改良免疫荧光菌球法检测外环境中O1与O139群霍乱弧菌效果的探讨

自 1992年 10月印度和孟加拉国发生了O139群霍乱弧菌 (O139VC)引起的霍乱大流行以来 ,国内外陆续有此菌报道〔1,2〕。大量流行病学资料表明 ,海水产品和水的媒介作用仍是沿海地区O1群霍乱弧菌(O1VC)和O139群霍乱流行的主要原因〔3- 5〕。为提高对O139VC的检测效果 ,对免疫荧球法进行改良 ,并应用于O1、O139VC的检测。现将 2 0 0 0年 5～ 10月间 ,我们用此法检测外环境自然水体水源和贝壳类、鱼类 (简称鱼介类 )等食品标本中O1和O139VC的结果报告如下。1　材料和方法1 1　材料1 1 1　改进型荧球法器材 :普通生物显微镜和上海科艺厂轻…     

2005年福建省霍乱弧菌流行菌型特征分析

目的:了解福建省霍乱弧菌流行菌型特征,为控制传染来源提供科学依据。方法:采用血清学分型法、噬菌体-生物分型法及PFGE(脉冲场凝胶电泳)分型法对2005年霍乱疫情中不同来源的142株霍乱弧菌进行分型分析。结果:142株霍乱弧菌血清学、噬菌体-生物分型结果:流行株124株中O1群埃尔托稻叶1d型占95.16%(118/124株);其余菌株为6型以上非流行株。70株霍乱弧菌PFGE分型结果呈现3大类8种带型。结论:2005年霍乱疫情期间患者菌株与福州市闽江水系分离株菌型一致,表明具有高度同源性,而与市场水产品不相关。流行菌型更换而出现的埃尔托稻叶1d型,提示福建省今后仍有发生霍乱流行的可能。     

临床三年非发酵菌分布及耐药特征分析

目的了解临床非发酵菌的流行分布及耐药谱的变化,为临床合理选用抗生素提供依据.方法对2002～2004年三年问临床非发酵菌的分布与耐药性进行回顾性统计分析.结果非发酵菌三年检出率分别为25.1%、28.0%、28.8%;铜绿假单胞菌对头孢他啶、头孢哌酮/舒巴坦、左旋氧氟沙星的耐药率分别上升了10.7%、12.3%、12.0%,不动杆菌对头孢他啶、左旋氧氟沙星的耐药率上升了12.2%、12.5%.结论三年间临床分离非发酵菌呈逐年上升,对临床常用抗生素耐药状况严重,尤以对头孢菌素、喹诺酮类抗生素耐药率增加明显,不同非发酵菌属间抗菌谱不同,应加强病原学检测,促进抗生素的合理使用.     

非可培养状态霍乱弧菌的间接免疫荧光检测

目的建立检测水中活的非可培养状态霍乱弧菌(O1群、O139群)的间接免疫荧光法。方法用本实验室人工转化的非可培养状态霍乱弧菌的菌液制成抗原片,用混合诊断血清(抗O1群、O139群)作为一抗,异硫氰酸荧光素(FITC)标记猪抗兔IgG作为二抗,进行间接免疫荧光检测。结果该方法可以成功检测出水中非可培养状态霍乱弧菌,其检测下限约为104cells/400 ml。结论该方法具有较好的特异性和灵敏度,可作为自然水体中非可培养状态霍乱弧菌的检测方法,用于霍乱弧菌的生态研究。     

荧光免疫吸附法定量检测单核细胞增生李斯特菌

目的研制荧光免疫吸附法定量检测单核细胞增生李斯特菌。方法采用双抗夹心免疫吸附法筛选7株抗单核细胞增生李斯特菌的单克隆抗体,获得最佳配对抗体10E7H6和10A11。以生物素化的10A11为检测抗体,10E7H6为捕获抗体,建立了基于链霉亲和素标记荧光微球为检测探针的荧光免疫吸附法检测单核细胞增生李斯特菌。结果该方法中最佳捕获抗体浓度为10μg/mL,最佳检测抗体浓度为5μg/mL,反应最佳pH为7.4;在该条件下,单核细胞增生李斯特菌最低检测限为10~5 CFU/mL,比传统酶联免疫吸附法提高了两个数量级;与李斯特菌属内其他几种主要李斯特菌有一定的交叉反应,与其他非李斯特菌属的主要致病菌无显著交叉反应。结论该方法可用于纯培养液中单核细胞增生李斯特菌的检测,也可用于李斯特菌属内其他几种主要李斯特菌的免疫学快速筛查检测。     

实时荧光PCR法、胶体金法和培养法检测甲鱼中霍乱弧菌

目的优化水产品甲鱼中霍乱弧菌的检测程序,提高甲鱼中霍乱弧菌检出率。方法用实时荧光PCR、常规细菌培养、胶体金法同时对甲鱼中霍乱弧菌进行检测,并用实时荧光PCR法检测标本中霍乱弧菌ctx基因。结果共检测185份甲鱼样品,其中实时荧光PCR法检出28份霍乱弧菌核酸阳性,阳性率为15.14%;6份ctx基因核酸阳性,阳性率21.43%(6/28)。常规细菌培养法分离出2株菌株,一株为O139群霍乱弧菌,一株为小川型霍乱弧菌,用实时荧光PCR检测这两株纯培养菌株或原始标本,霍乱弧菌ctx基因均为阴性;胶体金法未检出阳性标本。结论对于水产品标本,可先用实时荧光PCR法筛检霍乱弧菌,阳性标本再进行传统细菌分离培养,以提高霍乱弧菌菌株的检出率;同时阳性标本进行霍乱弧菌ctx基因核酸检测,如也为阳性,需提高警惕,加强流行病学上的预防控制措施,及时防范霍乱疫情的发生。     

临床分离48株铜绿假单胞菌的耐药性分析及其耐药质粒检测

目的了解铜绿假单胞菌临床分离株对抗生素的耐药性及其耐药质粒情况,为临床用药提供直接可靠的参考依据。方法采用美国临床实验室标准委员会（NCCLS）推荐的标准方法（K-B法）对从校医院临床病例分离的48株铜绿假单胞菌进行药敏试验,并以碱裂解法提取和检测其耐药质粒。结果在48株铜绿假单胞菌中,对临床常用抗生素敏感性较好的是妥布霉素、丁胺卡那霉素和环丙沙星,其敏感率分别为83.3%、79.2%和75.0%,而耐药性较高的是复方新诺明、呋喃妥因和氨苄青霉素,其耐药率分别为87.5%、77.1%和72.9%：对其中8株多重耐药菌株进行质粒提取,发现4株菌携带有大小约为23～25kb的质粒DNA,经质粒消除试验表明,上述质粒与铜绿假单胞菌的多重耐药性有关。结论铜绿假单胞菌对复方新诺明、呋喃妥因和氨苄青霉素等已高度耐药,临床上不宜选用;耐药质粒对在铜绿假单胞菌耐药性的产生和传播具有重要作用。     

快速法检测外环境水中霍乱弧菌结果的分析研究

目的：对胶体金免疫快速检测法(简称快速法)检测外环境水中霍乱弧菌的结果进行分析研究。方法：利用分离培养法和快速法对外环境不同pH水中的霍乱弧菌同时进行检测。结果：pH值7．0、7．2、7．6、8．0和9．0的92件外环境水样，用分离培养法阳性57件，用快速法阳性59件，两种方法均阳性54件，两种方法均阴性30件，两种方法结果不符8件。结论：以分离培养法为标准分析快速法结果，快速法不受水样pH值影响，适用于外环境养殖池、坑水和河水的检测，不适于生活污水的检测。     

荧光PCR熔解曲线法检测结核分枝杆菌耐药性价值及耐药特征分析

目的 评价荧光PCR熔解曲线法(熔解曲线法)对结核分枝杆菌(MTB)耐药性检测价值。方法 采用熔解曲线法与传统液体药敏法同时检测156例临床分离培养MTB对抗结核药物利福平(RFP)、异烟肼(INH)、乙胺丁醇(EMB)、链霉素(SM)和氟喹诺酮类药物耐药情况,并对2种检测方案结果进行比较。结果 与液体药敏检测相比,熔解曲线法对5种抗结核药物耐药性检测结果差异无统计学意义(P> 0.05),以液体药敏检测为金标准,熔解曲线法检测RFP、INH、EMB、SM以及氟喹诺酮类药物耐药性的灵敏度分别为100.00%、75.86%、61.54%、75.00%、90.00%,特异度分别为97.10%、95.28%、99.30%、96.21%、100.00%,Kappa值分别为0.885、0.721、0.707、0.724、0.944,表明2种检测方法一致性好。结论 荧光PCR熔解曲线法对抗结核药物RFP、INH、EMB、SM及氟喹诺酮类的耐药性与液体药敏法检测效果一致,灵敏度、特异度均较高,具有较好的临床应用价值。     

110株铜绿假单胞菌的分离及耐药情况

铜绿假单胞菌是医院内感染的主要病原菌之一，而且由于抗菌药物广泛、不合理使用及多重耐药菌株的出现，使其耐药性问题日趋严重。现将我院2005-2007年分离的110株铜绿假单胞菌的临床分布特征及药敏结果分析报告如下。     

一起O139群霍乱弧菌引起的食物中毒菌株的耐药性分析

目的：探讨多重耐药0139群霍乱弧菌形成的可能分子机制。方法：对杭州一起暴发的65株0139群霍乱菌株进行药敏试验，取其中20株多重耐药菌株进行结合性转座子样SXT元件标志基因int SXT和Ⅰ类整合子的PCR检测，并对Ⅰ类整合子基因盒区扩增产物应用限制性酶切和DNA测序分析携带的基因盒。结果：65株0139群霍乱菌株中，56株(86．2％)均呈同一耐药谱，对11种抗生素多重耐药，仅对诺氟沙星、环丙沙星及丁胺卡那敏感。20株多重耐药菌株中，SXT元件标志基因int SXT均阳性，Ⅰ类整合子5’保守区、基因盒区和3’保守区也均阳性。其携带基因盒为氨基糖苷腺苷酰基转移酶基因nndA2。结论：此次暴发的多重耐药的0139群菌株均携带有SXT元件，Ⅰ类整合子在多重耐药菌株的形成中起了一定的作用。     

湖南省1996～2005年霍乱弧菌耐药性监测分析

目的：了解1996—2005年湖南省霍乱弧菌的耐药性和耐药性的变迁。方法：采用K—B法检测345株霍乱弧菌对8种抗菌药物的敏感性。结果：在测定的8种抗菌药物中，01群和0139群的霍乱弧菌对丁胺卡那、诺氟沙星、环丙沙星的敏感率最高，10年来未发现耐药菌株。两类菌在对四环素、强力霉素、红霉素和氨苄青霉素的耐药性上具有显著性差异。霍乱弧菌对复方新诺明、四环素、强力霉素、红霉素的耐药性从1996到2005年均有不同程度的上升。结论：长期对霍乱弧菌的耐药性进行监测和动态分析，可以为霍乱弧菌的流行病学研究以及对霍乱的监控和防治提供依据。     

杭州市O139群霍乱弧菌耐药变迁及毒力基因携带

目的 研究杭州市1994～2003年分离的O139群霍乱弧菌耐药性变迁以及携带ctxA、tcpA毒力基因的情况。方法 运用K—B法和PCR，检测90株O139群霍乱弧菌对抗生索的敏感性以及是否携带ctxA、tcpA毒力基因。结果 90株O139群霍乱弧菌中无丁胺卡那耐药的菌株，13株对诺氟沙星和环丙沙星耐药；对氨苄青霉索、复方新诺明分别有5年和6年的耐药率为100％；2002、2003年耐药谱增加到7种。87．87％的O139群霍乱弧菌同时携带ctxA、tepA毒力基因。结论10年来分离自杭州的O139群霍乱弧菌的耐药情况日益严重；O139群霍乱弧菌是否携带ctxA、tcpA毒力基因在对抗生素敏感性方面差异有统计学意义。     

实时聚合酶链反应检测O1群和O139群霍乱弧菌方法的建立及应用

目的建立检测O1群和O139群霍乱弧菌的实时荧光聚合酶链反应（RT—PCR）方法并进行水体标本的检测评价。方法根据O1群和O139群霍乱弧菌O抗原编码基因rfb序列设计引物，利用SYBRGreen染料，建立同时检测霍乱弧菌O1群和O139群的RT—PCR方法，对所建立的方法分别进行实验室内的灵敏度、特异性及重复性评价。采集河口水标本增菌后进行RT—PCR检测，与分离培养方法比较评价实际应用价值。结果建立了检测O1群和O139群霍乱弧菌的双重RT—PCR方法，根据扩增产物的溶解温度能有效区分O1群和O139群霍乱弧菌两种目标片段的扩增；对其他10种弧菌染色体DNA没有扩增；RT—PCR检测524份河口水体标本的增菌液，与常规分离方法相比显示了明显的灵敏性，并且所有常规分离方法阳性标本其荧光PCR检测亦为阳性。结论以O1群和O139群rfb基因为目标检测片段建立的霍乱弧菌RT—PCR方法可用于环境水体样本中霍乱弧菌常规分离前的快速筛查。     

广东省2009-2014年霍乱弧菌耐药监测分析

目的 了解广东省2009-2014年霍乱弧菌耐药情况,为霍乱临床合理用药和防治提供科学依据。方法 采用WHO推荐的改良K-B纸片扩散法,对在广东省2009-2014年收集的253株霍乱弧菌进行12种抗菌药物的药敏试验。结果 广东省2009-2014年共收集分离霍乱弧菌O1群189株(小川型72株,稻叶型117株),O139群26株,非O1/O139群38株;药敏结果显示,253株霍乱弧菌对头孢噻肟(CTX)和头孢曲松(CRO)均100% 敏感,对诺氟沙星(NOR)、环丙沙星(CIP)、阿米卡星(AMK)的敏感率分别为98.8% 、98.4% 、98.0%;O1群小川型、O1群稻叶型、O139群、非O1/O139群霍乱弧菌比较,不同血清型霍乱弧菌对萘啶酸(NAL)、四环素(TCY)、多西环素(DOX)、复方新诺明(SXT)、氨苄西林(AMP)、阿莫西林(AMX)、氯霉素(CHL)等抗生素的耐药率差异均有统计学意义(均P<0.05);多重耐药分析结果显示,37.5% 的菌株同时对≥3种抗生素耐受,其中有12株O1群稻叶型菌株同时对≥6种抗生素耐受,有3株O1群小川型和1株非O1/O139群菌株同时对6种抗生素耐受,有2株O139群菌株同时对4种抗生素耐受。结论 CTX、CRO、NOR、CIP、AMK对霍乱弧菌的敏感率较高;非O1/O139群霍乱弧菌感染比例增高且部分菌株表现出多重耐药现象,应加强此类菌株的耐药监测。     

霍乱弧菌中TLC基因簇的变异性分析

目的:研究霍乱弧菌中TLC基因簇的分子组成特征和类型检测方法的建立。方法:针对TLC基因簇内部的特征性基因设计结构相关引物和探针,利用序列比对、PCR和核酸杂交等分子生物学方法,检测并验证TLC在菌株内的基因结构和排列方式,确定分布类型。结果:pTLC与TLC基因簇之间序列有变异,TLC多整合于染色体中;建立了TLC基因簇的组成类型检测方法,并发现3种不同的结构排列方式。结论:TLC基因簇类型检测方法的建立及变异性的研究,利于深入揭示其在霍乱进化和毒力转移等过程中的影响作用。     

O1群霍乱弧菌胶体金法快速检测

目的 了解胶体金法检测O1群霍乱弧菌的特异性、灵敏度和实用性。方法 取患者粪便标本,先用碱性蛋白胨水35℃增菌6h,然后用胶体金法进行检测,同时作霍乱弧菌常规培养,培养出细菌后用血清凝集法作为鉴别诊断O1群霍乱弧菌的金标准,用统计学方法对胶体金法诊断试验的评价指标进行计算。结果 700份样本中,常规法培养出O1霍乱弧菌105株,胶体金法试验阳性108株,经χ²检验,差异无统计学意义(χ²=0.24,P>0.05),表明胶体金法检测O1群霍乱弧菌与常规培养法检测结果之间的差异无统计学意义。胶体金法检测O1群霍乱弧菌诊断试验的灵敏度为93.33%,特异性为98.32%,阳性预测值为90.74%,阴性预测值为97.18%,假阴性率为1.68%,假阳性率为6.67%。结论 胶体金法检测O1群霍乱弧菌特异性高(98.32%),灵敏度好,与常规培养法的一致性也较高,在快速检测O1群霍乱弧菌中有一定应用价值。     

外膜蛋白（ompw）引物扩增技术在非01群霍乱检测中的应用

[目的]采用霍乱弧菌外膜蛋白合成一对引物，建立一种灵敏、特异的PCR方法检测非01群霍乱弧菌。[方法]在实验室对42株来自外环境和病人中分离出的非01群霍乱弧菌采用PCR技术作了效果观察，并以大肠、痢疾、沙门菌等作为阴性对照其敏感性和特异性进行了验证。[结果]42株非01群霍乱弧菌采用外膜蛋白引物行PCR扩增，阳性率为100％，扩增片段为588bp，阴性对照扩增均为阴性。[结论]霍乱弧菌外膜蛋白引物快速检测非01群霍乱弧菌提供了一种有用的检测手段。     

龙泉市首例O139群霍乱弧菌耐药性及毒力基因携带情况研究

目的：研究龙泉市首例O139群霍乱弧菌耐药性及毒力基因携带情况。方法：运用药敏试验及PCR方法．分要该霍乱弧菌的耐药性以及携带ctxA、tcpA毒力基因的情况。结果：该O139群霍乱弧菌对庆大霉素等9种抗生素多重耐药：仅对丁胺卡那、诺氟沙星和环丙沙星敏感；该O139群霍乱弧菌携带ctxA、tcpA毒力基因。结论：在对O139群霍乱弧菌引起霍乱的防治工作中应密切监测其耐药性以及携带毒力基因的情况。     

一株非典型O1群霍乱弧菌实验室诊断与分析

目的:一株从腹泻病人分离到的O1群霍乱弧菌的实验室鉴定和毒力基因的检测与分析。方法:细菌的分离和鉴定按照卫生部疾病控制司第五版《霍乱防治手册》进行;用PCR方法对该菌株的ctxA、rtxA、Ace、TcpA、Cri、Zot 6种毒力基因进行检测。结果:经分离培养、生化反应、噬菌体-生物分型,确定该菌株是埃尔托霍乱弧菌5 e型流行株,菌落形态不典型,毒力基因TcpA、rtxA阳性,其它毒力基因均为阴性。结论:尽管该菌株从腹泻病人分离且确定为埃尔托流行株,但其霍乱肠毒素主要控制基因ctxA阴性,且菌落形态不典型,该菌是一株非典型的O1群霍乱弧菌。