非霍奇金淋巴瘤中EB病毒BNLF_1片段及其表达产物的检测及意义

为研究ＥＢ病毒与非霍奇金淋巴瘤（ＮＨＬ）的关系，采用ＰＣＲ、原位杂交、ＬＳＡＢ（ｌａｂｅｌｉｎｇｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｖｉｎｂｉｏｔｉｎ）免疫组化技术，检测３２例ＮＨＬ和３３例反应性增生淋巴结中的ＥＢＶＢＮＬＦ１基因片段及其表达产物潜伏膜蛋白（ＬＭＰ１）。ＮＨＬ中ＥＢＶＢＮＬＦ１ＰＣＲ扩增阳性率为５３％，明显高于反应性增生淋巴结组２７％（Ｐ＜０．０５），其中５例Ｔ细胞淋巴瘤全部阳性。１７例ＰＣＲ阳性的ＮＨＬ中５例原位杂交阳性。ＬＭＰ１检测仅２例阳性。结果表明本组病例半数以上ＮＨＬ中有ＥＢＶ感染，可能与肿瘤的发生发展有一定关系。     

两种不同来源的EBV LMP1基因在Balb／c3T3细胞中的表达

目的：研究来源于鼻咽癌细胞株ＳＵＮＥ１及ＥＢＶ标准株Ｂ９５－８细胞中两种ＥＢＶ ＬＭＰ１基因在真核细胞Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３中的表达,为进一步研究ＥＢＶ ＬＭＰ１基因的核酸疫苗打基础。方法：将两种不同来源ＥＢＶ ＬＭＰ１基因的真核表达质粒,经脂质体法转染Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３细胞后,用Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ、免疫组化及ＰＣＲ的方法检测不同转染细胞中ＥＢＶ ＬＭＰ１蛋白的表达及核酸片段。结果：ＰＣＲ结构表     

丙型肝炎病毒包膜蛋白基因片段的克隆与表达

应用ＲＴ－ＰＣＲ和基因重组技术，从湖南地区丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）感染者血清中克隆了ＨＣＶ包膜蛋白基因片段（Ｅ１，Ｅ２／ＮＳ１）经与已知基因型的ＨＣＶ－１，ＨＣＶ－Ｊ，ＨＣＶ－Ｊ６和ＨＣＶ－Ｊ８进行核苷酸序列的比较分析，这些基因片段属１ｂ型ＨＣＶ基因。将克隆基因重组于表达质粒ＰＭＡＬ－ＣＲＩ中，在大肠杆菌内进行高效表达，获得了融合蛋白ＭＢＰ－Ｅ１，ＭＢＰ－Ｅ２／ＮＳ１，经ＷｅｓｔｅｍＢｌｏｔ分析证实     

非霍奇金淋巴瘤中EB病毒BNLF1片段及其表达产物的检测及意义

为研究ＥＢ病毒，与非霍奇金淋巴瘤（ＮＨＬ）的关系，采用ＰＣＲ，原位杂交，ＬＳＡＢ（ｌａｂｅｌｌｉｎｇｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｖｉｎｂｉｏｔｉｎ）免疫组化技术，检测３２例ＮＨＬ和３３例反应性增生淋巴结中的ＥＢＶ－ＢＮＬＦ１的基因片段及其表达产物潜伏膜蛋白（ＬＭＰ１），ＮＨＬ中ＥＢＶ－ＢＮＬＦ１ＰＣＲ扩增阳性率为５３％，明业高于反应性增生淋巴结组２７％（Ｐ〈０．０５），其中５例Ｔ细胞淋巴瘤全部阳性，１７     

HPV16L1ORF的基因克隆及在大肠杆菌中的表达

目的：获得足够量的人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ１６）Ｌ１融合蛋白及含ＨＰＶ１６Ｌ１ＯＲＦ序列的基因重组体。方法：通过ＰＣＲ扩增获得ＨＰＶ１６Ｌ１基因片段，将此片段插入原核细胞表达载体ｐＧＥＭＥＸ－１，表达后进行菌体蛋白质Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ免疫印迹分析。结果：ＨＰＶ１６Ｌ１基因重组体的构建成功，克隆的目的基因片段在大肠杆菌中产生的融合表达产物在Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测中个有抗     

102例乳腺癌中的EB病毒感染

目的探讨国人乳腺癌中ＥＢ病毒ＤＮＡ（ＥＢＶ－ＤＮＡ）的检出率及ＥＢ病毒（ＥＢＶ）基因编码蛋白的表达情况。方法（１）在１０２例乳腺癌中用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术扩增ＥＢＶ内部重复序列ＢａｍＨＩＷ区域，并以３４例乳腺纤维腺瘤，３例管内乳头状瘤和１０例乳腺导管上皮增生作为对照组；（２）用ＡＢＣ免疫组织化学技术检测其中７３例乳腺癌中的ＥＢＶ潜在膜蛋白（ＬＭＰ）和ＥＢＶ核抗原２（ＥＢＮＡ２）。结果（１）ＰＣＲ检测显示２９例（２８．４％）乳腺癌有ＥＢＶ－ＤＮＡ，而对照组中仅２例（４．３％）纤维腺瘤有ＥＢＶ－ＤＮＡ，两组的差异在统计学上有显著意义（Ｐ＜０．００１）；（２）免疫组化技术显示ＬＭＰ和ＥＢＮＡ２阳性率分别为１３．７％和１７．８％，且阳性物质定位于肿瘤细胞，而非肿瘤中浸润的淋巴细胞。结论ＥＢＶ感染与乳腺癌的发病可能有一定关系，明确ＥＢＶ感染在乳腺癌发病机制中的作用将有十分积极的意义。     

EB病毒BHRF1反义寡核苷酸片段诱导鼻咽癌SUNE-1细胞株的凋亡

目的：观察ＥＢ病毒ＢＨＲＦ１反义寡核苷酸片段对鼻咽癌ＳＵＮＥ１细胞株增殖的影响。方法：ＰＣＲ、３ＨＴｄＲ的掺入法及电泳等。结果：ＰＣＲ从ＳＵＮＥ１细胞ＤＮＡ中扩增出ＥＢ病毒的４种（ＢＨＲＦ１、ＤＮＡ酶、胸苷激酶及核抗原１）全基因片段；适当浓度ＢＨＲＦ１反义寡核苷酸片段能引起无血清培养的ＳＵＮＥ１细胞株增殖受抑制；透射电镜及琼脂糖凝胶电泳检测结果发现与ＳＵＮＥ１细胞发生凋亡有关。结论：适当浓度ＢＨＲＦ１反义寡核苷酸片段能抑制无血清培养的ＳＵＮＥ１细胞株的增殖。     

EB病毒3种全基因的扩增、克隆及表达

目的：扩增克隆及表达ＥＢ病毒（ＥＢＶ）３种（ＤＮＡ酶、胸苷激酶及ＢＨＲＦ１）全基因片段。方法：以Ｂ９５－８细胞株ＤＮＡ为模板，ＰＣＲ扩增３种目的基因。酶切鉴定后分别与高效表达载体ｐＢＶ２２１连接，用大肠杆菌ＪＭ１０３或ＨＢ１０１作为转化的宿主菌。抗氨苄青霉素培养形成单菌落后放大培养，根据重组质粒的电泳行为粗筛，再双酶切鉴定。结果：各种阳性菌经３０℃→４２℃变温诱导培养，超声破碎后其上清液经十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳＰＡＧＥ），分别新出现一条分子大小为５２ｋｕ，６７ｋｕ及１７ｋｕ蛋白区带，符合ＥＢＶ该３种全基因所编码蛋白质大小。凝胶中蛋白质定量扫描结果显示目的蛋白质分别占宿主菌总蛋白质的２３％，６７％和２５％。结论：实现了ＥＢＶ３种全基因的扩增、克隆及在原核体系的表达。     

EBV—LMP1反义基因真核表达载体的构建及序列鉴定

目的：构建ＥＢ病毒ＬＰＭ１反义基因的真核表达载体。方法：通过ＰＣＲ方法,扩增ＥＢＶ－ＬＭＰ１基因的第一外显子片段,使之反向克隆到质粒ｐｃＤＮＡ３．１的多克隆位点中。经限制性酶切、ＰＣＲ扩增和测序鉴定重组载体。结果：酶切产物和ＰＣＲ产物的凝胶电泳显示４００ｂｐ左右的目的基因片段,测序结果显示与已知ＬＭＰ１基因序列一致。结论成功构建了ＬＭＰ１反义基因的真核表达载体。     

人乳头瘤病毒HPV16L1—E7C重组腺病毒载体的构建

采用ＰＣＲ方法,从ＨＰＶ１６型野毒株质业中分离出ＨＰＶ１６Ｌ１（５５５９－７１５１ｂｐ）、ＨＰＶ１６Ｅ７Ｃ（６８２－８５５ｂｐ）基因片段,采用ＰＣＲ产物的Ｔ－Ａ克隆法,将Ｌ１、Ｅ７Ｃ分别插入ｐＧＥＭ－ＴＥａｓｙ载体,构建克隆载体ｐＴＡＬ１、ｐＴＡＥ７Ｃ。ＢａｍＨ１、ＨｉｎｄⅢ酶切ｐＴＡＥ７Ｃ,Ｂｇ１Ⅱ、ＣｌａⅠ酶切ＰＴＡＬ１,回收Ｌ１、Ｅ７Ｃ片段,利用ＢａｍＨⅠ、Ｂｇ１Ⅱ酶切产竽相同粘末端的特点,     

EB病毒相关胃癌及鼻咽癌组织病毒主要潜伏期基因启动子甲基化状态分析

目的研究分析青岛地区EB病毒（EBV）相关胃癌及鼻咽癌组织中EBV主要潜伏期编码基因启动子甲基化状态。方法采用甲基化特异性PCR（MSP）及亚硫酸氢盐-基因组测序法（BGS）,分析32例EBV相关胃癌及20例EBV阳性鼻咽癌标本中编码EBV核抗原EBNAs基因的启动子Cp、Wp、Qp以及LMP1和LMP2A编码基因启动子的甲基化状态。结果 EBV相关胃癌及鼻咽癌肿瘤标本中EBV编码基因启动子的甲基化状态与肿瘤细胞的潜伏感染类型一致：Cp和Wp呈高甲基化状态,而Qp未发生甲基化;2种EBV阳性肿瘤标本中LMP1和LMP2A编码基因启动子甲基化状态有所不同,两者在EBV相关胃癌组织甲基化程度明显高于其在EBV阳性的鼻咽癌（χ^2=19.15、11.01,P〈0.01）。结论甲基化是调控EBV主要潜伏期基因启动子活动的重要机制之一。     

Epstein-Barr病毒LMP1蛋白羧基端的克隆与原核表达

目的　构建PGEX 6P 3 CCT原核表达载体 ,获得大量纯化的LMP1羧基端蛋白。方法　通过RT PCR技术从B95 8细胞中扩增EBVLMP1CCTcDNA ,克隆至PGEM Teasy载体上并测序。利用引物上的BamHI与EcoRI酶切位点将CCT基因插入PGEX 6P 3,转化大肠杆菌BL2 1 ,限制性内切酶消化鉴定。IPTG诱导重组菌株表达 ,用SDS PAGE与Westernblot对表达产物进行鉴定 ,并用Sepharose 4B亲和层析柱对表达产物进行纯化 ,PreScissionProteas酶对融合蛋白进行解离。结果　扩增的LMP1CCT长度为 5 97bp ,测序结果与已知序列吻合。重组子经酶切鉴定 ,获得PGEX 6P 3 CCT原核表达菌株 ,Westernblot表明重组蛋白能被LMP1单克隆抗体特异结合。获得约5 1kDa的PGEX 6P 3 CCT融合蛋白 ,分离纯化出约 2 1kDa的LMP1CCT蛋白。结论　成功获得EBVLM1CCT蛋白 ,为研究LMP1致瘤机制 ,研制生物抗癌药物奠定基础     

EB病毒LMP1蛋白CTAR23结构域的原核表达及纯化

目的 获得纯化的LMP1 CTAR23结构域蛋白。方法 用RT—PCR方法从B95—8细胞中扩增EBV LMP1 CTAR23结构域的cDNA，将其克隆至PGEM-T easy载体后进行测序鉴定。亚克隆至原核表达载体PGEX-6P-3，转化大肠杆菌BL21，IPTG诱导重组菌株表达。用SDS—PAGE与Western blot对表达产物进行鉴定，用Sepharose 4B亲和层析柱对表达产物进行纯化，PreScission Proteas酶对融合蛋白进行解离。结果 扩增的LMP1 CTAR23长度为357bp，测序结果与已知序列吻合。获得PGEX-6P-3-CTAR23原核表达菌株，Western blot表明重组蛋白能被LMPI单克隆抗体特异结合。获得约42000u的PGEX-6P-3-CTAR23融合蛋白，分离纯化出约13000u的LMP1 CTAR23蛋白。结论 成功获得EBV LMP1 CTAR23蛋白，为研究LMP1致瘤机制，研制生物抗癌药物奠定基础。     

鼻咽癌中EB病毒潜伏膜蛋白1启动子的突变

 【目的】 检测EB病毒潜伏膜蛋白1 (LMP1) 远端启动子L1-TR在鼻咽癌(NPC)组织中的突变情况并探讨突变对启动子活性的影响。【方法】 用聚合酶链反应(PCR)方法分别扩增出B95.8细胞和新鲜鼻咽癌组织细胞中EB病毒(EBV)的L1-TR片段,并测序比较其核苷酸序列的差异。构建含原型和突变型L1-TR启动子的荧光素酶报告质粒并分别转染HaCat细胞、B95.8细胞和C666-1细胞,比较两种启动子的活性。【结果】 和B95.8原型比较,鼻咽癌组织中的EB病毒L1-TR启动子区域有多处缺失。插入和点突变,且启动子活性明显降低(P < 0.05)。【结论】 鼻咽癌组织中LMP1启动子 L1-TR的活性与B95.8原型相比明显降低,这在EB病毒的免疫逃避机制中可能有一定的意义。     

应用RNA干扰抑制EB病毒潜伏膜蛋白-1表达对鼻咽癌细胞生长的影响

目的探讨能否通过siRNA人工诱导RNA干扰,在EB病毒阳性的鼻咽癌细胞株C611中,选择性抑制潜伏膜蛋白1(LMP1)的表达,并了解LMP1抑制对鼻咽癌细胞生长的影响。方法利用脂质体转染的方法,将人工合成的双链siRNA导入鼻咽癌细胞,通过半定量RT-PCR检测LMP1 mRNA水平的变化。并采用MTT法和流式细胞仪检测LMP1表达抑制后,鼻咽癌细胞增殖和细胞周期的变化。结果C611细胞转染siRNA可使LMP1 mRNA水平下降90%以上。LMP1基因抑制后,C611细胞增殖速度下降33%;流式细胞检测显示,C611细胞周期在G0-G1期受阻。结论本研究证明,全新的人工诱导RNA干扰技术,能够有效抑制LMP1基因的表达,并降低鼻咽癌细胞的增殖能力,为鼻咽癌研究和抗肿瘤基因治疗提供了新的思路。     

EBV反义LMP-1转染CNE2细胞对裸鼠致瘤的作用

目的：研究反义LMP1基因转染CNE2细胞对裸鼠的成瘤作用。方法：用反义LMP1转染的CNE2细胞、空载体转染的CNE2细胞以及原始CNE2细胞分别接种裸鼠，观察三种细胞的成瘤能力及细胞的恶性程度。结果：反义LMP1转染的CNE2细胞比空载体转染的CNE2细胞及原始CNE2细胞在裸鼠体内成瘤能力(包括平均瘤重及总瘤重)和镜下细胞恶性程度都有所降低。结论：反义LMP1能成功抑制LMP1的表达，逆转NPC细胞的恶性表型，为临床应用反义技术进行鼻咽癌基因治疗提供了实验依据。     

应用PNA干扰抑制EB病毒潜伏膜蛋白-1表达对鼻咽癌细胞生长的影响

目的 探讨能否通过siRNA人工诱导RNA干扰，在EB病毒阳性的鼻咽癌细胞株C611中，选择性抑制潜伏膜蛋白1(LMP1)的表达，并了解LMPl抑制对鼻咽癌细胞生长的影响。方法利用脂质体转染的方法，将人工合成的双链siRNA导入鼻咽癌细胞，通过半定量RT-PCR检测LMP1 mRNA水平的变化。并采用MTT法和流式细胞仪检测LMP1表达抑制后，鼻咽癌细胞增殖和细胞周期的变化。结果C611细胞转染siRNA可使LMP1 mRNA水平下降90％以上。LMP1基因抑制后，C611细胞增殖速度下降33％；流式细胞检测显示，C611细胞周期在G0-G1期受阻。结论 本研究证明，全新的人工诱导．RNA干扰技术，能够有效抑制LMP1基因的表达，并降低鼻咽癌细胞的增殖能力。为鼻咽癌研究和抗肿瘤基因治疗提供了新的思路。     

Epstein-Barr virus encoded latent membrane protein 1 induces TRAF1 expression to promote anti-apoptosis activity via NF-κB signaling pathway in nasopharyngeal carcinoma

Objectives To identify whether Epstein-Barr virus (EBV) encoded latent membrane protein 1(LMP1) can induce tumor necrosis factor receptor-associated factor 1 (TRAF1) expression and promote its anti-apoptosis activity via the NF-KB signaling pathway, and assess that LMP1 suppresses apoptosis in nasopharyngeal carcinoma (NPC).Methods A stable transfected cell line HNE2-LMP1 was established by introducing LMP1 cDNA into HNE2 cells. Transactivation of TRAF1 was determined by luciferase reporter assay, while expression of TRAF1 mRNA was detected by RT-PCR and expression of TRAF1 protein and caspase 3 by Western blot analysis. Apoptosis activity was observed through fluorescence staining.Results LMP1 induced TRAF1 expression in NPC cells and caused a decrease in apoptosis. This induction could be blocked by antisense LMPI. Moreover, LMPl-mediated induction of a TRAF1 promoter-driven reporter gene was significantly impaired when the KB site KB1 or KB5 was disrupted,whereas mutation of κB3 had only a minor effect on LMP1 dependent up-regulation of the reporter gene.Conclusion LMP1 induces TRAF1 expression and promotes its anti-apoptosis activity via the NF-κB signaling pathway, which may be one of the mechanisms that LMP1 uses to suppress apoptosis in NPC cells.     

两种不同来源的EBV LMP1基因在Balb/c 3T3细胞中的表达

【目的】研究来源于鼻咽癌细胞株SUNE1及EBV标准株B95 - 8细胞中两种EBVLMP1基因在真核细胞Balb/c3T3中的表达 ,为进一步研究EBVLMP1基因的核酸疫苗打基础。【方法】将两种不同来源EBVLMP1基因的真核表达质粒 ,经脂质体法转染Balb/c 3T3细胞后 ,用Westernblot、免疫组化及PCR的方法检测不同转染细胞中EBVLMP1蛋白的表达及核酸片段。【结果】PCR结果表明在两种不同来源LMP1转染细胞中均有EBVLMP1基因序列 ,并均能表达 6 3ku的蛋白质 ,经Westernblot和免疫组化结果证实均为EBVLMP1蛋白。【结论】来源于B95 8细胞及鼻咽癌细胞SUNE1的两种EBVLMP1基因均能在真核细胞Balb/c 3T3中表达。