GCS基因与MDR1基因在肝癌细胞多药耐药中的相关性研究

目的观察葡萄糖神经酰胺合酶(GCS)基因高表达对肝癌细胞HepG2内多药耐药基因(MDR1)表达的影响,探讨GCS基因参与肝癌多药耐药的作用机制。方法脂质体法将GCS基因真核表达质粒pEGFP-GCS导入肝癌细胞株HepG2中,应用G418筛选培养,反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞GCS mRNA和MDR1 mRNA的表达,蛋白印迹法检测细胞GCS蛋白和P-糖蛋白(P-gp)的表达,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测基因转染前后阿霉素对HepG2细胞半数抑制浓度(IC50)的变化。结果转染后HepG2细胞内GCSmRNA和蛋白的表达水平显著提高(P<0.05),而MDR1mRNA及P-gp的表达水平亦显著提高(P<0.05);同时,MTT法检测结果显示GCS基因转染后HepG2细胞对阿霉素的耐药性显著提高(P<0.05),IC50从(6.2±0.4)μg/ml上升到(11.6±1.0)μg/ml。结论高表达GCS可以上调HepG2细胞中MDR1的表达,使HepG2细胞发生多药耐药。     

蛋白酶体抑制剂MG132诱导HepG2细胞凋亡及其机制研究

目的观察蛋白酶体抑制剂MG132对人肝癌细胞HepG2的致凋亡作用,并从泛素蛋白酶体途径(UPP)相关基因E1、E2和E3及天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶3(Caspase3)表达初步探讨MG132的致细胞凋亡机制。方法采用多个浓度(2、5、10μmol·L-1)的蛋白酶体抑制剂MG132处理HepG2细胞;流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡率,DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡;逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测UPP相关基因E1、E2、E3和凋亡相关基因Caspase3的转录水平;免疫细胞化学检测Caspase3蛋白表达。结果对照组HepG2细胞凋亡率低于5%,在2、5和10μmol·L-1MG132作用下,细胞凋亡率分别为42.9%、66.1%、72.8%,MG132诱导HepG2细胞凋亡具有量效关系;RTPCR检测发现细胞内UPP相关基因E1、E2、E3mRNA表达下降,而凋亡相关基因Caspase3mRNA表达上调;免疫组化检测Caspase3蛋白表达水平升高。结论蛋白酶体抑制剂MG132能够诱导HepG2细胞凋亡,其机制可能与MG132抑制UPP活性,使细胞内Caspase3蛋白降解减少,同时上调Caspase3基因转录,促进细胞凋亡。     

MG132诱导HepG_2细胞凋亡及其对p53表达的影响

目的观察蛋白酶体抑制剂MG132对人肝癌细胞系HepG2的致凋亡作用及其对凋亡相关基因p53蛋白表达的影响。方法采用多个浓度(2,5,10μmol/L)的蛋白酶体抑制剂MG132处理HepG2细胞;流式细胞术和Hoechst荧光染色检测细胞凋亡;免疫细胞化学检测HepG2细胞p53蛋白含量。结果对照组HepG2细胞凋亡率低于5%,在2,5,10μmol/LMG132作用下,细胞凋亡率分别为42.9%,66.1%和72.8%,MG132诱导HepG2细胞凋亡具有剂量—效应关系。经Hoechst荧光染色可见细胞染色质浓缩等凋亡改变。免疫组织化学检测HepG2细胞p53蛋白表达水平增高。结论蛋白酶体抑制剂MG132能够诱导HepG2细胞凋亡,其作用呈剂量—效应关系;p53蛋白表达增加与MG132抑制泛素—蛋白酶体系统降解细胞内p53蛋白有关。     

钙调素拮抗剂小檗胺逆转K562／ADR细胞株多药耐药的研究

目的:研究钙调素拮抗剂小檗胺(BBM)抑制白血病细胞增殖并逆转细胞多药耐药的作用。方法:以四唑氮蓝(MTT)法测定小檗胺对K562细胞、耐阿霉素K562细胞(K562/ADR)的增殖抑制作用并求得其IC_(50);测定联合应用阿霉素和BBM后K562/ADR细胞对阿霉素的IC_(50)值及其增敏倍数。采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测小檗胺作用前后K562/ADR细胞多药耐药基因(MDR)在mRNA水平的表达,应用免疫组织化学方法测定P170表达量。结果:小檗胺能显著抑制K562及K562/ADR细胞增殖,其IC_(50)值分别为5.32 μg·mL~(-1)和 10.97μg·mL~(-1)。联合应用阿霉素和1 μg·mL~(-1)小檗胺使K562/ADR细胞对阿霉素的IC_(50)由5.94 μg·mL~(-1)降低至2.93μg·mL~(-1),其增敏倍数为2.03倍。8 μg·mL~(-1)小檗胺作用K562/ADR细胞24 h后P170的表达量由85.45％降低至63.86％,72 h后MDR1mRNA的表达以β-actin为内参照的半定量比值也由处理前的1.625降至0.877。结论:小檗胺对K562、K562/ADR有显著的增殖抑制作用,小檗胺能部分逆转K562/ADR细胞对阿霉素的耐药,其作用是通过抑制MDR1在mRNA和P170水平的表达而实现的。     

MG132诱导人血管平滑肌细胞凋亡及对caspase3表达的影响

目的观察蛋白酶体抑制剂MG132对人脐静脉血管平滑肌细胞(VSMC)的致凋亡作用及其对凋亡相关的天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶3(caspase3)表达的影响。方法采用多个浓度(2.5,5,10μmol/L)的蛋白酶体抑制剂MG132处理人脐静脉VSMC48h;DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡;流式细胞术分析细胞周期和细胞凋亡率;反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测caspase3基因转录水平;免疫细胞化学检测细胞caspase3蛋白表达。结果蛋白酶体抑制剂MG132处理48h后细胞凋亡率增加;RT-PCR检测发现细胞内凋亡相关基因caspase3mRNA表达上调;免疫细胞化学检测细胞caspase3蛋白表达水平升高。结论蛋白酶体抑制剂MG132能够诱导人脐静脉VSMC凋亡,其作用呈量-效关系;MG132诱导VSMC凋亡的机制可能与MG132抑制泛素-蛋白酶体途径(UPP)活性,促进caspase3基因转录,使细胞内caspase3增加而促进细胞凋亡。     

黄芪甲苷逆转耐药肝癌细胞株HepG2/GCS多药耐药的研究

目的探讨黄芪甲苷对耐药肝癌细胞株HepG2/GCS多药耐药的逆转作用及可能机制。方法以噻唑蓝(MTT)法测定黄芪甲苷的细胞毒作用和处理前后肝癌细胞对阿霉素的敏感性变化,通过Westernblot法检测细胞GCS蛋白的表达。结果黄芪甲苷在实验浓度范围内对HepG2、HepG2/GCS细胞均无明显毒性;浓度为40μg/ml的黄芪甲苷可逆转HepG2/GCS细胞对阿霉素的耐药性,逆转倍数为1.50,同时细胞内GCS蛋白的表达下降。结论黄芪甲苷具有逆转HepG2/GCS细胞多药耐药的作用,可能与下调细胞内GCS基因表达有关。     

叶酸受体及二氢叶酸还原酶与人乳腺癌细胞MCF-7/ADR多药耐药的关系

目的以人乳腺癌多药耐药细胞系MCF-7/ADR及其敏感亲本系MCF-7为对象,探讨叶酸受体(FOLRα)及其下游基因二氢叶酸还原酶(DHFR)的表达与乳腺癌细胞多药耐药的关系。方法 MTT法测定阿霉素的细胞毒性作用及DHFR抑制剂对MCF-7/ADR细胞多药耐药的逆转作用;RT-PCR检测细胞FOLRα和DHFR mRNA的表达水平;免疫细胞化学检测FOLRα、P-gp的表达水平。结果 MCF-7细胞增殖速度快于MCF-7/ADR细胞,MCF-7细胞FOLRα mRNA转录水平较MCF-7/ADR细胞高,而MCF-7/ADR细胞DHFR mRNA较MCF-7细胞转录水平高;免疫细胞化学显示MCF-7细胞FOLRα的表达高于MCF-7/ADR细胞,而MCF-7/ADR细胞P-gp的表达较MCF-7细胞高;MCF-7/ADR对甲氨蝶啶无耐药性,甲氨蝶啶对MCF-7/ADR细胞多药耐药有逆转作用。结论 MCF-7/ADR细胞FOLRα的表达水平下调可能与细胞增殖水平有关,其下游基因DHFR表达水平与MCF-7/ADR细胞的MDR可能存在相关性。     

耐阿霉素人骨肉瘤细胞株的建立及其耐药机制探讨

目的诱导并建立耐阿霉素(ADM)的人骨肉瘤细胞株并探讨其耐药机制。方法采用逐步增加药物剂量冲击诱导方法诱导人成骨肉瘤原代Saos-2细胞株;MTT法检测原代与耐药细胞株对ADM、顺铂(DDP)、甲氨蝶呤(MTX)、异环磷酰胺(IFO)、表柔比星(EPI)、比柔比星(THP)、紫杉醇(Paclitaxel,PTX)药物敏感性;利用光学显微镜、透射电镜观察细胞形态及超微结构变化;RT-PCR和IHC法分别检测多药耐药基因1(MDR1)、多药耐药相关蛋白(MRP)基因及其相应蛋白(P-gp)、MRP的表达。结果经167d的诱导,建立Saos-2/ADM1、Saos-2/ADM4细胞株,其对ADM的耐药指数分别为原代细胞株的49.8和74.6倍;耐药细胞株对MTX、EPI、THP、PTX亦产生不同程度的交叉耐药(P<0.05),对DDP仍然敏感(P>0.05);光镜观察Saos-2/ADM1、Saos-2/ADM4细胞株细胞体积增大,多核现象较原代Saos-2细胞株明显增加;透射电镜显示Saos-2/ADM1、Saos-2/ADM4细胞株表面突起较原代Saos-2细胞株减少、且核仁增大增多;细胞生长曲线显示耐药细胞株增殖能力下降。MDR1mRNA、MRPmRNA和P-gp、MRP在各耐药细胞株表达阳性。结论MDR1 mRNA、MRP mRNA及其相应蛋白参与了耐药细胞株耐药的形成,这些骨肉瘤耐药细胞株为进一步研究骨肉瘤耐药特征及逆转方法打下了基础。     

反义寡脱氧核苷酸抑制多药耐药基因mdr1表达并逆转耐药肝癌细胞的体外试验研究

目的:探讨反义寡脱氧核苷酸(ASODN)抑制多药耐药基因(mdr1)对耐阿霉素(ADM)肝癌细胞HepG2/ADM化疗敏感性的影响。方法:以多药耐药基因mdr1人工合成寡脱氧核苷酸(ODN),其中ODN分为ASODN和正义寡脱氧核苷酸(SODN),并采用脂质体转染技术将ODN与HepG2/ADM共培养,试验分为反义寡脱氧核苷酸(mdr1-ASODN)处理组、正义寡脱氧核苷酸(mdr1-SODN)对照组和空白对照组,通过逆转录聚合酶链式反应和蛋白免疫印迹法观察HepG2/ADM细胞中mdr1mRNA及其蛋白表达情况;MTT法观察HepG2/ADM细胞转染mdr1-ASODN前、后对化疗药物(ADM、顺铂、5-氟尿嘧啶)的敏感性。结果:与mdr1-SODN对照组和空白对照组比较,mdr1-ASODN处理组HepG2/AMD细胞中mdr1mRNA及其蛋白表达均明显降低(P<0.05);与转染前比较,HepG2/ADM细胞的增殖抑制率明显增加(P<0.05)。结论:ASODN能有效抑制mdr1基因表达,并恢复肝癌HepG2/ADM细胞对化疗药物的敏感性。     

MG132诱导人血管内皮细胞凋亡及对caspase-3表达的影响

目的　观察蛋白酶体抑制剂MG132对人血管脐静脉内皮细胞(ECV -304)的致凋亡作用及其对凋亡相关的天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶3表达的影响。方法　采用两个浓度(2, 5μmol·L-1 )的蛋白酶体抑制剂MG132处理ECV -304细胞;DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡率;RT -PCR检测细胞内凋亡相关基因caspase -3的转录水平;免疫细胞化学检测细胞caspase 3蛋白表达。结果　对照组ECV -304细胞凋亡率低于5%,在2μmol·L-1MG132作用下,凋亡率为11. 3%,MG132浓度升至5μmol·L-1,细胞凋亡率增致44 .5%,MG132诱导ECV 304细胞凋亡具有量-效关系;RT -PCR检测发现细胞内凋亡相关基因caspase 3mRNA表达上调;免疫细胞化学检测细胞caspase- 3蛋白表达水平升高。结论:蛋白酶体抑制剂MG132能够诱导血管内皮细胞凋亡,其机制可能与MG132抑制UPP活性,促进caspase- 3基因转录,使细胞内caspase -3增加而促进细胞凋亡。     

蛋白酶体抑制剂MG132诱导人血管平滑肌细胞凋亡及其机制研究

目的：观察蛋白酶体抑制剂MG132对人脐静脉血管平滑肌细胞（vascular smooth musele cells,VSMC）的致凋亡作用及其对凋亡相关的天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶3（caspase 3）表达的影响。方法：采用多个浓度（2．5、5、10μmol／L）的蛋白酶体抑制剂MG132处理人脐静脉VSMC 24h和48h;流式细胞术分析细胞凋亡率;RT-PCR检测泛素-蛋白酶体途径（ubiquitin-proteasome pathway,UPP）相关基因泛素、泛素活化酶（E1）、泛素缀合酶（E2）、泛素连接酶（E3）、26S蛋白酶体和caspase 3基因转录水平;免疫细胞化学检测细胞caspase 3蛋白表达。结果：蛋白酶体抑制剂MG132处理48h后细胞凋亡率增加：细胞内UPP相关的基因rnRNA表达降低,而caspase 3 mRNA表达增高;免疫细胞化学检测细胞caspase 3蛋白表达水平升高。结论：蛋白酶体抑制剂MG132能够诱导人脐静脉VSMC凋亡,其作用呈量-效关系;MG132诱导vSMC凋亡与下调UPP相关基因和上调caspase 3基因及蛋白的表达有关。     

双亚苄基哌啶与蛋白酶体抑制剂对舌癌细胞毒性作用及机制

目的探讨双亚苄基哌啶RA190与蛋白酶体抑制剂MG132对舌癌细胞CAL27、TCA8113的毒性作用及机制。方法将不同浓度的RA190或MG132作用于舌癌细胞24 h,CCK-8法检测各组细胞存活情况;流式分析不同组舌癌细胞周期与凋亡情况;Western blot检测各组细胞内ADRM1、Cyclin B1、Bak、Bax蛋白表达。结果RA190对CAL27、TCA8113的半抑制浓度IC 50分别约为0.18和1.6μmol·L-1;MG132的IC 50分别约为0.1和0.3μmol·L-1。RA190诱导CAL27细胞G 1/G 0或G 2/M期停滞;MG132诱导CAL27细胞G 2/M期停滞。1μmol·L-1 RA190提高TCA8113细胞凋亡率(P<0.05);MG132提高CAL27与TCA8113细胞凋亡率(P<0.05),并呈剂量依赖性。RA190和MG132均下调CAL27、TCA8113细胞内ADRM1、Bak、Bax蛋白表达,上调Cyclin B1。结论RA190在舌癌中作用具有较大的选择性和局限性,采用靶向ADRM1治疗策略不适用于舌癌。MG132通过ADRM1以外的其他通路对舌癌细胞产生毒性作用;MG132可能应用于舌癌治疗,但存在的副作用也可能较广。     

Mitogen-activated protein kinase inhibitors differently affect the growth inhibition and death of a proteasome inhibitor, MG132-treated human pulmonary fibroblast cells

Carbobenzoxy-Leu-Leu-leucinal (MG132) as a proteasome inhibitor can induce growth inhibition and death in lung cancer or normal cells. However, little is known about relationship between proteasome inhibition and mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling in normal lung cells. Thus, in the present study, we investigated the effects of MAPK inhibitors on MG132-treated human pulmonary fibroblast (HPF) cells in relation to cell growth inhibition, cell death, reactive oxygen species (ROS) and glutathione (GSH). Treatment with 15 μM MG132 increased ROS levels including mitochondrial O(2?)(-) and GSH depleted cell numbers in HPF cells at 24 hours. MAP kinase or ERK kinase (MEK) inhibitor did not significantly affect cell growth inhibition, cell death, the loss of mitochondrial membrane potential (MMP; ΔΨ(m)), ROS level and GSH depletion in MG132-treated HPF cells. c-Jun N-terminal kinase (JNK) inhibitor attenuated the growth inhibition and death by MG132. This inhibitor also significantly decreased O(2?)(-) level in MG132-treated HPF cells. Although p38 inhibitor slightly enhanced HPF cell growth inhibition by MG132, this inhibitor and siRNA prevented HPF cell death induced by MG132. p38 inhibitor also attenuated d O(2?)(-) level and GSH depletion. Moreover, extracellular signal regulated kinase (ERK), JNK or p38 siRNA did not strongly affect ROS levels in MG132-treated HPF cells. ERK and JNK siRNAs decreased anonymous ubiquitinated protein levels in MG132-treated HPF cells. In conclusion, MAPK inhibitors differently affected the growth inhibition and death of MG132-treated HPF cells. Especially, p38 inhibitor attenuated HPF cell death by MG132, which was in part related to changes in ROS and GSH levels.