红花二氢吡啶二羧酸合酶基因片段的分离及表达分析

目的克隆红花Carthamus tinctorius赖氨酸合成途径关键酶二氢吡啶二羧酸合酶(dihydrodipicolinate synthase,DHDPS)基因并研究其在不同发育时期红花籽粒中的表达量。方法根据红花转录组文库注释信息筛选出与红花DHDPS(Ct DHDPS)基因相关的Unigenes,设计引物,以红花总RNA的反转录产物为模板,采用RT-PCR技术克隆Ct DHDPS基因片段,连接p EASY-T1克隆载体,经PCR和酶切鉴定,筛选阳性克隆并测序。同时利用荧光定量PCR技术对其在红花籽粒不同发育时期基因表达量进行分析。结果分离到长度为396 bp的Ct DHDPS基因片段,系统发育树分析表明该基因与其他物种的DHDPS基因具有较高的同源性。结论克隆了Ct DHDPS基因的核心片段,根据Ct DHDPS基因片段设计引物,对不同品种不同发育时期红花种子进行基因表达量分析,Ct DHDPS基因在红花品种川红1号初花后14 d表达量最高。     

红花黄酮醇合成酶基因片段的克隆及表达分析

目的克隆红花花瓣中的黄酮醇合成酶(flavonol synthase,FLS)基因并研究其在不同开花时期的表达量。方法根据红花花瓣转录组测序结果挑选FLS基因的设计引物,以红花花瓣总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增FLS基因片段并连接到PEASY-T1载体上,阳性克隆经PCR检测后进行测序。结果获得了224 bp的序列,将获得的序列在NCBI上进行Blast比对,该基因与其他物种的FLS基因具有较高的同源性。结论克隆了红花FLS基因中间片段,根据FLS基因片段设计引物,对红花不同品种不同开花时期进行荧光定量PCR分析,红花FLS基因在吉红油姊妹系的盛花期表达量最高。     

红花种子不同发育时期内参基因表达稳定性分析

目的通过qRT-PCR分析对比红花开花后不同发育时期的种子中内参基因的表达稳定性,筛选出红花种子成熟过程中最稳定的内参基因。方法应用实时荧光定量PCR技术,分析6个传统内参基因ACT、EF1α、GAPDH、UBI、TUA、TUB在红花种子不同发育时期的mRNA表达差异情况;利用GeNorm和Normfinder软件评价上述内参基因在红花开花后不同发育阶段的种子中的表达稳定性。结果荧光定量及GeNorm软件分析结果显示,6种内参基因的表达性各异,但表达最为稳定的内参基因是EF1α,表达最稳定的内参组合是EF1α和TUB。为了数据的真实可靠又选用了Normfinder软件分析,结果显示UBI基因表达不太稳定,EF1α、ACT、TUB、TUA和GAPDH内参的表达稳定性都小于0.15,相对比较稳定。结论为红花开花后不同发育时期种子的荧光定量PCR分析提供了详尽的内参基因参考。     

红花bHLH转录因子基因的克隆、表达分析及植物表达载体构建

克隆红花花瓣中bHLH(basic helix-loop-helix)基因,研究其在红花不同开花时期花瓣中的表达量并构建其植物表达载体。利用红花基因组测序结果中富集到的bHLH家族中的基因CtbHLH1的开放阅读框,设计特异性引物进行PCR扩增。利用RT-PCR法分析在红花不同开花时期花瓣中bHLH1基因的表达量,同时构建植物表达载体p BASTA-bHLH1。获得bHLH1基因全长897 bp,编码298个氨基酸。红花bHLH1与其他物种氨基酸具有一定的同源性,其与烟草的氨基酸序列相似性最高。实时荧光定量PCR分析表明,CtbHLH1基因在红花不同组织及不同开花时期的花瓣中表达水平具有显著差异,其在花瓣中表达量高,开花第3天表达量最高,末花期表达量低。另外其在根中有表达,在茎、叶中表达量极低。该研究成功地对bHLH1基因进行克隆及表达分析,并构建植物表达载体p BASTA-bHLH1。     

红花2-甲基-6-叶绿基-1,4-苯醌甲基转移酶基因的克隆及表达分析

目的克隆红花维生素E合成相关关键酶2-甲基-6-叶绿基-1,4-苯醌甲基转移酶(MPBQ MT)基因,并进行生物信息学及表达分析,为红花维生素E生物合成及调控机制研究奠定基础。方法根据红花种子转录组数据库中得到的中间序列,采用RT-PCR和RACE方法从红花种子中克隆MPBQ MT基因序列,通过生物信息学对该基因蛋白的特征进行分析,构建MPBQ MT与相关物种MPBQ MT的系统进化树,利用RT-PCR方法分析在红花种子不同发育时期MPBQ MT基因的表达量。结果MPBQ MT基因全长1 392 bp,命名为Ct MPBQ MT,具有完整的开放阅读框(ORF),共1 038 bp,编码345个氨基酸。生物信息学分析显示,该基因编码的蛋白理论相对分子质量约为38 900。保守结构域预测表明,该基因编码的蛋白具有典型的SAM蛋白功能结构域。结合其他物种的MPBQ MT基因构建系统树表明,红花MPBQ MT基因与其他物种氨基酸具有一定的同源性,其中与向日葵和生菜同源性高达89%和86%。实时荧光定量PCR分析表明,MPBQ MT基因在红花开花后50 d的种子中表达量最高。结论成功地对MPBQ MT基因进行克隆及表达分析,为红花维生素E合成及调控机制研究奠定基础。     

红花单功能反馈抑制敏感型CtAK1基因克隆、序列分析及表达载体构建

目的分离红花天冬氨酸代谢途径关键酶天冬氨酸激酶(AK)基因的全长cDNA序列,进行植物超表达载体构建。方法根据红花种了转录组文库注释和qRT-PCR鉴定的AK基因核心片段及表达分析数据,采用RACE技术获得红花AK(CtAK)基因的全长cDNA,利用DNA重组技术构建植物超表达载体。结果生物信息学分析表明,CtAK基因全长1 703bp,ORF区为1 626 bp,编码541个氨基酸残基,功能结构域分析推测,该基因可能为单功能反馈抑制敏感植物AK1。通过DNA重组技术成功构建以35 S为启动子和Bar抗性基因并含有叶绿体转运肽的pCAMBIA3301-CTP-AK1植物超表达载体。结论获得CtAK1基因的编码序列并构建植物超表达载体,为进一步研究其生物学功能及其在红花氨基酸代谢调控中的作用机制奠定基础。     

红花bZIP20转录因子基因的克隆、表达分析及植物表达载体构建

目的克隆红花花瓣中b ZIP20(Basic region/leucine zipper motif)基因,研究其在不同组织中的表达量并构建其植物表达载体。方法根据红花转录组测序结果挑选b ZIP基因的设计引物,以红花花瓣总RNA为模板,采用RT-PCR法扩增b ZIP20基因开放阅读框(ORF)片段,利用RT-PCR法分析在红花不同组织以及尖孢镰刀菌侵染后红花根部b ZIP20基因的表达量,同时构建植物表达载体p BASTA-b ZIP20。结果 b ZIP20基因ORF长981 bp,编码326个氨基酸(Gen Bank登录号为KT692605)。红花b ZIP20与其他物种氨基酸具有一定的同源性,其与芝麻、野茶树的氨基酸序列相似性高达85.41%和83.99%。实时荧光定量PCR分析表明,b ZIP20基因在不同组织中的表达水平具有显著差异,在花中呈现高表达,而在其他组织中低表达。接种尖孢镰刀菌的红花根部组织中b ZIP20基因的表达显著上调。结论成功地对b ZIP20基因进行克隆及表达分析,并构建植物表达载体p BASTA-b ZIP20。     

杭菊DFR基因克隆及其在花中表达特征分析

目的克隆杭菊Chrysanthemum morifolium二氢黄酮醇还原酶(dihydroflavonol 4-reductase,DFR)基因,并研究其在花芽分化期及开花期不同时期的表达特征。方法根据已报道的菊花Chrysanthemum morifolium DFR基因序列设计引物,通过荧光定量PCR(RT-PCR)技术从杭菊头状花序中扩增出目的基因片段,连接、转化、挑取阳性克隆测序并拼接;采用基于内参基因的相对定量PCR方法,分析该基因表达量特征。结果得到全长1 152 bp的杭菊DFR基因,最大开放阅读框1 029 bp,共编码342个氨基酸。NCBI上进行Blast比对,该基因与其他植物的DFR基因有很高的同源性。RT-PCR表明该基因在花芽分化时期不同阶段以及开花期不同时期花不同部位中表达量均有差异。花芽分化时期杭菊DFR基因在50 d表达量最高;开花期该基因在时期I的管状花中表达量最高,在时期II的花序托中表达量最低。结论克隆得到杭菊DFR基因c DNA序列,该基因表达存在时间和空间上的差异,表达量在花蕾膨大成熟到舌状花开放30%的时间段内最高。该结果为进一步进行该基因在杭菊中的表达与催化产物的关系和调控机制研究奠定了基础。     

太子参3个肌动蛋白基因片段的克隆与序列分析

目的克隆太子参肌动蛋白(Actin)基因片段并进行序列分析。方法利用植物Actin基因的保守序列设计简并引物,通过RT-PCR和抑制PCR扩增太子参Actin基因核心片段。利用半定量RT-PCR分析太子参Actin基因在不同种源、不同器官、不同生长发育时期的表达情况。结果通过RT-PCR获得3条太子参Actin基因的核心片段,长度均为760 bp,依次命名为PhACT1、PhACT2、PhACT3。通过抑制PCR及序列拼接后3条核心片段依次延长至1 008、1 008、975 bp,分别编码336、336、325个氨基酸残基。半定量RT-PCR分析表明PhACT2和PhACT3基因在不同种源、不同器官、不同生长发育时期的表达量基本恒定,PhACT1基因存在一定的差异。结论首次从太子参中克隆得到3条太子参Actin基因序列,并确定PhACT2基因适合作为太子参功能基因表达分析的内参基因。     

红花光调控信号途径关键基因CtHY5的克隆及表达分析

目的 以药用植物红花Carthamus tinctorius为研究对象,克隆光信号途径关键转录因子HY5基因,并对其进行生物信息学和表达模式分析,为红花HY5基因的功能研究提供参考。方法 以红花转录数据为参考,设计引物,采用PCR扩增方法从红花中克隆得到HY5的全长cDNA和DNA序列。运用生物信息学方法对该基因进行分析,预测编码蛋白的结构与功能,并通过荧光定量PCR方法检测CtHY5基因在红花不同组织及花发育不同时期的表达情况。结果 CtHY5基因的cDNA全长为462 bp,编码153个氨基酸,DNA全长为1941 bp,包含4个外显子和3个内含子。生物信息学分析表明,CtHY5为亲水性蛋白,定位于细胞核中。系统进化树及模体结构分析结果表明CtHY5与来自菊科的刺菜蓟、黄花蒿、薇甘菊、向日葵、莴苣中的HY5进化关系较近。定量分析表明,在白色红花和红色红花中,CtHY5基因均在花中表达量最高,其次为茎和苞片,在根中表达量最低。此外,除了根外,CtHY5基因在白色红花各组织中的表达量要明显高于红色红花。结论 首次从红花中克隆得到了光信号途径关键转录因子CtHY5基因,并研究了该基因在不同花色红花品系中的表达模式,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

调控红花类黄酮合成MYB转录因子基因克隆及表达分析

目的在红花Carthamus tinctorius中克隆调控类黄酮合成的MYB转录因子基因,通过序列及表达分析初步鉴定参与调控类黄酮合成的MYB转录因子基因。方法对已报道调控类黄酮合成MYB转录因子进行序列比对,设计简并引物克隆核心序列,采用RACE技术克隆MYB转录因子基因全长,利用生物信息学方法分析基因序列,采用半定量PCR分析基因在红花不同组织及不同花期的表达情况。结果克隆得到3个调控类黄酮合成候选MYB转录因子基因,命名为CtFRMYB1、CtFRMYB2及CtFRMYB3。序列全长分别为1 223、1 080、1 348 bp,蛋白质相对分子质量分别为17 878.15、28 766.45、27 987.89。序列分析表明3个转录因子都具DNA结合功能,属MYB转录因子家族。进化分析表明CtFRMYB1和CtFRMYB2同AtMYB12关系较近。表达分析表明CtFRMYB1和CtFRMYB2仅在花中表达且在花期3(开花第3天)表达量较高。结论成功克隆3个调控类黄酮合成候选MYB转录因子基因CtFRMYB1、CtFRMYB2及CtFRMYB3,经生物信息学及表达分析初步鉴定到2个调控红花类黄酮合成MYB转录因子基因CtFRMYB1及CtFRMYB2,为红花类黄酮合成的调控机制研究奠定基础。     

红花查耳酮异构酶基因植物表达载体的构建及拟南芥转化

目的构建红花查耳酮异构酶(CHI)基因的植物表达载体并在拟南芥中进行超表达验证该基因的功能。方法将已经分离的红花CHI基因作为目的基因,在其两端引入Bam H I和Eco R I酶切位点,构建含有35S启动子的植物超表达载体p BASTA-CHI,通过Flora-dip法将其转化到拟南芥中,并对转基因拟南芥T2代植株进行PCR和总黄酮量检测。结果转基因拟南芥T2代植株的PCR检测,红花CHI基因已经初步整合到拟南芥基因组中,黄酮量检测表明,转红花CHI基因的拟南芥比野生型拟南芥中的黄酮量有所提高,最高提高到2.3倍。结论成功构建了含有红花CHI基因的植物表达载体,并在拟南芥中进行超表达,获得了转基因拟南芥T2植株。     

桑黄肌动蛋白基因片段的克隆及序列分析

目的 对桑黄肌动蛋白(Actin)基因进行克隆及序列分析.方法 搜索网上已知数据库中Actin基因,与本实验室测得的桑黄转录组数据进行生物信息学比对,找到转录组数据中与Actin相似性最高的片段,并根据其设计引物,提取桑黄菌丝体总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增Actin基因片段并对PCR产物进行测序.结果 得到一段839 bp的序列,序列分析表明,该片段编码279个氨基酸,与其他物种Actin基因核苷酸序列同源性在87％以上.结论 首次从桑黄中克隆出了Actin基因,为有效利用该基因奠定了基础.     

红花转录因子CtMYB1基因的克隆及原核表达

目的 从红花Carthamus tinctorius 花瓣中克隆转录因子基因CtMYB1,并进行序列分析和原核表达载体的构建。方法 根据红花转录组测序结果中得到的高表达的Unigene123933序列,利用RT-PCR和RACE技术从红花花瓣中扩增得到CtMYB1基因的全长cDNA序列,并进行生物信息学分析;以CtMYB1基因的全长cDNA序列为模板,PCR扩增得到CtMYB1基因的开放阅读框(ORF)序列,构建原核表达载体pEASY-E1-CtMYB1。转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达。结果 成功从红花中克隆1个MYB基因,命名为CtMYB1,GenBank登录号为KJ524853。CtMYB1基因全长893 bp,ORF为750 bp,编码249个氨基酸。同时,成功构建了该基因的原核表达载体。SDS-PAGE结果显示该蛋白的大小约30 000,与预测的蛋白相对分子质量一致。结论 成功克隆了CtMYB1基因,构建了原核表达载体,初步证明该基因在大肠杆菌中成功表达。