内皮细胞表达CD137分子介导对T细胞的抑制效应

目的研究内皮细胞表达的CD137分子与活化的T细胞表达的CD137L交联后对T细胞的刺激效应.方法将活化的内皮细胞与活化的T细胞共培养,ELISA检测共培养上清中IL-2、IL-10和IFN-γ的含量;流式细胞仪检测内皮细胞表面标志分子CD25、CD69的表达变化;CCK-8试剂盒检测T细胞存活率,并观察用融合蛋白抗-CD137阻断CD137-CD137L共刺激通路后T细胞分泌细胞因子的变化.结果采用细胞共培养后,T细胞分泌IL-2、IL-10和IFN-γ的水平下降,而且CD25、CD69的表达水平降低,T细胞存活率下降,应用抗-CD137单克隆抗体阻断CD137-CD137L相互作用后,IL-2、IL-10和IFN-γ的分泌水平升高,CD25、CD69的表达上调,T细胞存活率上升.结论活化的内皮细胞诱导表达CD137蛋白分子与活化的T细胞上诱导表达的CD137L相互作用,通过CD137L向T细胞内传递抑制信号,抑制了T细胞合成和分泌细胞因子的功能.表明CD137-CD137L信号通路在内皮细胞与T细胞的信号作用中有着重要的地位.     

人重组CD137-Fc分子的构建与真核表达

目的构建人CD137-Fc基因的真核表达质粒，并表达有生物学活性的纯化人CD137-Fc融合蛋白。方法从cDNA文库中用PCR扩增cD137全长编码基因，并导入真核表达载体pcDNA3中。测序证实后，继续用PCR扩增其膜外区cDNA，酶切后与hIgGIFc基因一起装入真核表达载体pcDNA3中，转染293T细胞瞬时表达，用夹心ELISA检测其表达情况，经蛋白A亲和纯化，用SDS-PAGE与免疫印迹进行鉴定。结果测序证实构建的CD137与CD137-Fc cDNA阅读框完整，连接部位序列正确；ELISA证实cD137-Fc蛋白的表达；SDS-PAGE与免疫印迹证实其为人cD137-Fc蛋白。结论获得了纯化的hCD137-Fc融合蛋白，为探讨CD137在免疫自稳调节中的地位，以及探索CD137的其它生物学功能奠定了坚实的实验基础     

CD137信号下调乳腺癌患者外周血Treg细胞的免疫抑制功能

目的探讨CD137信号对CD4^＋CD25^＋调节性T细胞（Treg）的生物学效应及机制。方法采用激发型抗人CD137单抗加入PHA刺激的乳腺癌患者外周血T细胞培养体系及Treg细胞培养体系中,利用细胞计数及^3H-TdR掺入法分析T细胞的增殖,流式细胞术分析细胞膜分子和Foxp3表达,ELISA分析细胞因子的分泌。结果CD137分子表达于乳腺癌患者外周血CD4^＋CD25^＋Treg细胞膜;抗人CD137单抗加入PHA活化的乳腺癌患者T细胞培养体系后,T细胞增殖明显增加,Foxp3^＋Treg细胞比例明显下降;激发CD137信号可下调CD4^＋CD25^＋Treg细胞的Foxp3表达,抑制Treg细胞产生TGF-β1和IL-10,以及下调Treg细胞对PHA刺激的CD4^＋CD25^-T细胞增殖的抑制效应。结论CD137信号可抑制Treg细胞的免疫抑制功能,CD137可能是对Treg细胞进行免疫干预的重要靶点。     

系统性红斑狼疮患者外周血CD137及其配体表达的变化

目的 探讨T细胞亚群表面协同刺激分子CD137及其在单核细胞表面的配体CD137L表达与系统性红斑狼疮（SLE）发病机制的关系。方法 采用流式细胞仪检测技术对SLE患者和正常人外周血T细胞亚群表面CD137及单核细胞表面CD137L的表达进行分析。 结果 与正常人相比,SLE患者CD4＋T细胞和CD8＋T细胞表达共刺激分子CD137增高,单核细胞表达共刺激分子CD137L增加;SLE患者外周血CD4＋T细胞表达的CD137与24 h尿蛋白定量、球蛋白、SLE病情活动指数(SLEDAI)呈正相关性,与C3呈负相关性;CD8＋T细胞表达的CD137的与24 h尿蛋白定量、SLEDAI呈正相关性。结论 共刺激分子CD137和CD137L表达异常在SLE发病机制中可能有重要作用。     

CD137和CD28分子对衰老T细胞bcl-2表达的调控

目的 观察两种共刺激分子CD137及CD28对D-半乳糖致亚急性衰老模型小鼠及自然衰老小鼠T细胞活化后的bcl-2表达的调控,分析这两种共刺激分子调节衰老T细胞凋亡的可能机制.方法 7周龄BALB/c雄性小鼠每日背部皮下注射D-半乳糖溶液(120 mg/kg,溶于0.1 ml蒸馏水中),连续注射5个月,建立亚急性衰老模型组;自然衰老组为16月龄BALB/c雄性小鼠.分离小鼠的脾脏T细胞,分别用conA IgG、conA CD137单抗、conA CD28单抗体外活化,48h后用流式细胞术及半定量RT-PCR分析各组T细胞bcl-2的表达.结果 (1)衰老模型组T细胞经conA IgG、conA CD137单抗、conA CD28单抗活化48 h后,胞内bcl-2蛋白表达率分别为(24.4±1.5)%、(34.4±2.4)%、(45.1±2.7)%,自然衰老组T细胞经conA lgG、conA CD137单抗、conA CD28单抗活化48 h后,胞内bcl-2蛋白表达率分别(19.6±2.0)%、(26.3±1.9)%、(48.5±2.2)%;(2)衰老模型组T细胞经conA IgG、conA CD137单抗、conA CD28单抗活化48 h后,胞内bcl-2 mRNA表达率(IOD(bcl-2)/IOD(β-actin)分别为0.309±0.039、0.547±0.036、0.780±0.041,自然衰老组T细胞经conA IgG、conA CD137单抗、conA CD28单抗活化48 h后.胞内bcl-2 mRNA表达率分别0.283±0.038、0.535±0.041、0.771±0.063.结论 CD137单抗及CD28单抗.均可以显著提高衰老模型组及自然衰老组小鼠T细胞bcl-2mRNAbcl-2蛋白的表达,这可能是CD137分子及CD28分子抑制衰老T细胞凋亡、维持衰老T细胞功能的主要机制之一.     

重组IL-15/Fc融合蛋白治疗EAU的实验研究

目的 探讨重组小鼠IL-15/Fc融合蛋白治疗实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)的效应和机制.方法 C57小鼠输注IRBPI-20抗原特异性T细胞,构建EAU模型,通过静脉注射重组IL-15/Fc融合蛋白,眼底镜和HE染色评价融合蛋白治疗EAU的疗效.用auto-MACS分离IRBPI-20抗原免疫小鼠T细胞,通过CFSE染色,3HTdR渗入抑制法,流式细胞仪,ELISA法检测IL-15/Fc融合蛋白对IRBPl-20特异性T细胞抗原特异性活化、增殖、分化和分泌炎症细胞因子的作用.结果 IL-15/Fc融合蛋白能有效抑制IRBPI-20特异性CD8 T细胞增殖、扩增、向CD44highCD62Llow效应细胞亚群的分化和分泌炎症性细胞因子.体内应用能有效抑制EAU的临床症状.结论 该重组IL-15/Fc融合蛋白能抑制IRBP1-20特异性CD8 T细胞活化、增殖、分化和分泌炎症性细胞因子,从而抑制EAU的炎症反应.     

CD40信号介导同种反应中CD4+T细胞生物学功能的研究

目的探讨CD40信号在血管内皮细胞（ECV）与人外周血CD4^＋T细胞体外共培养的同种反应中的生物学功能。方法采用免疫磁珠阴性选择法分离获得人外周血CD4^＋T细胞,将纯化的CD4^＋T细胞与高表达CD40分子的ECV体外共培养,同时应用功能型CD154单克隆抗体阻断CD40信号,通过检测不同时间点的共培养上清IL-2、IFN-γ水平及CD4^＋T细胞的增殖来评价CD40信号在同种反应中的生物学效应。结果CD4^＋T细胞与ECV共培养组上清中的IL-2和IFN-γ水平高于含有CD154单克隆抗体的阻断效应组,差异有统计学意义（P〈0.05）;此外,CD154单克隆抗体通过阻断CD40共信号,能有效地抑制CD4^＋T细胞活化,并使之对同种抗原的刺激,维持在较低的应答水平,在共培养的第6天差异最为显著（P〈0.05）。结论CD40信号参与ECV介导的CD4^＋T细胞分泌IL-2和IFN-γ,并介导CD4^＋T细胞对同种抗原的免疫反应;CD154单克隆抗体等多种干预CD40信号的生物制剂可能在移植排斥的免疫负性调节中具有潜在的应用价值。     

可溶性CD137检测及在类风湿性关节炎的临床应用

目的　建立测定可溶性 CD137(s CD137)的酶联免疫吸附测定 (EL ISA)方法 ,研究 s CD137释放与 T细胞活化及CD137表达之间的相关性 ,探讨类风湿性关节炎 (RA)患者血清 s CD137测定的意义。　方法　建立生物素 -亲和素双抗体夹心 EL ISA(BA- EL ISA)方法检测血清 s CD137含量。用不同浓度的 PHA刺激培养人外周血单个核细胞 (PBMC) 3天 ,测定培养上清液中 s CD137水平、T淋巴细胞转化率、PBMC细胞膜上 CD137表达百分率 ,分析 s CD137水平与 T淋巴细胞转化率、CD137表达率之间的相关性 ;分别测定类风湿性关节炎 (RA)活动…     

EGFP-CD40L 融合基因的构建、表达及功能鉴定

目的 构建编码增强型绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,EGFP)和人CD40L胞外段(hecdCD40L)组成的融合基因真核表达载体,并探讨表达后的融合蛋白对人树突状细胞(dendritic cells, DCs)表型和功能的影响. 方法 以RT-PCR方法从健康人外周血单个核细胞中克隆hecdCD40L基因片段.小鼠血管内皮细胞生长因子受体2信号肽序列(SigmKDR)和EGFP与hecdCD40L基因片段融合或不融合,插入真核表达载体pcDNA3.1(-),构建pcDNA3.1 SigmKDR-EGFP(sEGFP)和pcDNA3.1 sEGFP-hecdCD40L.用脂质体将表达载体转染至体外培养的COS-7细胞后,G418抗性筛选,流式细胞仪分选并检测EGFP和/或CD40L的表达.Western blot检测融合蛋白在COS-7细胞及其上清中的表达,用镍柱和超滤离心管获取纯化浓缩的sEGFP-hecdCD40L和sEGFP融合蛋白与人DCs共孵育,流式细胞仪和ELISA分析DCs对2种融合蛋白的摄取率、DCs表型变化以及细胞因子IL-12的分泌. 结果 pcDNA3.1 sEGFP或pcDNA3.1 sEGFP-hecdCD40L转染COS-7细胞后,经G418抗性筛选和流式细胞仪分选筛选获得高效表达融合蛋白的单克隆细胞株,EGFP阳性细胞可达95%以上,Western blot在细胞内和上清中均能检测到融合蛋白.sEGFP或sEGFP-hecdCD40L与DCs共孵育2 h,流式细胞仪检测示EGFP阳性率前者为28.6%,后者为56.9%,24 h后分析DCs的表型,sEGFP-hecdCD40L融合蛋白增强DCs表面CD80、CD83和HLA-DR分子的表达以及刺激IL-12的分泌,而sEGFP对DCs的表型和IL-12的分泌无明显影响. 结论 用SigmKDR、EGFP和hecdCD40L构建的融合基因能在真核细胞中表达并能分泌至细胞外,这种分泌型融合蛋白能靶向DCs,诱导DCs的成熟和上调其表面共刺激分子和MHC-II分子的表达,并刺激IL-12分泌.     

4-1BBL/4-1BB信号对系统性红斑狼疮患者外周血淋巴细胞活化的影响

目的:探讨4-1BBL/4-1BB信号对系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血淋巴细胞活化及共刺激分子表达的影响。方法:用CD3单抗刺激SLE患者外周血单个核细胞,并用抗4-1BBL单抗阻断4-1BBL/4-1BB共刺激信号,流式细胞术检测阻断前后T、B细胞上4-1BB、CD40L、4-1BBL、CD40以及CD69表达水平。结果:SLE患者T细胞上CD69表达明显高于正常对照组(P<0.01);SLE患者外周血T细胞上4-1BB、CD40L和B细胞上4-1BBL、CD40表达明显高于正常对照组(P<0.01),活化后T细胞上共刺激分子表达升高更加明显(P<0.01);抗4-1BBL单抗阻断后4-1BB、CD40L表达明显下降(P<0.01),B细胞上CD40表达下降,与SLE未活化组和活化组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:SLE患者外周血T、B细胞活化水平升高,4-1BBL/4-1BB信号对其活化状态维持可以起重要作用。     

Research on the effects of CD137 signaling on the function of CD3-CD56+NK cells

Objective:To investigate the effects of CD137 signaling on the regulation of CD3-CD56+NK cells function. Methods: CD3-CD56+NK cells were treated with CD137 mAb or mouse IgG1 isotype control to study the effects of CD137 signaling on the function of CD3-CD56+NK cells. Cytotoxicity was measured by LDH activity in the supernatants of cell cultures; NKG2D and LFA-1 expression on CD3-CD56+NK cells were analyzed by flow cytometry. Results: CD137 was expressed on activated CD3-CD56+NK cells. The CD137 mAb enhanced...     

人CD137L在肿瘤细胞的表达及其对肿瘤细胞分泌IL-8的影响

目的 :检测人CD137L在肿瘤细胞的表达及其功能。方法 :采用RT PCR、FACS方法检测人CD137L在肿瘤细胞的表达 ,用ELISA方法检测CD137L对肿瘤细胞分泌IL 8的影响。结果 :9种不同来源的人肿瘤细胞系均不同程度表达CD137L ,其中 ,BEL 74 0 2、HL 6 0、A2细胞系呈高水平表达 ;HepG2 .2 .15、L 78、HT 2 9细胞系中度表达 ;U937、H6、HLE细胞系低表达。胚胎细胞系ECV 30 4中度表达 ,而新分离的正常外周血单个核细胞不表达。CD137L的表达水平与肿瘤细胞系的来源无关 ,同一组织来源的细胞系 ,有的高表达 ,有的低表达。肿瘤细胞上的CD137L对肿瘤细胞本身IL 8的分泌可产生不同的影响 :可使HepG2 .2 .15分泌IL 8的水平增加 ,但对HLE、A2 ,只能微弱地增强肿瘤细胞释放IL 8。结论 :CD137L在肿瘤细胞上的表达是普遍现象 ,其表达可能与细胞的快速生长有关 ;肿瘤细胞的CD137L可增强某些细胞系分泌IL 8。     

大肠癌组织CD137L的表达及意义

【目的】 检测大肠癌组织及癌旁组织中CD137L mRNA及蛋白的表达情况,探讨其在大肠癌发生进展中的意义&#65377; 【方法】 运用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应及冰冻切片免疫组化的方法检测大肠癌组织及癌旁组织中CD137L的表达情况,并分析其表达情况与各临床因素的相关性&#65377; 【结果】 54例大肠癌组织中CD137L mRNA的相对表达水平为 0.035 ± 0.013,显著高于癌旁组织的0.008 ± 0.005(P < 0.05)&#65377;但在不同性别&#65380;年龄&#65380;肿瘤发生部位&#65380;Dukes分期&#65380;病理分化及血清CEA水平情况下,CD137L mRNA的表达水平无显著性差异(P > 0.05)&#65377;随机抽取8例大肠癌肿瘤组织及3例癌旁组织,进行免疫组化检测,结果显示6例CD137L蛋白呈阳性表达,CD137L表达于肿瘤细胞表面;3例癌旁组织该分子的表达均为阴性&#65377;【结论】 CD137L mRNA在大肠癌组织中高表达,CD137L分子表达于大肠癌肿瘤细胞表面,提示该分子可能在大肠癌的发生进展中发挥作用&#65377;     

hTERT启动子调控下CD137L表达载体的构建及其在卵巢癌细胞中的表达

目的研究hTERT启动子调控下CD137L表达载体的构建及其在人卵巢癌细胞系中的表达,探讨CD137L靶向基因治疗的可行性。方法采用RT-PCR法从K562细胞中克隆CD137L全长基因, 将其克隆到真核表达载体pcDNA3中,构建的质粒为pcDNA3-hCD137L,用Hind Ⅲ和Xba Ⅰ双酶切后将CD137L再定向插入pBTdel-279中,构建成hTERT启动子调控下CD137L表达载体pBTdel-279-hCD137L,采用酶切法和测序法鉴定。用Fugene6转染试剂盒将两种重组质粒分别瞬时转染人卵巢癌细胞株OVCR3和人胚肺成纤维细胞株HELF,RT-PCR和流式细胞仪检测CD137L的表达。结果测序证实所克隆的CD137L基因序列与GENEBANK中的序列相符。经限制性内切酶酶切,电泳后显示片段插入正确,证实构建成功。pcDNA3-hCD137L转染后OVCR3细胞和HELF细胞均可检测到CD137L的表达,但pBTdel-279-hCD137L转染后仅在OVCR3细胞中检测到其表达,在HELF细胞中无表达。流式细胞显示pBTdel-279-hCD137L转染效率低于pcDNA3-hCD137L。结论hTERT启动子调控下CD137L表达载体构建正确,并可在卵巢癌细胞中较高表达,为探讨靶向基因治疗提供了实验依据,但hTERT启动子活性仍低于CMV启动子     

人CD137分子基因克隆及其在COS-7细胞中表达的研究

目的：克隆人CD17分子的编码序列，将其重组人真核表达载体，并表达于COS－7细胞，方法：从活化的T细胞cDNA文库中以PCR方法克隆编码人CD137的编码序列，对其序列进行测定。将测定正确的CD137编码序列克隆入真核表达载体PCI－neo，构建重组表达载体。采用质体法转染COS－7细胞，用流式细胞仪检测CD137分子的表达。结果：PCR方法扩增出一800bp左右的基因片段，插入PCI－neo构建重组表达载体后，经序列测定证实扩增的片段为人CD137编码序列，将重组子转染COS－7细胞，流式细胞仪检测显示有27．11％的细胞表达人CD137分子。结论：成功地克隆并在COS－7细胞中表达了CD137分子。     

重组可溶性人CD137在CHO细胞中的表达

目的：获得表达人可溶性CDl37抗原的dhfr-CHO细胞抹。方法：将CDl37-hIgGlFc-pCD-NA3重组质粒及pSV2-dhfr质粒，运用脂质体介导法共转染CHO细胞。用G418筛选出阳性克隆，MTX递增浓度诱导人可溶性CDl37在dhfr-CHO细胞的表达。运用RT-PCR检测CDl37 mRNA转录水平，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测人CDl37可溶性蛋白在CHO细胞中的表达。结果：重组质粒转化细胞进行RT-PCR后，得到一大小为558bp的特异性条带，与人CDl37胞膜外区一致；重组质粒转化细胞进行SDS-PAGE得到一大小约为37KDa的奈带，与人CDl37-hIgGlFc融合蛋白大小基本一致。结论：获得了表达人可溶性CDl37的dhfr-CHO细胞株，为获得纯化的CDl37抗原、制备CDl37单抗奠定了基础。     

小鼠可溶性CD83-Ig对树突状细胞产生IL-12的影响

目的:探讨小鼠可溶性CD83-Ig对树突状细胞(DC)产生白细胞介素-12(IL-12)的影响。方法:将表达小鼠CD83胞外功能区与人IgG1αFc融合蛋白(CD83-Ig)的真核表达载体pmCD83-Ig转染COS-7细胞,表达可溶性CD83-Ig融合蛋白,并将该载体转染DC细胞系(DC2.4),筛选稳定表达CD83-Ig的细胞系。采用LPS刺激DC2.4,借助RT-PCR和ELISA法分别检测DC2.4IL-12mRNA的表达和细胞培养上清中IL-12的水平,观察CD83-Ig对DC2.4表达IL-12的影响。结果:可溶性CD83-Ig处理DC细胞组和CD83-Ig基因转染DC细胞组IL-12mRNA的表达和上清液中IL-12水平显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:CD83-Ig可抑制LPS刺激DC产生IL-12,可能是CD83-Ig负调节DC活性的重要机制。