf1和ycf2等编码区存在差异性;系统发育树显示,蒙古黄芪与胶黄芪A. gummifer聚为一类,与阿纳卡黄芪A. nakaianus、膜荚黄芪A. membranac...     

膜荚黄芪苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与序列分析

目的对膜荚黄芪苯丙氨酸解氨酶基因进行克隆及序列分析。方法应用RT-PCR和cDNA末端快速扩增法,以膜荚黄芪根总RNA为模板克隆PAL基因。结果所克隆的膜荚黄芪苯丙氨酸解氨酶基因命名为AmPAL,Genbank登录号为EF567076。序列分析表明,AmPAL全长为2650bp,含有一个完整的2154bp开放读码框。AmPAL是植物苯丙氨酸解氨酶家族的一个新成员,推测其编码718个氨基酸的多肽,相对分子质量为7.805×104,等电点为5.96,与豆科植物已知的PAL氨基酸序列的同源并且相似性都大于80%。结论首次成功地从膜荚黄芪中克隆出了PAL基因,为有效利用该基因调控药用植物苯丙烷代谢途径奠定了基础。     

黄芪的临床应用

黄芪,为豆科植物蒙古黄芪及膜荚黄芪的干燥根,始载于《神农本草经》,为上品。清代吴其浚《植物名实图考》说：黄芪“有数种,山西、蒙古产者佳”。也即是说,除山西沁州绵上外,内蒙古产的黄芪也为道地药材。据现代药理研究证明,黄芪含皂苷类、多糖类等多种有效成份。其中皂苷类以黄芪甲苷为主,并含乙苷和丙苷等。还有黄酮类及黄芪多糖、多种氨基酸等。由于黄芪主产于北方,故现代中医处方,多写为“北芪”。     

海拔高度对蒙古黄芪主要药效成分积累及其关键酶基因表达量影响研究

目的研究不同海拔高度与蒙古黄芪Astragalus membranaceus var. mongholicus主要药效成分含量及其关键酶基因表达量之间的关系。方法采用HPLC法检测黄芪根中黄芪甲苷与毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量,采用实时荧光定量PCR法检测黄芪甲苷生物合成过程中关键酶基因乙酰辅酶A乙酰基转移酶[AACT,acetoacetyl-co zymeA (CoA)thiolase]、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶(HMG-CoAsynthase, HMGS)、 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶[3-hydroxy-3-methylglutarylcoenzymeA(HMG-Co A)reductase,HMGR]、异戊二烯焦磷酸异构酶(iso-pentenyldiphosphateisomerase,IDI)、法尼基焦磷酸合酶(farnesyldiphosphatesynthase,FPS)、鲨烯合酶(squalenesynthase,SS)、鲨烯环氧酶(squaleneepoxidase,SE)、环阿尔庭烷合酶(cycloartenolsynthase,CAS)基因的表达量。结果 4个样地中样地HQ-2(内蒙呼和浩特可可以力更镇)中黄芪甲苷含量、毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量及总皂苷含量普遍高于其他样地;相关性分析表明,海拔高度对黄芪总皂苷合成的影响较大,IDI、SE和SS基因在黄芪总皂苷的合成过程中起主要作用,海拔高度有利于IDI、SE和SS基因的表达,海拔高度对黄芪皂苷合成途径中关键酶基因具有一定的调控作用。结论在处于海拔1730m左右的地区种植蒙古黄芪有利于其药效成分的积累。     

黄芪质量的化学模式识别研究

目的 建立黄芪质量评价的化学模式识别方法。方法 用甲醇回流提取黄芪中皂苷类成分，以氯仿—甲醇—水(65：30：10)为展开剂，采用双波长薄层扫描法，在λR＝390nm，λR＝590nm下，对18个产地的黄芪样品进行了定量分析，以黄芪甲苷为指标成分，用系统聚类分析对其进行了化学模式识别研究。结果 蒙古黄芪和膜荚黄芪中的黄芪甲苷含量较高，这与《中华人民共和国药典》2000年版将蒙古黄芪和膜荚黄芪列为正品相一致。结论 此方法可用于黄芪质量评价。     

黄芪及其民间习用品DNA指纹图谱和有效成分含量的比较

 目的比较2000年版药典收载黄芪品种及其民间习用品的DNA指纹图谱和有效成分黄芪甲苷、总黄酮及总多糖的含量,对黄芪质量标准进行多维研究。方法RAPD法确定DNA指纹图谱,HPLC-ELS测定黄芪甲苷的含量,比色法测定总黄酮的含量,硫酸-苯酚法测定黄芪总多糖的含量。结果DNA指纹图谱分析表明膜荚黄芪、蒙古黄芪和梭果黄芪有着较近的遗传关系,而另外3种黄芪,即苦黄芪、黑毛多枝黄芪和直立黄芪有非常近的亲缘关系。有效成分含量的测定结果证实,黑毛多枝黄芪、直立黄芪中黄芪甲苷的含量高于膜荚黄芪和蒙古黄芪;总黄酮的含量以梭果黄芪最高;总多糖的含量以蒙古黄芪最高。结论对民间使用的黄芪品种进行多维质量研究,为开发黄芪的药用资源提供理论依据。     

仿野生与平栽蒙古黄芪中黄芪甲苷含量差异的分子机制研究北大核心CSCD

系统比较分析不同生长年限下仿野生与平栽蒙古黄芪中黄芪甲苷的含量差异及其生物合成相关基因的表达情况,筛选出影响上述黄芪甲苷含量差异的关键酶基因。采用高效液相色谱(HPLC)进行黄芪甲苷含量测定;基于Illumina HiSeq和PacBio高通量转录组测序已构建的蒙古黄芪转录组数据库(RNA-Seq),筛选出与上述黄芪甲苷含量差异相关的酶基因,进行荧光定量PCR(RT-qPCR)验证,并对相关酶基因的RNA-Seq与RT-qPCR结果进行相关分析和趋势分析。发现一至四年生仿野生黄芪(IWA)与一至二年生平栽黄芪(CA)中黄芪甲苷含量变化趋势与RNA-Seq、RT-qPCR基因变化趋势相同,其中二年生IWA较一年生呈下降趋势,三年生IWA较二年生呈上升趋势,四年生IWA较三年生呈下降趋势,且一年生CA高于二年生。另五年生IWA的黄芪甲苷含量高于六年生,与RNA-Seq、RT-qPCR结果不同。该文初步阐明一至四年生IWA与一至二年生CA的黄芪甲苷含量差异与其合成途径中的上中游基因(MVK、CMK、PMK、MVD、SS)紧密相关,该结果将对黄芪药材生产种植实践有积极的指导意义。     

膜荚黄芪3个苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与表达分析

目的克隆膜荚黄芪苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因家族成员,分析它们在不同组织中的表达模式与毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量变化,为揭示膜荚黄芪毛蕊异黄酮葡萄糖苷积累的分子机制提供理论依据。方法以膜荚黄芪总RNA为模板,采用同源克隆法和RACE技术克隆PAL基因并进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR技术测定PAL基因在根、茎、叶中的表达量;采用HPLC法测定了根、茎、叶中的毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量。结果从膜荚黄芪中克隆了3个PAL基因Am PAL1、Am PAL2、Am PAL3,Genbank登陆号分别为KY086279、KY086280、KY086281。Am PAL1、Am PAL2和Am PAL3的全长c DNA长度分别为2 508、2 401、2 498 bp,均含有2 157 bp的完整开放阅读框,编码718个氨基酸。蛋白质序列分析表明,它们均含典型的PAL酶活中心序列,与植物PAL蛋白同源,且与同属于豆科的植物PAL蛋白相似性最高。系统进化树表明,Am PAL1与Am PAL2和Am PAL3聚为不同的亚类。实时荧光定量PCR分析发现,这些基因在根、茎、叶中表达模式不同,在检测的所有组织中Am PAL1的表达量最高、Am PAL2的表达量次之、Am PAL3的表达量最低,只有Am PAL2的表达水平与毛蕊异黄酮葡萄糖苷积累变化一致(即根茎叶)。结论从膜荚黄芪中克隆的Am PAL1、Am PAL2和Am PAL3是典型的PAL基因家族成员,推测它们在膜荚黄芪各组织发育过程中起着不同的作用,且Am PAL2可能参与了毛蕊异黄酮葡萄糖苷的积累。     

长春花密码子使用偏好性分析

以长春花为研究对象,分析其密码子使用偏好性,以期为相关基因的异源表达、基因的预测、物种的进化研究提供指导。该研究以长春花的30 437条蛋白质编码序列为数据来源,对长春花密码子组成和密码子偏性的各项参数进行了计算和统计分析。计算了长春花萜类吲哚生物碱(terpenoid indole alkaloids,TIAs)生物合成途径中25个关键酶基因含有大肠杆菌或酿酒酵母稀有密码子的比例。结果显示,长春花基因的平均GC量为42.47%,密码子第3位碱基平均GC量为35.89%。长春花中共有28个密码子的同义密码子相对使用度(relative synonymous codon usage,RSCU)大于1,其中26个以A或T结尾。25个关键酶基因含有大肠杆菌稀有密码子的比例明显高于酿酒酵母稀有密码子的比例。长春花主要偏爱使用以A和T结尾的密码子;相比于酿酒酵母,其密码子使用特点与大肠杆菌的差异更大,推测酿酒酵母可能是长春花基因更合适的异源表达宿主。     

芍药Actin基因在大肠杆菌中的高效表达

目的构建芍药Paeonia lactiflora Actin(Pl Actin)基因原核表达载体,优化Pl Actin基因在大肠杆菌中的高效表达体系。方法基于Pl Actin基因c DNA序列及原核表达载体p ET-32a(+)多克隆位点序列,设计一对5’末端分别插入Bam H I和Hind III酶切位点的特异性PCR引物,基于RT-PCR技术亚克隆Pl Actin基因;用Bam H I和Hind III双酶切重组质粒p MD18-T-Pl Actin和原核表达载体p ET-32a(+),胶回收纯化目的基因和空载体,连接、转化后应用菌落PCR、质粒PCR和双酶切鉴定出重组子p ET-32a(+)-Pl Actin,转化BL21(DE3)菌株获得基因表达工程菌;分别设置诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度梯度、诱导的菌体起始密度梯度及表达时间梯度,诱导Pl Actin基因在大肠杆菌中表达,SDS-PAGE电泳、考马斯亮蓝R250染色后制备干胶并比较重组Actin蛋白的表达量。结果亚克隆测序结果表明Pl Actin与目的序列完全一致,且其编码区序列(CDS)上下游成功插入了Bam H I和Hind III酶切位点;成功构建了芍药原核表达载体p ET-32a(+)-Pl Actin;诱导剂IPTG的最佳浓度为0.1 mmol/L,诱导的菌体起始密度(A600)为0.4~0.6,最佳表达时间为4 h。结论构建了Pl Actin基因原核表达载体p ET-32a(+)-Pl Actin,建立了Pl Actin基因在大肠杆菌中的高效表达体系。     

刺柏属4种药用植物叶绿体基因组密码子偏好性分析

目的 明确刺柏属圆柏Juniperus chinensis、垂枝香柏J.pingii、昆明柏J.gaussenii和铺地柏J.procumbens4种药用植物叶绿体基因组密码子的使用偏好性及影响其密码子偏好性的因素。方法 利用CodonW、CUSP、SPSS等软件对4种刺柏属药用植物叶绿体基因组密码子偏好性进行分析。结果4种刺柏属药用植物叶绿体基因组密码子的GC含量在35.8%～37.3%,有效密码子数（effective number of codon,ENC）值在47.10～47.79,表明其密码子偏好性较弱。中性绘图、ENC-plot、PR2-plot分析表明影响4种刺柏属药用植物叶绿体基因组密码子使用偏性的因素有选择和突变。同时利用相对同义密码子使用度（relative synonymous codon usage,RSCU）值和ENC值筛选出共65个最优密码子,其中有9个密码子为4种刺柏属植物共有的最优密码子。结论 4种刺柏属药用植物密码子偏好使用A/T结尾,其密码子使用偏性主要受到自然选择的影响。通过对4种刺柏属植物叶绿体基因组密码子的使用偏性进行分析及外类群聚类分析验证,揭示影响其密码子使用偏性的主要因素,为后续刺柏属叶绿体基因组外源蛋白表达载体的构建及优化提供理论依据。     

黄芪生态型与品质的相关性研究

目的测定鞭杆芪、直根芪、二叉芪和鸡爪芪4种生态型黄芪中黄芪甲苷及黄酮类成分的量,分析生态型与质量之间的相关性。方法采用超高效液相色谱(UPLC)法测定黄芪中黄酮类及黄芪甲苷量。对所测数据进行主成分分析(PCA)和聚类分析(CA)。结果 4种生态型黄芪的黄酮类成分及黄芪甲苷量高低顺序为鞭杆芪>直根芪>二叉芪>鸡爪芪;PCA分析结果表明4种生态型黄芪彼此可以很好地区分;CA结果显示直根芪与鞭杆芪聚为一支,表明直根芪与鞭杆芪质量相近,较好;而二叉芪与鸡爪芪聚为一支表明两者质量相近,较差。结论 4种生态型黄芪的质量优劣顺序鞭杆芪>直根芪>二叉芪>鸡爪芪,黄芪的质量与生态型紧密相关。     

蒙古黄芪和膜荚黄芪水溶性蛋白表达

目的:蒙古黄芪和膜荚黄芪都为药用黄芪,二者亲缘关系近,成分相似,药用价值尚未区分。该研究旨在建立蒙古黄芪和膜荚黄芪的水溶性蛋白表达谱,了解两种黄芪之间存在的差别。方法:样品采用水超声提取和丙酮沉淀的方法得到黄芪水溶性蛋白成分,质谱级胰酶酶解后的肽段经nano ESI-LC-MS/MS分析,采用Proteome Discoverer 1. 4软件比对豆科蛋白数据库鉴定蛋白,再使用非标记定量软件SIEVE分析蒙古黄芪与膜荚黄芪水溶性蛋白质表达的差异。最后运用生物信息学方法分析2种黄芪共有蛋白的分类、分子功能、参与的生物过程和信号通路。结果:蒙古黄芪鉴定特异性蛋白有920个,膜荚黄芪鉴定的特异性蛋白有717个,2种黄芪中共同表达的蛋白有472个,其中二者的差异表达蛋白有21个,如PR-10蛋白,NDK-1蛋白,谷蛋白A2,磷脂酶D等蛋白在两种黄芪中差异表达。蒙古黄芪高表达蛋白14个,膜荚黄芪高表达蛋白7个。结论:蒙古黄芪和膜荚黄芪的水溶性蛋白表达谱存在显著差异,特异性蛋白、差异表达蛋白和共同表达的蛋白可为今后两种黄芪的鉴别、药理作用机制的研究和寻找作用靶点提供参考。     

基于荧光定量PCR技术的当归不同炮制品中大肠埃希菌数量测定方法开发及比较研究

目的对当归不同炮制品中大肠埃希菌变化进行定量分析。方法建立荧光定量PCR方法,对当归不同炮制品、不同产地、不同收集企业、不同储藏时间的大肠埃希菌进行定量分析。结果不同炮制品中大肠埃希菌数量变化为生当归>土炒当归>酒当归;在不同产地的当归中以甘肃岷县地区所含的大肠埃希菌的数量最少;与零售企业相比,生产销售企业的当归和酒当归中大肠埃希菌的数量较少;不同储藏时间对当归和酒当归中大肠埃希菌数量有一定影响,随储藏时间的增加,大肠埃希菌的数量也在增加。对部分代表性样品进行平板计数法与荧光定量PCR法比较时发现,平板计数法结果多呈阴性,荧光定量PCR结果均呈阳性。结论所建立的荧光定量PCR法特异性、灵敏度、可靠性以及报告周期均优于平板计数法,可为当归不同炮制品中大肠埃希菌的快速、准确定量检测提供有效手段。     

基于流式细胞术和K-mer分析的黄芪基因组大小估测

目的使用流式细胞术与K-mer分析估测黄芪基因组的大小及复杂程度,为黄芪基因组测序奠定基础。方法以番茄为内标,用流式细胞仪测定经碘化丙啶(PI)染色的番茄细胞核和黄芪细胞核混合样品的PI荧光强度,通过比较黄芪与番茄细胞DNA含量峰值的倍数关系,计算黄芪的基因组大小。采用高通量测序技术进行黄芪基因组调查测序,利用生物信息学方法估计黄芪杂合率、重复序列和GC含量等信息。结果采用流式细胞术测得黄芪基因组大小约为1 426 Mb。通过基因组调查测序,获得了95 Gb黄芪基因组DNA测序数据,K-mer分析表明黄芪基因组约为1 456 Mb,测序深度为39×。K-mer分布曲线有明显的杂合峰,基因组杂合率为2.1%。结论黄芪基因组大小为1.45 Gb左右,杂合率较高。这一结果可为黄芪基因组学研究提供参考。     

忍冬属囊管组植物叶绿体基因组进化分析

目的 揭示忍冬属囊管组16种植物叶绿体基因组特征及系统发育关系。方法 以16种囊管组植物为研究材料,利用CodonW、EMBOSS、Excel等软件分析其叶绿体基因组密码子使用偏好性;利用IRscope、mVISTA、DNAsp进行叶绿体基因组比较分析;利用PhyloSuite基于最大似然法及贝叶斯法2种方法构建系统发育树。结果 结果显示ENC值为46.54～47.37,均大于35,密码子偏好性较弱。GC_all含量范围为38.92%～39.22%,均小于40%,具有明显的A/U偏好性,且GC₁＞GC₂＞GC₃,密码子第3位碱基以A/U为主。通过中性绘图、ENC-plot及PR2-plot分析,发现影响密码子使用偏好性的主要因素是自然选择。筛选出最优密码子7个,且密码子第3位均以A/U结尾。16种囊管组植物中均出现ycf1假基因。IR边界保守,差异较小。变异主要集中在非编码区,且单拷贝区域核苷酸多态性大于反向重复区域,存在更多的变异位点。系统发育分析结果显示,红花亚组与紫花亚组内物种系统发育位置与《中国植物志》存在差异。结论 揭示了影响忍冬属囊管组植物密码子偏好性的因素。结合叶绿体基因组比较分析,系统发育分析,有助于进一步理解忍冬属植物的进化和适应机制。