反义hTERT对K562细胞端粒酶活性及细胞增生的影响

目的：观察反义hTERT表达质粒转染K562细胞后是否能够抑制端粒酶活性及K562细胞的增生。方法：质粒的构建与转染；将200bphTERTcDNA片段，反向连接于pLNCX-neo质粒上得到反义hTERT基因表达质粒，在体外转染中通过脂质体法将质粒导入K562细胞中，以G418进行筛选得到阳性克隆；以MTT法和形态学法检测反义hTERT表达质粒对K562细胞增生的抑制作用；以TRAP-PCRELISA法来研究反义hTERT基因对K562细胞的端粒酶活性的抑制作用。结果：转染反义hTERT表达质粒细胞与对照组（空白对照及空质粒组）相比较。生长速率明显变慢。部分细胞出现凋亡等形态学改变。反义hTERT对K562细胞的端粒酶活性具有明显的抑制作用。结论：研究构建的端粒酶反义hTERT基因表达质粒转染到K562细胞中后，能够封闭K562细胞hTERT-mRNA的表达，在抑制端粒酶活性的同时，减慢了K562细胞的生长速度。     

腺病毒介导的shRNA沉默hTERT基因表达对鼻咽癌细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨靶向人端粒酶反转录酶（hTERT)的短发夹RNA（shRNA)对人鼻咽癌细胞株CNE-2 hTERT表达的影响,及其对鼻咽癌细胞增殖和凋亡的效应。方法构建表达绿色荧光蛋白(EGFP)基因和靶向hTERT基因短发夹RNA的重组腺病毒质粒,观察其对鼻咽癌细胞株(CNE-2)的转染效果,RT-PCR检测hTERT mRNA表达水平,Western blot检测hTERT蛋白表达水平,CCK-8法检测细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞凋亡状况。结果Adv-EGFP-shTERT重组腺病毒质粒转染率可达90%以上,成功转染CNE-2细胞24 h后,hTERT mRNA的表达水平显著下降,转染48 h后,hTERT蛋白表达明显下调,细胞增殖活性受到显著抑制,细胞凋亡率可达23.0%。结论腺病毒载体介导靶向hTERT基因的RNA干扰,能显著抑制端粒酶反转录酶表达,进而抑制端粒酶活性,抑制CNE-2细胞增殖并诱导其凋亡,为鼻咽癌的基因治疗研究提供了理论基础。     

TNF-α对白血病K562及K562/ADM细胞hTERT及mdr1表达的抑制作用

目的:观察TNF-α对人髓系白血病细胞K562及其耐药细胞K562/ADM hTERT基因表达、端粒酶活性的抑制以及对多药耐药(multidrug resistance-1,mdrl)基因表达的影响。方法:K562及K562/ADM细胞传代培养,加入5×10~6U/L的TNF-α培养24h进行诱导实验;MTT法检测K562和K562/ADM细胞的增殖能力,流式细胞术检测K562和K562/ADM细胞的凋亡,RT-PCR检测hTERT和mdrl mRNA的表达,ELISA法检测端粒酶活性。结果:TNF-α诱导K562及K562/ADM细胞表现持续的生长抑制作用,且具有时效关系(P<0.05);TNF-α诱导K562及K562/ADM细胞的凋亡率增加(P<0.05),而且耐药细胞K562/ADM凋亡的增加更明显(P<0.01);hTERT基因与端粒酶活性的表达密切相关(r=0.983,P<0.05),TNF-α诱导后两者也同时下调(P<0.01);多药耐药mdrl基因伴随着hTERT基因的下调而下调(r=0.966,P<0.05)。结论:TNF-α能诱导白血病K562及K562/ADM细胞系hTERT基因表达的抑制,端粒酶活性下调的同时多药耐药基因mdrl的表达也下调。     

RNA干扰对肾癌细胞端粒酶活性及增殖、凋亡的影响

目的 探讨针对人端粒酶RNA（hTR）及其催化亚基（hTERT）的小干扰RNA（siRNA）对肾癌细胞端粒酶活性及其增殖、凋亡的影响。方法 将hTR-siRNA、hTERT-siRNA（100nmol／L）单独或联合转染人肾癌786—0细胞,采用RT-PCR法检测hTR、hTERT mRNA表达,TRAP-ELISA法检测端粒酶活性,MTT法检测细胞增殖,免疫组化TUNEL法检测细胞凋亡。结果 （1）hTR-siRNA可显著降低786—0细胞hTR mRNA表达（P〈0．01）,hTERT-siRNA可显著降低hTERT mRNA表达（P〈0．01）,但彼此互不影响。（2）二者均能显著抑制端粒酶活性（P〈0．01,P〈0．01）,并增加786—0细胞增殖抑制率及凋亡细胞阳性率（P〈0．01,P〈0．01）。二者联合应用与单独应用差异亦无显著性（P〉0．05）。结论 hTR、hTERT siRNA通过抑制各自基因表达,抑制人肾癌细胞端粒酶活性,进而抑制增殖、促进凋亡。     

榄香烯诱导人脑胶质瘤U251细胞凋亡及对端粒酶活性和hTERT表达影响的研究

目的：探讨榄香烯诱导人脑胶质瘤U251细胞凋亡及其影响端粒酶活性及其催化亚单位人端粒酶逆转录酶（hTERT）表达的机制。方法：将榄香烯处理人脑胶质瘤U251细胞株后，用MTT法检测细胞增殖抑制率．并求出半数抑制浓度（IC50），倒置显微镜和电镜观察经榄香烯处理的U251细胞形态。流式细胞仪和原位末端标记技术检测细胞周期及细胞凋亡率的变化，免疫荧光技术观簪凋亡小体．流式细胞仪测定bcl-2表达水平．端粒重复扩增（TRAP）法测定端粒酶活性的变化，RT—PCR检测bcl-2和hTERT的表达。结果：榄香烯对U251细胞株增殖具有抑制作用，呈剂量和作用时间的依赖性，IC50为0.062mg／ml，倒置显微镜下可见榄香烯组细胞皱缩、变小，电镜下可见具有典型新月形核的凋亡细胞和凋亡小体，流式细胞仪检测榄香烯阻滞U251细胞周期中S期向G2／M期的转变过程，减少有丝分裂，并引起细胞凋亡，免疫荧光技术观察凋亡小体，TRAP法发现榄香烯可以降低端粒酶活性的变化＋呈时间和剂量依赖型。RT—PCR分别证实榄香烯降低bcl-2和hTERT基因表达水平。结论：榄香烯诱导人脑胶质瘸U251细胞凋亡，并抑制U251细胞端粒酶的活性，榄香烯作用于胺质瘤的分子生物学机制可能通过抑制bc1-2表达，下调hTERT基因，降低端粒酶的活性，从而诱导细胞调亡。     

人端粒酶催化亚基反义核酸对子宫内膜癌细胞的抑制作用

目的 探讨人端粒酶催化亚基(hTERT)基因反义寡核苷酸(AODN)对子宫内膜癌细胞系HEC-1A的生长抑制作用及作用机理。方法 采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测AODN对细胞增殖能力及细胞生长的影响;逆转录聚合酶链反应技术(RT-PCR)、定量端粒酶重复扩增法(TRAP)、Westerm blot蛋白免疫印迹法和凋亡相关酶活性测定检测反义核酸对hTERT基因转录、蛋白表达、细胞端粒酶活性以及凋亡相关酶活性的变化。结果 低浓度hTERT基因AODN能够下调HEC-1A细胞HTERT、mRNA含量,抑制细胞hTERT蛋白表达,下调端粒酶活性,并且激活凋亡相关酶Caspase-1和Caspase-3活性;其对细胞的生长抑制作用有明显的时效性和剂量依赖性。结论 hTERT基冈反义核酸能够抑制子宫内膜癌细胞的增殖能力,有望成为内膜癌治疗的新方向。     

冬凌草甲素对K562细胞端粒酶活性调控和细胞周期的影响

目的 目的：研究冬凌草甲素(ORI)对K562细胞端粒酶活性及其细胞周期的影响。方法 采用MTT法观察不同浓度ORI对K562细胞增殖的影响：采用端粒重复序列扩增法(TRAP)．酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测了端粒酶活性变化；采用流式细胞仪测定细胞周期各时相百分比。结果 ORI可明显抑制K562细胞增殖；在一定的浓度范围内，ORI可下调K562细胞端粒酶活性。流式细胞仪结果显示，经ORI处理的K562细胞，细胞周期各时相分布发生变化，G2／M期细胞增多，S期细胞减少。结论 ORI可下调K562细胞的端粒酶活性，其机制可能与其细胞周期阻滞作用有关。     

二氟甲基鸟氨酸对K562细胞生长特性的影响及其与端粒酶活性的相关性

目的研究二氟甲基鸟氨酸(DFMO)对K562细胞生长特性、凋亡及端粒酶活性的影响。方法采用细胞计数、形态观察、FCM分析及DNA电泳分别检测DFMO处理的细胞生长速率、周期分布及细胞凋亡。按TRAP法对细胞端粒酶活性进行检测。结果DFMO处理的细胞生长速率明显减慢;G1期细胞增多而S期细胞减少;细胞表现凋亡诱导,且其端粒酶活性受到抑制。结论DFMO引起的K562细胞生长抑制及凋亡诱导与端粒酶活性抑制有关。端粒酶的失活是抑制多胺生物合成的抗癌分子机制重要事件之一。     

硒酸酯多糖通过下调mdr1/P-gp表达逆转K562/ADM细胞凋亡抑制

目的:研究硒酸酯多糖(Kappa-selenocarrageenan,KSC)对多药耐药K562/ADM细胞的诱导凋亡效应及其分子机制。方法:以白血病多药耐药细胞K562/ADM为KSC作用的靶细胞,用MTT比色法检测细胞增殖活性,形态学、DNA片段化和流式细胞术(FCM)观察细胞凋亡;RT-PCR检测mdr1基因和Caspase-3基因mRNA的表达;FCM测定P-gp蛋白表达水平和Caspase-3活性。结果:KSC显著抑制K562/ADM细胞增殖,KSC诱导后K562/ADM细胞出现典型的凋亡形态学变化、DNA片段化和亚G1期细胞群等特征性改变。KSC下调K562/ADM细胞mdr1基因表达、抑制P-gp合成,并上调caspase-3基因表达、增强caspase-3活性。结论:KSC通过下调mdr1/P-gp表达逆转K562/ADM多药耐药细胞的凋亡抑制。     

维生素E琥珀酸酯诱导耐药白血病K562／ADM细胞凋亡的研究

目的：研究维生素E琥珀酸酯(vitamin E succinate，VES)对多药耐药白血病K562／ADM细胞的诱导凋亡作用及分子机制。方法：以体外培养的K562／ADM细胞为研究对象，采用噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)比色法检测细胞增殖活性，Wright-Giemsa染色、DNA凝胶电泳和流式细胞术(flow cytometry，FCM)检测细胞凋亡；FCM测定细胞Fas、Bcl-2和p53蛋白表达水平。结果：VES可显著抑制K562／ADM细胞的生长及增殖，P=0．004。光镜下可见K562/ADM细胞呈典型凋亡的形态学改变。DNA凝胶电泳显示典型的凋亡DNA梯形条带。FCM细胞周期分析显示，G1期阻滞，亚G1期细胞比例增高，P=0．005；Fas蛋白表达明显上调，P=0．002；Bcl-2蛋白表达下调，P=0．00～0；p53蛋白表达无明显变化。结论：VES可诱导K562/ADM细胞凋亡，作用机制可能与其上调Fas表达和下调Bcl-2表达有关。     

反义 hTERT 基因对 K562 细胞凋亡及周期的影响简

目的：探讨反义hTERT基因抑制K562细胞端粒酶活性对其细胞周期及增殖的影响。方法：用脂质体介导反义hTERT基因和空载体质粒转染K562细胞株,绘制生长曲线,MTT法检测细胞活性,血清饥饿法同步化细胞周期,流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡率变化。结果：反义hTERT基因转染后,细胞生长明显受到抑制。细胞同步化后,流式细胞仪检测显示：KA组细胞出现早期凋亡峰,细胞阻滞于S期。但正常培养48h,各组细胞无明显凋亡,周期无显著差异。结论：反义hTERT基因可明显抑制K562的增殖,细胞同步化后具有促凋亡作用。     

hTERT基因反义核酸对K562细胞端粒酶活性的影响

探讨人类端粒酶逆转录酶（ｈｕｍａｎ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ,ｈＴＥＲＴ）基因的反义寡核苷酸（ａｎｔｉｓｅｎｓ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ,ＡＳＯＮＤ）对Ｋ５６２细胞端粒酶活性的影响。方法：采用多聚酶链反应－酶联免疫测定（ＰＣＲ－ＥＬＩＳＡ）方法检测人工合成的反义脱氧寡核苷酸处理Ｋ５６２细胞前后端粒酶活性的改变,以逆转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）分     

反义寡核苷酸及RNA干扰靶向人类端粒酶反转录酶的效果比较

 目的　观察反义寡核苷酸（ASODN）、RNA干扰（RNAi）两种方法对端粒酶的抑制效应。方法　设计合成寡核苷酸及siRNA链,两者均在脂质体介导下转染K562细胞,RNA干扰采用直接转染后筛选高效链,质粒载体构建,再转染后分析效果。结果　合成3条siRNA链,直接转染后,检测hTERTmRNA表达,发现第一、第二条链有效,第三条链无效,人端粒酶反转录酶（hTERT）mRNA表达抑制仅维持48 h,72 h即恢复。筛选两条链构建质粒载体,转染后P-1组作用48 h后hTERT mRNA为0.39±0.13,72 h为0.57±0.32,P-2组48 h为0.55±0.20,72 h为0.88±0.23,端粒酶相对活性P-1组48 h为0.42±0.07,72 h为0.31±0.08,P-2组48 h为0.49±0.27,72 h为0.39±0.03。siRNA的最佳作用浓度为：100 μmol／L。反义寡核苷酸以0.6 μmol／L浓度组抑制作用最佳,24 h后hTERTmRNA为0.42±0.16。48 h为0.71±0.18。端粒酶相对活性24 h为0.52±0.002,48 h为0.482±0.018。结论　靶向hTERT 的反义寡核苷酸和RNA干扰均可以抑制hTERTmRNA表达,从而抑制端粒酶活性,抑制效果与靶位点选择密切相关。RNA干扰效果优于反义寡核苷酸,前者不仅表现为抑制效率高,且持续时间长。质粒载体构建后的RNA干扰优于化学合成后直接转染的RNA干扰。     

Arsenic trioxide downregulates telomerase activity in HL-60 cells

Telomeres are the specialized nucleoproteincomplexes at the physical ends of eukaryoticchromosomes[1]. Telomere length decreases along with increasing cycles of cell divisions. Telomere shortening has therefore been proposed to play a role in cellular senescence. Telomerase is a protein-RNA enzyme complex that adds a six-base DNA sequence (TTAGGG) to the ends of chromosomes and thereby prevents their shortening. This enzyme is specifically activated in most malignant tumors but is usuall…     

长春瑞滨对人肺腺癌Anip973细胞凋亡和端粒酶表达的影响

目的 探讨长春瑞滨(NVB)对人肺腺癌Anip973细胞的凋亡、端粒酶活性以及人端粒酶逆转录酶mRNA(hTERT mRNA)表达的影响.方法 以不同浓度的NVB作用于Anip973细胞,在不同时间内收集细胞,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法观察NVB对Anip973细胞的生长抑制作用;通过流式细胞术观察Anip973细胞凋亡率;用倒置显微镜和电镜观察细胞形态学变化;应用以聚合酶链反应(PCR)为基础的端粒重复序列扩增(TRAP-PCR)银染法检测端粒酶活性;采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测hTERT mRNA表达.结果 不同浓度的NVB可诱导Anip973细胞凋亡,而且可降低Anip973细胞中端粒酶活性和hTERT mRNA的表达,并呈时间-剂量依赖性.0.08μg/ml NVB作用Anip973细胞24 h,细胞增殖被抑制,细胞凋亡率为(7.37±0.35)%,hTERT mRNA表达为57.01±1.71,与对照组差异均有统计学意义(P＜0.01);端粒酶活性值为6.36±0.06,与对照组差异无统计学意义(P＞0.05);hTERT mRNA表达的改变比端粒酶活性更敏感.0.4μg/ml NVB组和2.0μg/mlNVB组各时间点的细胞凋亡率、端粒酶活性和hTERT mRNA表达与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.01).2.0μg/ml NVB作用Anip973细胞72 h时,端粒酶活性为1.36±0.27,而细胞凋亡率为(74.87±1.88)%,表明细胞凋亡率的增加与细胞hTERT mRNA表达呈负相关(r=-0.96046,P＜0.01).结论 NVB的作用机制与端粒酶有关,诱导凋亡是其发挥抗癌作用的机制之一.检测端粒酶活性和hTERT mRNA的表达,有助于判定NVB诱导肺癌细胞凋亡的敏感性.