昆明小鼠胚胎干细胞定向分化为神经干细胞的实验研究

目的 探讨体外分离培养、诱导胚胎干细胞(ESC)分化为神经干细胞(NSC)的方法.方法 自孕3.5d的昆明小鼠获得附植前的早期胚胎,在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层上培养获得ESC克隆. 进行Oct-4免疫细胞化学鉴定、碱性磷酸酶(AKP)染色鉴定及体外分化能力的鉴定.在无人重组白血病抑制因子(hLIF)存在的条件下将ESC悬浮培养4d,形成拟胚体(EB),再经全反式维甲酸(RA)诱导4d,在神经干细胞筛选培养基中扩增,采用免疫细胞化学方法检测NSC特异性标志物Nestin的表达.结果 所分离得到的ESC的AKP染色阳性,Oct-4表达阳性,符合ESC的一般特性.ESC经RA初步诱导,NSC选择性培养基筛选培养7d后,形成大量神经球样结构,所形成的神经球样结构呈Nestin抗原阳性.结论 体外分离得到的昆明小鼠ESC经RA诱导后,再经选择性培养基筛选培养可获得大量NSC,有望为神经系统损伤及神经变性疾病提供新的治疗途径.     

3～18周胎龄人胚胎神经干细胞的分离、培养及增殖

目的:在分离、纯化、培养3～18周胎龄人胚胎神经干细胞(NSC)的基础上,进一步研究3～18周胎龄NSC的增殖特点.方法:从3～18周龄流产人胚胎的大脑皮质和神经管组织中分离NSC,实验分组:A组(3～6周龄),B组(7～11周龄),C组(12～18周);培养、纯化NSC;以单细胞克隆实验及免疫细胞化学对其进行生物学特性鉴定;计数神经球数目、直径检测其生长情况.结果:从3～6周流产人胚胎大脑皮层和神经管组织中以及7～18周的人胚胎大脑皮层中均分离获得了可在体外生存增殖的NSC,经鉴定,该类细胞在生长方式、形态结构、功能特征、表面标志等方面,均具有典型NSC的生物学特征;A组人胚胎NSC的神经球数目和直径均大于B、C组(P＜0.05).结论:3～18周胎龄组NSC的增殖能力均随胎龄的增加而逐步减弱.     

不同胎龄人胎脑皮质颞叶神经干细胞变化特征观察

目的：探讨不同胎龄胎脑皮质颞叶神经干细胞（NSC）的发育规律。方法：收集胎龄为16～36周的水囊引产胎儿90例，采朋免疫组化及光镜技术对人胎脑皮质颞叶NSC的分布、彤态、生长方式以及数量进行检测。结果：NSC主要分布在锥体细胞层及内颗粒细胞层，呈圆形、椭圆形及多角形，尤以小圆形细胞为甚，0～2个突起，核相对较大，1～2个核仁不等，染色质疏松。NSC呈区域性分布，其中有大量由数个细胞形成的NSC集落，少部分NSC以单个彤式存在于其他神经细胞间。各胎龄组间NSC在分布、形态、种类、生长方式等方面无明显差异；随着胎龄的增加，皮质颞叶NSC逐渐减少。结论：不同胎龄人胎脑皮质颞叶NSC在分布、形态、种类和生长方式等方面无明显差异，其数量随着胎龄的增加而减少。     

不同胎龄人胎脑神经干细胞发育特征探讨

目的:探讨不同胎龄胎脑纹状体神经干细胞的发育特征。方法:收集胎龄16~28周的水囊引产胎儿60例,采用免疫组织化学及光镜技术对人胎脑纹状体神经干细胞的分布、形态以及数量进行检测。结果:不同胎龄胎脑纹状体均存在神经干细胞,神经干细胞主要分布在豆状核和尾状核,内囊处较少,呈圆形、椭圆形、三角形及多角形细胞,以椭圆形细胞多见,细胞有0~3个突起,胞核呈圆形和椭圆形,1~4个核仁不等,大部分细胞染色质疏松,少部分细胞染色质致密。随着胎龄的增加,纹状体神经干细胞逐渐减少。结论:不同胎龄人胎脑纹状体神经干细胞在形态及数量上存在一定的差异,而在分布部位无明显差异。     

小鼠神经干细胞中一氧化氮合酶的表达

目的：体外分离、培养和鉴定胎小鼠神经干细胞（NSC）并检测其一氧化氮合酶（NOS）的表达，为进一步阐明NOS在NSC中的作用奠定基础。方法：利用含EGF的条件培养基，从胚胎小鼠大脑皮层中分离并体外培养胎小鼠NSC，在含胎牛血清的培养基中诱导其分化；用充纯氮气的方法造成细胞缺氧，观察缺氧对NOS的诱导作用；免疫组织化学方法检测细胞中nestin,nNOS,eNOS和iNOS的表达。结果：原代培养的细胞具有连续增殖并形成克隆的能力，在含血清的培养基中能分化为神经元及神经胶质细胞样细胞；免疫组化nestin,nNOS和eNOS在一般培养条件下呈阳性表达，而iNOS呈阴性表达，经充氮气缺氧诱导后，iNOS呈阳性表达。结论：成功分离并培养小鼠NSC；发现不同亚型的NOS在NSC不同培养条件下有不同的表达。     

小鼠神经干细胞的分离培养

目的 探讨小鼠神经干细胞的体外分离培养方法。方法 采用贴壁培养法,从成体小鼠大脑皮层分离并体外培养成体小鼠大脑皮层细胞,制成细胞悬液后将其置入DMEN/F12(1:1)液(包括15％FCS,bFGF20ng/ml,青霉素100u/ml和链霉素100u/ml)培养,获得细胞克隆。应用免疫组织化学技术检测克隆细胞巢蛋白(Nestin)的表达。结果原代及传代培养的细胞均可持续分裂增殖形成细胞克隆;克隆细胞表达巢蛋白(Nestin)。结论 分离的细胞在体外具有很强的增殖能力和自我更新能力,表达Nestin的为中枢神经系统的干细胞。     

神经干细胞球和单层贴壁神经干细胞的培养及鉴定

目的：探讨小鼠大脑皮层源性神经干细胞（NSCs）体外培养的两种方法并对培养的细胞进行鉴定。方法：分别取孕14-16d的昆明小鼠胚胎脑皮质并用细胞球悬浮培养和单层贴壁培养两种方法进行体外培养，用光学显微镜观察NSCs的生长情况，并用免疫细胞化学鉴定NSCs特异性抗原的表达，经过血清对NSCs分化诱导后进行胶质纤维酸性蛋白及微管相关蛋白．2的检测。结果：①培养出来的细胞可以扩增生长；②这两种方法分别培养的神经干细胞球和单层神经干细胞经抗巢蛋白免疫细胞染色均呈阳性；③两种培养方法培养出的NSCs经诱导分化后，免疫细胞化学染色显示微管相关蛋白-2、神经胶质酸性蛋白染色阳性。结论：采用无血清培养基中加入特定生长因子的神经干细胞球培养和单层贴壁两种培养技术，可培养出在体外稳定增殖并有多向分化潜能的NSCs。     

小鼠神经干细胞的分离和培养及其鉴定

目的：探讨体外分离和培养及鉴定小鼠神经干细胞,为相关的实验研究奠定基础。方法：利用神经干细胞条件培养基和单细胞克隆技术,从胚胎小鼠大脑皮质分离并体外培养胚胎期小鼠大脑皮质细胞,连续稳定传代20代后,以免疫荧光细胞化学法检测克隆细胞Nestin和分化后细胞中胶质原纤维酸性蛋白、β-tublin和半乳糖苷酶的表达。结果：从小鼠大脑皮层分离的细胞群具有连续形成克隆能力,其Nestin表达阳性。分化后的细胞可表达神经元、星形胶质细胞和寡突胶质细胞的特异性抗原。结论：成功分离并获得了小鼠皮层神经干细胞,该细胞可连续稳定传代,具备多向分化潜能,可用于进一步的实验研究。     

小鼠胚胎神经干细胞体外培养及鉴定的实验研究

目的:探讨小鼠胚胎神经干细胞体外分离培养增殖及分化,为进一步的实验研究提供基础。方法:分离孕13～15d的小鼠胚胎脑组织,在加入碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮细胞生长因子(EGF)的B27无血清培养基中克隆培养,并用10%的胎牛血清诱导其贴壁分化,应用免疫荧光染色方法行巢蛋白(Nestin),β-微管蛋白(β-tublin),胶质纤维酸性蛋白(GFAP)染色,对神经干细胞(NSCs)及其分化的细胞进行鉴定。结果:分离培养的细胞可形成典型的神经球,并传代。细胞表达神经巢蛋白,并可诱导分化为神经细胞和神经胶质细胞。结论:小鼠胚胎神经干细胞能够在体外适宜的条件下大量增殖,并且具有多向分化潜能。     

胎鼠神经干细胞分离培养和鉴定

目的:建立胎鼠神经干细胞体外培养方法,观察神经干细胞生长特点。方法:采用含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)的无血清培养基对大鼠胚胎大脑组织细胞悬液进行培养,细胞免疫荧光方法对神经干细胞鉴定,MTT法测定不同细胞密度的OD值,绘制生长曲线。结果:从胎鼠脑组织分离培养的细胞巢蛋白阳性。MTT结果显示细胞接种密度以2(×104～105)/ml生长良好(r=0.95,P<0.05)。结论:无血清培养基分离培养的胎鼠脑组织神经干细胞具有自我更新和增殖能力,巢蛋白细胞免疫鉴定为神经干细胞。     

小鼠孤雌胚胎干细胞直接向神经细胞诱导分化的实验研究

目的探讨小鼠孤雌胚胎干细胞在体外不经过拟胚体(EB）阶段,直接诱导分化为神经细胞的可行性。方法采用阶段诱导的方法,首先由孤雌胚胎干细胞向神经前体细胞定向分化,通过巢蛋白(nestin)免疫荧光细胞化学染色对神经前体细胞进行鉴定。在此基础上,撤除丝裂原,加入5%胎牛血清,观察已分化的神经前体细胞能否进一步分化为神经细胞,并对分化出的细胞进行免疫荧光细胞化学鉴定。结果经选择培养基培养3?d后的孤雌干细胞绝大多数可诱导为神经前体细胞,nestin呈阳性。加入血清进一步诱导,可分化出β-Ⅲ-tubline阳性的神经细胞。结论小鼠孤雌胚胎干细胞在体外不经EB培养阶段,可直接诱导分化为神经细胞,并且前期可得到大量的神经前体细胞。     

小鼠胚胎干细胞饲养层的制备

目的：探讨小鼠胚胎干细胞饲养层细胞的制备。方法：小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层细胞培养胚胎干细胞。另在无饲养层细胞培养液中,含白血病抑制因子条件下培养小鼠胚胎干细胞,观察两种情况下胚胎干细胞的生长情况。结果：小鼠胚胎成纤维细胞呈放射状或旋涡状走行,胚胎干细胞呈克隆状生长。结论：胚胎干细胞能良好生长,且保持未分化状态。     

人体胚胎干细胞蛋白质组学的研究进展

人体胚胎干细胞是一类具有自我更新能力的多潜能细胞,在一定条件下,可分化成超过200种人体细胞类型,它在发育生物学和再生医学中具有重要的研究价值。其多潜能性使得一系列疾病,包括癌症、阿尔茨海默病和帕金森病的治疗看到了希望。而胚胎干细胞蛋白质组学的研究对揭示胚胎干细胞增殖和分化的机制以及其多潜能的维持具有重大意义。在此,总结在过去几年中已报道的部分关于人体胚胎干细胞蛋白质组学研究取得的进步及其对人体胚胎干细胞研究的促进作用。     

胚胎干细胞诱导的内皮细胞对自身向成骨细胞分化的影响

目的探讨由胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESCs）诱导的内皮细胞（endothelial cells,Ec）与自体胚胎干细胞联合培养时对ESCs成骨作用的影响。方法提取小鼠的胚胎干细胞和胚胎成纤维细胞,诱导胚胎干细胞生成Ec,培养细胞分为四组。A组：胚胎干细胞诱导组;B组：胚胎干细胞诱导组;C组：胚胎干细胞诱导生成的内皮细胞（Ec）诱导组;D组：ESCs和诱导的EC联合培养诱导组。通过干细胞形态的观察、免疫荧光、细胞的增值、碱性磷酸酶以及骨钙素含量的测定从酶学、组织学及生化学等不同方面观测骨髓基质细胞对胚胎干细胞向成骨细胞诱导转化的影响。结果通过细胞免疫荧光染色证实C组培养诱导的细胞为EC。D组ESCs和诱导的Ec联合培养组MTT检测结果各组细胞生长差异没有显著意义（p〉0.05）,骨钙素和碱性磷酸酶测定D组有明显差异高于其他3组（p〈0.05）。结论以胚胎干细胞诱导生成的内皮细胞对胚胎干细胞的成骨有明显的促进作用。     

体外诱导人胚胎干细胞定向分化为神经干细胞

目的:探讨体外定向诱导人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)生成高纯度神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的方法.方法:模拟体内神经细胞分化发育的不同阶段及微环境,分三阶段诱导hESCs定向生成NSCs.形态学观察结合免疫荧光细胞化学、流式细胞术和RT-PCR检测胚胎干细胞标志和神经干细胞标志;NSCs分化实验对所诱导的NSCs的分化潜能进行检测.结果:体外培养的hESCs在胚胎成纤维细胞饲养层上连续传代培养50代,仍保持SSEA-4,TRA-1-81阳性,表达Nanog基因,流式细胞术检测SSEA-4阳性表达率为83.44%;经三步法最终可诱导形成纯度高达90%以上的nestin阳性细胞,表达nestin基因,流式细胞术检测nestin阳性表达率为89.38%;诱导生成的细胞反复传代,仍表现为nestin阳性,并可进一步分化为神经元、星形神经胶质细胞和少突胶质细胞.结论:模拟体内神经分化过程的三步诱导法,可诱导hESCs生成较高纯度的NSCs,并能较好维持其干细胞特性和具有进一步分化的能力.     

同种异体神经干细胞移植治疗大鼠脑内出血的研究

目的　探讨神经干细胞移植对实验性大鼠脑内血肿的治疗作用。方法　脑内注血制作脑出血模型;乳鼠脑组织分离培养神经干细胞;细胞免疫组化鉴定细胞;血肿周围多点注射法移植神经干细胞;神经系统评分、正电子发射计算机断层扫描测脑组织代谢等方法衡量神经干细胞移植后治疗效果。结果　移植组与对照组相比神经系统评分无显著差异(P>0.05),移植组血肿周围脑组织代谢显著高于对照组相应脑区(P<0.01)。结论　移植的神经干细胞在大鼠脑内血肿周围能够成活,但不能改善神经功能缺失的症状。     

大鼠背根神经节源干细胞分离培养和鉴定

目的：探讨大鼠背根节（DRG）内是否存在神经干细胞。方法：取胚胎大鼠DRG进行原代细胞培养,观察其增殖与分化情况,并行P75BrdU/Nestin,GFAP,NF200免疫荧光组织化学鉴定。结果：细胞培养获得大量能够分裂增殖且呈巢状悬浮生长的干细胞团,呈P75BrdU/Nestin免疫荧光组织化学阳性反应;培养第三代细胞加入胎牛血清10d后,相差显微镜下可见部分细胞伸出多个细长突起,且免疫组化呈NF200阳性;部分细胞具有扁平多突起的或双极细胞形态,免疫组化呈GFAP染色阳性。细胞球经NGF培养诱导1d左右有些神经元样的细胞开始迁出,随着时间增长迁出的细胞越来越多,并且细胞和细胞之间发生联系,形成交错的复杂网络,迁出的细胞经免疫组化鉴定几乎都是呈NF200免疫染色阳性。结论：大鼠DRG内存在有神经干细胞,这些细胞可以分化为神经元和神经胶质细胞。     

小鼠下丘脑和海马组织神经干细胞的蛋白质组学分析

采用蛋白质组学法探讨C57BL/6J小鼠下丘脑和海马组织中神经干细胞（NSCs）中蛋白质表达差异,阐明不同来源（区域）NSCs中蛋白表达谱不同的原因,为下丘脑和海马组织NSCs的基础研究和移植治疗提供参考。