端粒酶基因在人肿瘤组织中的表达

目的 探讨端粒酶基因表达与肿瘤恶性表型及其与端粒酶活性的关系;评价端粒酶基因表达检测在肿瘤诊断中的价值。方法 用原位杂交的方法检测端粒酶基因ｈＴＲ和ｈＴＲＴ在７８例人觉癌组织,２０例癌前病变,２８例良性病变中的表达及分布情况。结果 ７８例癌中ｈＴＲ阳性率为８５％（６６／７８）,ｈＴＲＴ阳性率为８２％（６４／７８）;在癌旁组织中ｈＴＲ、ｈＴＲＴ的表达阳性率分别为３％（２／７８）、５％（４／７８）;２     

人端粒酶hTERT抗体制备、鉴定及在肿瘤检测中的应用

目的：人端粒酶蛋白亚基（hTERT）单克隆抗体制备及肿瘤检测应用。方法：利用多肽固相合成法（Fmoc法）合成hTERT抗原多肽,免疫BALB／c小鼠,以杂交瘤法制备单克隆抗体。应用ELISA,Western blot和免疫组织化学ABC法进行鉴定和肿瘤检测。结果：经合成得到hTERT抗原多肽hTERT9,免疫小鼠及细胞融合后得到抗hTERT9杂交瘤细胞;经３次有限稀释法及ELISA筛选获得抗hTERT9单克隆抗体的杂交瘤细胞H4、G8和A11;H4、G8为IgM类,而A11为IgG1。半抗原竞争性抑制实验证明为hTERT9特异性单克隆抗体;相对亲和力实验发现G8株亲和力较H4株和A11株强。用H4及G8株单克隆抗体检测HeLa、293细胞,免疫印迹有特异相对分子质量≈123000hTERT条带,免疫组织化学显示为细胞核着色,而正常细胞2BS无阳性反应。免疫组织化学方法检测人癌组织、癌前病变、良性病变hTERT表达发现：人肿瘤组织细胞阳性率为80．31％（102／127）,且大多为中度阳性和强阳性;癌前病变中,hTERT有17．5％（7／40）弱阳性;良性肿瘤均为阴性。统计学分析表明：hTERT在癌组织的表达显著高于癌前及良性病变（P＜0．01）。结论：通过固相合成hTERT抗原多肽和杂交瘤技术成功制备抗人端粒酶蛋白亚基hTERT单克隆抗体,并能运用于免疫印迹、免疫组织化学对癌细胞及组织的hTERT表达检测。     

端粒酶hTR和hTRT在肿瘤中的表达及意义

目的 :探讨端粒酶hTR、hTRT基因表达在人肿瘤中的意义 ,并与 p5 3蛋白改变相比较 ,评估其对肿瘤临床诊断的价值。方法 :用原位杂交及免疫组化技术检测了 115例恶性肿瘤、6 0例良性及癌前病变中hTR和hTRT的表达 ,并与 p5 3基因蛋白改变相比较。结果 :hTR、hTRT在人恶性肿瘤中的平均检出率分别为 81%、83%。在转移性癌中两者均为 10 0 %的阳性率 ,而在慢性肝炎伴肝硬化中hTR、hTRT分别可见 5 0 %、6 0 %的弱阳性表达 ,其他良性病变及癌前病变均为阴性。p5 3蛋白在人恶性肿瘤中的平均阳性率为 4 9 6 % :在良性病变及癌前病变均为阴性。结论 :恶性肿瘤中hTR和hTRT明显高于 p5 3的检出率 ,且在良恶性病变中的表达差异有显著性 (P <0 0 5 ) ,并提示端粒酶hTR、hTRT与癌的生物学行为有密切关系 ,端粒酶基因hTR、hTRT的原位杂交检测可以作为一个比 p5 3更好的肿瘤诊断的新标记物。     

反义人端粒酶RNA对胃癌细胞生长的抑制效应

目的 探讨反义人端粒酶ＲＮＡ（ｈＴＲ）对胃癌细胞的生长抑制作用。方法 将反义ｈＴＲ真核表达载体经脂质体介导转染入胃癌细胞系ＳＧＣ７９０１,体外培养及接种裸鼠观察其基因转染细胞的细胞周期、超微结构变化、生长速率及致瘤性。结果 反义ｈＴＲ在潮霉素筛选的阳性克隆中稳定表达,正义ｈＴＲ表达下调,并出现凋亡改变。基因转染细胞体外传代培养的生长速率大多减慢,在裸鼠皮下的致瘤性明显降低。荷瘤鼠存活时间延长。结论     

RNA干扰人端粒酶逆转录酶基因抑制Hep-2细胞生长增殖的实验研究

目的探讨RNA干扰人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因对Hep-2细胞生长增殖的抑制作用及诱导凋亡作用。方法根据hTERTcDNA序列构建表达hTERTmRNA特异的、含荧光素基因的shRNA真核表达质粒pshRNA1、pshRNA2。随机选取一段与人类基因无同源性的碱基序列构建表达shRNA的含荧光素基因的质粒pshRNA3。构建不表达shRNA的含荧光素基因的对照质粒pshRNA4。实验分为5组:A(pshRNA1)、B(pshRNA2)、C(pshRNA3)、D(pshRNA4)、E(空白培养液)。酶切后电泳分析鉴定质粒pshRNA1~3。采用共聚焦显微镜检测质粒转染后细胞荧光表达情况;以蛋白印迹法研究hTERT表达变化;以TRAP-PCR ELISA法研究端粒酶活性变化;以四甲基偶氮唑盐(MTT)法、倒置相差显微镜及原位细胞凋亡法观察各质粒抑制细胞增殖及诱导凋亡作用。结果(1)质粒pshRNA1~3SalⅠ酶切后电泳见400bp小带,与预期插入的目的基因大小一致。共聚焦显微镜下见大量的细胞表达绿色荧光。(2)pshRNA1、2转染细胞后hTERT表达显著降低;细胞端粒酶活性明显受到抑制,A组细胞活性为:0·159±0·039、B组细胞活性为0·163±0·028、E组细胞活性为1·512±0·076。A、B组与E组比较,差异均有统计学意义(P<0·01)。(3)与E组细胞吸光度(A)值比较,A、B组细胞各时间点均减小,P值均小于0·01。同等培养条件下,A、B组脱落瓶壁的死亡细胞显著增多,凋亡率明显升高。结论(1)靶向hTERTmRNA的shRNA真核表达质粒能有效转染Hep-2细胞;(2)RNA干扰hTERT能显著地抑制Hep-2细胞的生长增殖并诱导细胞凋亡。     

应用端粒酶原位杂交技术检测大肠癌端粒酶活性

笔者利用国产端粒酶原位杂交检测试剂盒在大肠癌组织的石蜡切片中检测端粒酶活性 ,获得满意结果。现将应用该方法的体会简要介绍如下。1　材料与方法1.1　观察对象　手术切除的新鲜大肠癌组织 2 0例 ,对离体组织立即液氮冷冻 ,- 80℃冰箱保存。标本分为 2份 ,1份在做 5 μｍ厚连续冷冻切片 ;另 1份经 10 %中性福尔马林或4 %多聚甲醛固定 ,石蜡包埋 ,做 5 μｍ厚石蜡切片。1.2　试剂　 (1)端粒酶原位杂交检测试剂盒为武汉博士德公司产品 ,购自天津ＴＢＤ公司 ,编号ＭＫ115 9。端粒酶逆转录成分 (ＴＥＲＴ )来源于人基因ＴＥＲＴ ＮＭ 0 0 32 …     

鼻咽上皮癌变过程中端粒酶活性和端粒酶RNA的表达

目的 研究二亚硝基哌嗪（DNP）诱发大鼠鼻咽癌变过程中端料酶的表达规律。方法 以DNP诱导大鼠鼻咽癌：用PCR-ELISA和Nested RT-PCR检测DNP诱导大鼠鼻咽癌变不同阶段端粒酶活性和端料酶RNA的表达,同时作病理形态学检测。结果 DNP诱导大鼠鼻咽癌变过程中,端粒酶活性不断升高,端粒酶的变化与鼻咽癌变呈正相关,而且端粒酶中RNA表达先于端粒酶的表达。在大鼠鼻咽上皮细胞异型增生阶段即出现端粒酶的激活和端粒酶RNA的表达。结论 化学致癌物DNP诱导细胞癌变端粒酶的激活,且端粒酶的扩活和端粒酶RNA的表达是鼻咽上皮癌变的早发事件,与鼻咽癌的发生、发展有关。     

恶性肿瘤端粒酶逆转录酶基因的表达及调控研究进展

人端粒酶是一个核糖核蛋白,在大多数恶性肿瘤和永生化细胞中广泛表达.人端粒酶逆转录酶是端粒酶的关键催化亚单位,对端粒酶活性起重要的调控作用.端粒酶逆转录酶的表达水平与端粒酶活性密切相关,且端粒酶逆转录酶基因表达的调控方式是多因子,多水平和多途径的.     

DNA损伤剂诱导端粒酶调节相关hALP基因表达及作用研究

目的 确定端粒酶调节相关hALP基因对细胞DNA损伤的反应和作用。方法 以DNA损伤剂H2O2和顺铂处理人HeLa、Hep2细胞,运用定量逆转录-聚合酶链反应和免疫荧光观察hALP基因表达的改变,并以荧光素酶报告基因法测定hALP基因启动子活性变化。通过四甲基偶氮唑盐（MTt）法分析不同hALP基因表达状态下DNA损伤剂对细胞生长的影响。结果0．2～1．6mmol／L H2O2可诱导hALP mRNA水平升高,当浓度为0．4mmol／L时,hALPmRNA水平最高;以0．4mmol／L H2O2处理细胞6h即町观察到hALPmRNA水平显著升高,并在36h内保持高水平。顺铂处理细胞也可以上调hALP的mRNA表达,并呈一定的剂量和时间依赖性。免疫荧光检测发现：在0．2或0．4mmol／LH2O2、0．2或0．5μmol／L顺铂处理细胞12h后,hALP的表达水平升高,并且多聚集于细胞核。H2O2和顺铂处理细胞时可通过hALP基因启动子-705～＋20nt区域的序列上调其启动子转录活性。H2O1（0．4mmol／L）或顺铂（0．5μmol／L）处理HeLa细胞时,表达正义hALP基因的细胞生长仍活跃,而表达反义hALP基因和对照组细胞则生长相对缓慢。结论 DNA损伤可通过激活hALP基因启动子转录活性而上二调其表达,hALP基因的表达可以增强细胞对H2O2和顺铂损伤的抵抗性。     

口腔鳞癌中人端粒酶反转录酶、p53和MIB-1的表达及其临床意义

目的 探讨人端粒酶反转录酶(hTERT)、p53和MIB-1蛋白在口腔鳞癌组织中的表达及临床意义.方法 采用Envision免疫组织化学染色方法(IHC)检测20例口腔黏膜普通型增生、35例非典型增生(轻度10例、中度10例和重度15例)以及50例不同分化程度(高分化15例,中分化20例,低分化15例)的口腔鳞状细胞癌(OSCC)中hTERT、p53和MIB-1的表达.结果 hTERT、p53和MIB-1在口腔黏膜普通型增生、非典型增生及不同分化程度的OSCC均有不同程度表达.OSCC表达阳性率[中分化鳞癌hTERT:60％( 12/20)]高于普通型增生[hTERT:10％(2/20)]及非典型增生[中度非典型增生hTERT:30％(3/10)].分化程度低的OSCC表达阳性率[hTERT:66.7％(10/15)]显著高于分化程度高者[hTERT:46.7％(7/15)].结论 hTERT、p53和MIB-1在口腔OSCC发生、发展过程中起重要作用,并与OSCC的分化程度密切有关,可能是OSCC的较好预后指标.     

人非小细胞肺癌细胞中端粒酶活性的检测与研究

目的 研究非小细胞肺癌细胞癌组织中端粒酶活性表达,探讨端粒酶生表达与非小细胞肺癌发生发展的关系。方法 收集经手术及病理证实的非小细胞肺癌４８例标本,１２例肺癌癌旁肺组织、７例非肿瘤病例所取正常肺组织作对照。用端粒酶检测试剂盒检测组织本端粒酶活性。结果 ７５．００％（３６／４８）非小细胞肺癌组织标本检出端粒酶活性,８．３３％（１／１２）癌旁肺组织检出端粒酶活笥,７例非肿瘤标本所取的正常肺组织均未检出     

硫代修饰型反义寡核苷酸抑制肺癌细胞系端粒酶活性及增殖的研究

了解人肺癌细胞系的端粒酶活性情况。探讨硫代修饰型端粒酶ＲＮＡ反义寡核苷酸封阻端粒酶ＲＮＡ,对癌细胞代谢,生长的抑制作用。方法采用端粒酶ＰＣＲ ＥＬＩＳＡ方法检测８种体外培养从肺癌细胞系端粒酶活性。合成端粒酶ＲＮＡ的反义硫代寡核苷酸（６聚体、９聚体、１２聚体）和随机序列寡核苷酸,分别导入ＬＴＥＰ－ａ－２细胞系,作用７２ｈ。采用端粒酶ＰＣＲ ＥＬＩＳＡ方法检测端粒酶活性,四甲基偶氮唑盐（ＭＴＴ）光吸收     

肺癌患者外周血单核细胞端粒酶活性表达与分析

目的通过测定肺癌患者、良性肺病患者和健康人外周血端粒酶活性(TA),探讨其对肺癌的诊断价值。方法采用PCR-TRAP-ELISA法检测不同病理类型、不同临床分期的肺癌患者42例以及良性肺病患者20例和正常人15例外周血单个核细胞(PBMNC)端粒酶活性,并测定肺癌患者等的血CEA水平,进行相关分析。结果42例肺癌患者TA升高的阳性率达69.05%(29/42),OD值为0.45±0.37;20例良性肺病患者只有2例TA升高呈阳性,OD值为0.11±0.06,而15例正常人全部呈阴性,OD值为0.08±0.03。肺癌组血TA升高的阳性率及OD值均高于良性肺病组和正常对照组,差异有显著性(P<0.005)。PCR-TRAP-ELISA法检测肺癌组TA特异度为90%,灵敏度为69.05%,优于CEA检测(P<0.01)。肺癌I期TA阳性率为25%(1/4),而IV期阳性率为100%(8/8),TA高低与临床分期呈明显正相关(r=0.585,P=0.001)。结论1.PCR-TRAP-ELISA法检测外周血单个核细胞TA升高的阳性率明显高于CEA检测,可联合或替代CEA应用于肺癌的诊断及鉴别诊断;2.外周血TA可作为分子指标,辅助TNM分期,用于指导肺癌的治疗及预后判断等。     

Telomerase activity and the risk of lung cancer

Telomerase play a key role in the maintenance of telomere length and chromosome integrity. We have evaluated the association between telomerase activity and the risk of lung cancer in peripheral blood. Telomerase activity in peripheral blood mononuclear cells was measured by a PCR-designed telomeric repeat amplification protocol in 63 lung cancer patients and 190 healthy controls that were matched for age, gender, and smoking status. Telomerase activity was significantly lower in the lung cancer patients than in controls (mean ± standard deviation; 1.32 ± 1.65 vs 2.60 ± 3.09, P < 1 × 10(-4)). When telomerase activity was categorized into quartiles based on telomerase activity in the controls, the risk of lung cancer increased as telomerase activity reduced (P(trend) = 1 × 10(-4)). Moreover, when the subjects were categorized based on the median value of telomerase activity, subjects with low telomerase activity were at a significantly increased risk of lung cancer compared to subjects with high telomerase activity (adjusted odds ratio = 3.05, 95% confidence interval = 1.60-5.82, P = 7 × 10(-4)). These findings suggest that telomerase activity may affect telomere maintenance, thereby contributing to susceptibility to lung cancer.     

Massive telomere loss and telomerase RNA expression in dexamethasone-induced apoptosis in mouse thymocytes

Apoptosis is a well-recognized process of cell death occurring under several physiological and pathological conditions and represents the principal mechanism involved in cell selection in the thymus. Glucocorticoids are well known to stimulate apoptosis in rat thymocytes. However, it is unclear whether the same changes occur after in vivo glucocorticoid treatment in mice. Chromosomal stability and cell viability require a proficient telomeric end-capping function. Cells with critical telomere shortening and telomerase dysfunction undergo increased apoptosis. In turn, the change in telomere function in cells undergoing apoptosis is not fully characterized. In order to investigate this, we studied the changes in thymocytes after dexamethasone administration in BALB/c mice. The loss of normal thymocytes coincided with the appearance of small dense cells with characteristic features of apoptosis including condensed chromatin, internucleosomal DNA cleavage, and a "hypodiploid" peak on flow cytometry, which suggested that dexamethasone-induced thymocyte apoptosis in BALB/c mice could be considered a well-defined experimental model for studying apoptotic processes. Dexamethasone-treated thymocytes exhibited rapid and dynamic loss of telomeric sequences and up-regulation of telomerase RNA as an early event in the apoptotic process. Telomerase activity was unchanged in this event. Thereafter, telomere gain associated with an increase in telomerase activity occurred in the regenerative process of the thymus. These results suggest a role of telomere loss and up-regulation of telomerase RNA as key apoptosis sensors.     

窖蛋白-1在肺癌中的表达及意义

目的 探讨窖蛋白-1（caveolin-1）在不同类型肺癌组织中的表达及其与微血管密度（MVD）和临床病理因素之间的关系。方法 对154例原发性肺癌、相应癌旁正常肺组织及36例淋巴结转移癌行caveolin-1免疫组织化学染色;对154例原发性肺癌行CD34免疫组织化学（SP法）染色并进行微血管密度计数;Western印迹法检测其中50例新鲜肺癌组织及其癌旁正常肺组织中caveolin-1的表达情况。结果 caveolin-1为膜／质表达蛋白,在正常支气管上皮细胞和肺泡上皮细胞中的阳性率为100％。在肺癌组织中的阳性率为59．1％（91／154）,低于癌旁正常肺组织,P＜0．01;Western印迹结果进一步证实caveolin-1在肺鳞癌、肺腺癌组织中的表达均显著低于癌旁正常肺组织,P＜0．01。caveolin-1在小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌（NSCLC）中的阳性率分别为7．1％和64．3％,二者间差异有统计学意义,P＜0．01。NSCLC中,有淋巴结转移组caveolin-1表达高于无淋巴结转移组（P=0．005）;Ⅲ、Ⅳ期组caveolin-1表达显著高于Ⅰ、Ⅱ期组（P=0．042）,caveolin-1表达与NSCLC的其他临床病理因素及MVD值无关（P＞0．05）。结论caveolin-1其作为一种肿瘤抑制因子的同时,可能还具有促进NSCLC进展和转移的活性。     

增殖细胞核抗原表达与AgNORs图像分析在判断肺癌预后上的应用

应用抗增殖细胞核抗原（抗ＰＣＮＡ）单克隆抗体，采用Ｓ－Ｐ免疫组化方法和ＡｇＮＯＲｓ染色图像分析，对有确切随访结果的８６例原发性肺癌和１０例肺炎性假瘤进行了研究。结果表明：经ＰＣ－ＮＡ阳性反应计算出的增殖指数（ＰＩ）与图像分析的ＡｇＮＯＲｓ计数及其颗粒总面积间存在着明显的相关性。二者均与肺癌分型有关，并随癌分化程度的增高而减小；与ＴＮＭ分期中的淋巴结（Ｎ）和远隔转移（Ｍ）有关；术后存活５年以上者明显小于３年以内者（Ｐ＜０．０１）。认为ＰＣＮＡ的表达和ＡｇＮＯＲｓ图像分析技术有助于肺癌的分型、分化及预后的判断。