西洋参赤霉素20-氧化酶基因的克隆与序列分析

目的对西洋参Panax quinquefolium种子休眠与萌发过程中赤霉素20-氧化酶(GA20ox)基因编码区进行克隆及生物信息学分析。方法根据西洋参种子转录组的注释信息,得到9条GA20ox相关序列,通过比对分析确定了GA20ox的转录本。采用q RT-PCR方法得到西洋参GA20ox(Pq GA20ox)的c DNA全长,并对其编码蛋白进行生物信息学分析。采用实时荧光定量PCR方法检测Pq GA20ox基因在根、茎、叶和种子休眠不同时期的表达水平。结果生物信息学分析表明,Pq GA20ox基因全长1 092 bp,编码363个氨基酸残基,Pq GA20ox编码蛋白不含跨膜区,不含信号肽。q RT-PCR实验结果显示Pq GA20ox基因在形态休眠起始期和生理休眠起始期表达量高于其他时期。结论首次获得Pq GA20ox基因的编码区序列,为进一步研究西洋参种子解除休眠的分子机制奠定基础。     

太子参3个肌动蛋白基因片段的克隆与序列分析

目的克隆太子参肌动蛋白(Actin)基因片段并进行序列分析。方法利用植物Actin基因的保守序列设计简并引物,通过RT-PCR和抑制PCR扩增太子参Actin基因核心片段。利用半定量RT-PCR分析太子参Actin基因在不同种源、不同器官、不同生长发育时期的表达情况。结果通过RT-PCR获得3条太子参Actin基因的核心片段,长度均为760 bp,依次命名为PhACT1、PhACT2、PhACT3。通过抑制PCR及序列拼接后3条核心片段依次延长至1 008、1 008、975 bp,分别编码336、336、325个氨基酸残基。半定量RT-PCR分析表明PhACT2和PhACT3基因在不同种源、不同器官、不同生长发育时期的表达量基本恒定,PhACT1基因存在一定的差异。结论首次从太子参中克隆得到3条太子参Actin基因序列,并确定PhACT2基因适合作为太子参功能基因表达分析的内参基因。     

太子参玉米黄质环氧化酶基因的克隆与表达分析

玉米黄质环氧化酶(zeaxanthin epoxidase,ZEP)在植物脱落酸(abscisic acid,ABA)生物合成间接途径中发挥着重要调节作用。该研究根据太子参转录组数据,克隆获得太子参的Pseudostellaria heterophylla玉米黄质环氧化酶基因,命名Ph ZEP。对其序列进行生物信息学分析,结果表明Ph ZEP的开放阅读框(open reading frame,ORF)为1 263 bp,编码420个氨基酸,预测其蛋白的相对分子质量为47.34 k Da,等电点(theoretical p I)为6.64;具有脂质蛋白附着点和黄素蛋白单加氧酶的特征性结构域,且在N端含有分泌信号肽。实时荧光PCR分析发现,Ph ZEP在叶片中表达量最高,其次是茎和须根;Ph ZEP在盛花期后10,40 d块根中的表达量较高;ABA处理后Ph ZEP表达量与对照组相当,经氟啶酮处理后Ph ZEP的表达量显著高于对照组。该研究从太子参中分离鉴定了ZEP基因,对后续研究其基因的功能特点和解析ABA在太子参生长发育过程的遗传调控提供研究基础。     

铁皮石斛赤霉素3-氧化酶基因的克隆及表达分析

目的克隆珍稀濒危药用植物铁皮石斛Dendrobium officinale赤霉素3-氧化酶(gibberellin 3-oxidases,GA3ox)基因(Do GA3ox),并进行生物信息学和表达分析。方法采用RACE和RT-PCR技术获得Do GA3ox基因c DNA全长;利用生物信息学软件预测其编码蛋白的理化性质、结构域及亚细胞定位等分子特性;用DNASTAR 7.0和MEGA 6.0软件分别对其进行氨基酸多序列比对和进化关系分析;借助实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测基因表达模式。结果克隆到Do GA3ox基因(Gen Bank注册号KT597694),c DNA全长1 318 bp,编码一条由353个氨基酸组成的多肽,相对分子质量为39 052.5,等电点6.21;Do GA3ox蛋白不含跨膜域和信号肽,具有GA3ox的保守结构域DIOX_N(40~130)和2OG-Fe II_Oxy(197~299);Do GA3ox与大葱、油棕、海枣、野茶树及蓝猪耳GA3ox蛋白一致性分别为55%、56%、54%、51%、50%,与单子叶植物大葱、油棕和海枣的亲缘关系较近。q RT-PCR实验结果显示Do GA3ox基因在铁皮石斛种子共生(非共生)萌发1~3级时,其相对表达量呈现出先升高后降低再升高的趋势,分别为未萌发种子的13.44(5.21)、7.28(2.32)和9.40(6.21)倍,由此可知,该基因在共生萌发种子中的表达量高于非共生萌发种子。结论首次克隆得到1个Do GA3ox基因的全长c DNA,其转录本在共生和非共生不同萌发级别种子中的表达特性说明该基因在铁皮石斛种子萌发中起着重要调控作用。     

鞘蕊苏赤霉素氧化酶基因的克隆及表达研究

目的:克隆和表达鞘蕊苏赤霉素氧化酶基因,为提高湖北栽培的鞘蕊苏有效成分含量奠定基础。方法:提取鞘蕊苏叶片的总RNA,利用套式聚合酶链式反应(PCR)技术克隆获得CfGA01基因全长。结果:完整的赤霉素氧化酶基因全长1234 bp,编码355个氨基酸,命名为CfGA01;通过构建系统进化树比较CfGA01与其他物种中的赤霉素氧化酶基因的亲缘关系,发现CfGA01与丹参GA蛋白的亲缘关系比较近,最后成功构建了赤霉素氧化酶基因原核表达载体PGCfGA01,并成功进行了表达。结论:克隆得到鞘蕊苏赤霉素氧化酶基因全长并构建原核表达载体,为研究鞘蕊苏有效成分合成酶奠定了基础。     

西洋参PqGA2ox基因的克隆与序列分析

目的 克隆、分析西洋参Panax quinquefolium种子萌发过程的赤霉素2-氧化酶(gibberellin 2-oxidase,GA2ox)基因.方法 从前期由高通量测序得到78 207条unigenes基因的注释信息中挖掘出与赤霉素合成和分解代谢相关的基因序列,得到11条GA2ox基因相关序列,通过序列比对分析确定GA2ox的转录本.根据选定的unigene序列设计引物,采用PCR方法扩增西洋参GA2ox的cDNA全长;利用生物信息学方法分析所得基因,并用实时荧光定量PCR技术进行表达分析.结果 得到一条长度为987 bp,编码328个氨基酸残基的西洋参GA2ox基因,命名为PqGA2ox.生物信息学预测PqGA2ox蛋白不含跨膜区,不含信号肽,具有依赖于2-酮戊二酸和Fe²⁺的双加氧酶超家族的保守结构域.实时荧光定量PCR结果显示在形态休眠中期和生理休眠中期的表达量低于其休眠起始期和解除休眠期.结论 首次获得西洋参种子PqGA2ox基因的编码区序列,为进一步研究西洋参种子解除休眠的分子机制奠定基础.     

滇重楼GAox基因的克隆与生物信息学分析

目的:克隆编码滇重楼赤霉素合成代谢途径中关键酶GA氧化酶(Gibberellic oxidase,GAox)的全长cDNA序列,并进行生物信息学分析。方法:根据滇重楼转录组测序序列,设计特异性PCR引物,利用RT-PCR技术扩增目标基因编码区的全长序列连接至pMD18-T载体上,进行序列测定及序列同源性比较分子系统进化树构建、结构域搜索及蛋白质三维结构预测等生物信息学分析。结果:成功克隆了滇重楼的的6条GAox基因,大小在1000 bp左右,分别命名为PpGA2ox1、PpGA2ox2、PpGA2ox3、PpGA2ox4、PpGA20ox1和PpGA3ox1。6条基因分别属于GA氧化酶三个不同的亚家族。滇重楼GAox蛋白氨基酸数量均在300~400,理论等电点在4~7左右,带正电荷。PpGA2ox1、PpGA2ox2和PpGA2ox4为不稳定蛋白,PpGA2ox3、PpGA20ox1和PpGA3ox1为稳定蛋白,均为没有跨膜结构域和信号肽的亲水蛋白。除了PpGA2ox1亚细胞定位在叶绿体,其他蛋白均定位在细胞质。滇重楼GAox蛋白与不同物种同源序列的序列相似性较高,保守性比较强。结论:首次从滇重楼中克隆了6条GAox基因并对其进行了初步的生物信息学分析。     

太子参醛氧化酶基因克隆及表达分析

目的:获取太子参醛氧化酶(abscisic acid aldehyde oxidase,AAO)基因。方法:基于AAO基因的同源性和太子参转录组数据库,以块根为材料,利用3'-RACE技术和PCR技术克隆获取AAO基因序列,通过qRT-PCR技术检测该基因在太子参茎、叶、须根,不同生长时期及经外源脱落酸及其抑制剂处理后的块根中表达情况。结果:克隆获得太子参Ph AAO基因序列长6 773 bp,含完整开放阅读框(4 053 bp),由10个外显子和9个内含子组成,氨基酸结构预测其含有钼-黄素酶家族基因特有的结构域。qRT-PCR分析显示Ph AAO基因在太子参叶、须根中显著表达,在块根形成的关键时期6月中旬表达量最高;脱落酸和氟啶酮处理后PhAAO基因表达上调,其中氟啶酮处理组较为明显。结论:获得太子参Ph AAO基因序列,并进一步研究该基因的表达情况,为后续研究其功能特点,探讨太子参脱落酸生物合成分子机制奠定理论基础。     

茯苓细胞色素P450基因PcCYP的克隆与序列分析

目的 筛选与茯苓Poriacocos生长发育相关的细胞色素P450基因序列,进一步丰富对茯苓生长发育理解。方法通过分子克隆到1个茯苓细胞色素P450基因Pc CYP,并利用在线工具分析其序列,预测蛋白的理化性质、结构域等分子特征;利用MEGA5.0分别对氨基酸进行多序列比对和进化关系分析,并采用q RT-PCR方法检测不同发酵培养时间6、8、10d的相对表达量。结果 从茯苓中克隆到的Pc CYP存在可变性剪切,2个选择性剪切体PcCYP1和Pc CYP2CDS区长度分别为1590、1542bp,分别编码529、513个氨基酸。氨基酸序列分析发现其均具有保守的P450结构域,且具有信号肽和多个磷酸化修饰位点,属于分泌型的不稳定亲水蛋白。氨基酸序列多重比对及系统发育树结果显示PcCYP与担子菌Coprinopsis cinerea的CYP502距离最近,推测PcCYP和CYP502具有相似功能,即参与调控茯苓子实体的发育。定量PCR结果显示,选择性剪接变体Pc CYP1的表达量较Pc CYP2低,因此PcCYP2是Pc CYP基因的主要剪接体。结论 Pc CYP与茯苓子实体的生长发育密切相...     

太子参环肽HA生物合成关键酶基因PhAEP的克隆与功能验证

为研究天冬酰胺内肽酶(AEP)基因在太子参环肽类化合物生物合成机制中的作用,对太子参转录组数据库进行系统挖掘和筛选,成功克隆到1条AEP基因,暂命名为PhAEP,本氏烟草异源功能验证表明该基因的表达在太子参环肽HA的生物合成中发挥着作用。生物信息学分析表明,PhAEP基因的cDNA全长为1 488 bp,编码495个氨基酸,相对分子质量为54.72 kDa。系统进化树结果发现PhAEP编码的氨基酸序列与蝶豆Butelase-1酶的序列相似度较高,达到80%。多序列同源比对与环化酶活性位点分析发现PhAEP酶可能具有特异性水解太子参环肽HA线性前体肽中核心肽C端Asn/Asp(Asx)位点,进而参与线性前体肽成环的功能。实时荧光定量PCR检测结果表明PhAEP在果实中表达量最高,根中次之,叶中表达量最低。烟草瞬时共表达太子参环肽HA前体基因PrePhHA与PhAEP的材料中检测到有太子参环肽HA生成。该研究成功克隆到太子参环肽HA生物合成关键酶基因PhAEP,为进一步解析PhAEP酶在太子参环肽HA生物合成的分子机制奠定基础,对太子参环肽类化合物的合成生物学研究有重要意义。     

不同产地加工方法太子参核苷类成分Q-TRAP-LC-MS/MS分析

目的探讨不同加工方法对太子参核苷类成分量的影响。方法采用Q-TRAP-LC-MS/MS技术同时测定不同加工太子参药材中13种核苷类成分的量。结果太子参核苷类成分中,以胞苷、尿苷、肌苷、鸟苷、胸苷的量较高;不同加工方法对太子参中核苷的量有一定影响,烘干样品核苷的量普遍高于晒干样品。结论为揭示加工对太子参化学成分的影响及优选太子参适宜产地加工方法提供基础资料。     

党参CpUGPase基因的克隆、序列分析与原核表达

目的为研究党参多糖代谢途径,从党参Codonopsis pilosula根中克隆多糖代谢关键酶尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶CpUGPase基因,并进行序列分析和原核表达。方法根据党参转录组中CpUGPase基因序列设计引物,通过RT-PCR扩增得CpUGPase开放阅读框(ORF)序列,并进行TA克隆、测序和序列分析;构建原核表达载体PET-28a-CpUGPase,转入大肠杆菌BL21(DE3)后,在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下进行表达。结果 CpUGPase ORF序列全长1 413bp,编码470个氨基酸。序列分析表明,CpUGPase基因具有保守的UGPase_euk催化位点,属于A型糖基转移酶蛋白家族。构建PET-28a-CpUGPase重组质粒,获得稳定的原核表达体系。SDS-PAGE结果显示该蛋白的大小约54 900,与预测的蛋白相对分子质量一致。结论从党参根中克隆得到CpUGPase基因,并建立了稳定的原核表达体系,为进一步纯化CpUGPase蛋白,研究其结构和功能奠定了基础。     

太子参化学成分、药理作用和应用的研究进展

太子参Pseudostellariae Radix是中国传统补益中药材之一,兼具药用和食疗功效,主要含有挥发油、多糖、环肽、生物碱、皂苷、酚类等成分,具有降血糖、抗炎、抗癌、保护细胞、抑制酪氨酸酶、免疫调节等药理作用。对太子参的化学成分及其药理作用,以及太子参在临床、食疗、保健食品、化妆品、兽药制剂和功能性饲料添加剂等方面应用进行总结,为太子参进一步开发利用提供依据。     

铁皮石斛2个F家族ABC转运蛋白基因的克隆和表达研究

目的克隆铁皮石斛Dendrobium officinale ABC(ATP-binding cassette)转运蛋白F家族基因并进行生物信息学分析。方法利用RACE从铁皮石斛叶片cDNA中分离ABC基因,并进行编码蛋白相对分子质量、等电点、结构域、信号肽、跨膜域及亚细胞定位等生物信息学分析;采用DNASTAR和MEGA6进行氨基酸多序列比对和分子进化分析;借助实时荧光定量PCR技术检测基因组织表达模式。结果从铁皮石斛中分离到2个F家族ABC转运蛋白基因DoABCF1和DoABCF2(Gen Bank注册号KU160474和KU160475),全长为2 104 bp和2 193 bp,各编码1条由600和659个氨基酸组成的肽链,相对分子质量67 030和74 140,等电点6.20和5.71;DoABCF1和DoABCF2蛋白均包含2个保守的ABC结构域(分别为74~314、385~600和65~323、392~607)和多个基元;2个蛋白不含信号肽或跨膜域,预测均定位在叶绿体。2个基因与植物F家族ABC转运蛋白基因相似性高达80%以上,与玉米和水稻等单子叶植物F家族ABC转运蛋白基因亲缘关系较近。DoABCF1和DoABCF2基因转录本在石斛3个器官中差异表达且均在叶中高度表达,茎和根中相对表达量差异不显著;以茎为校正样本,前者在根中相对表达量为茎中的1.74倍,后者在叶中表达量为茎中的3.44倍。结论成功获得DoABCF1和DoABCF2基因全长cDNA,二者在铁皮石斛叶中的高表达特征暗示其可能在铁皮石斛生长发育过程中起一定作用。     

猪苓菌核2种热激蛋白基因的克隆及其表达分析

该研究采用RT-PCR技术从中国野生猪苓菌核Polyporus umbellatus中克隆得到2种热激蛋白基因,其中Pu Hsp90基因的开放阅读框2 091 bp,编码696个氨基酸,推导的蛋白质相对分子质量约78.9 k Da;Pu Hsp70基因的开放阅读框1 944 bp,编码647个氨基酸,推导的蛋白质相对分子质量约70.5 k Da;蛋白质结构预测及同源比对分析表明,这2个基因编码的核苷酸序分别具有Hsp90,Hsp70蛋白的保守结构域。进化树分析表明,Pu Hsp90与变色栓菌Hsp90聚为一类,Pu Hsp70与肝色牛排菌Hsp70聚为一类。qRT-PCR分析表明,蜜环菌侵染的情况下,这2个基因在猪苓菌核中均上调表达。这2个基因在蜜环菌侵染猪苓菌核的状态下有相同的表达模式,预示这2个基因其可能在抗生物胁迫中起重要作用。     

菘蓝中肉桂酸-4-羟基化酶基因克隆与表达分析

目的克隆菘蓝中肉桂酸-4-羟基化酶(C4H)基因,并进行生物信息学和表达分析。方法采用c DNA末端快速扩增(RACE)技术克隆C4H基因全长c DNA序列,进而获得其基因组DNA序列。通过RT-PCR法检测C4H蛋白在不同器官中及受到相应刺激因素下的表达情况。结果菘蓝C4H基因全长c DNA为1 674 bp(Gen Bank登录号:GU014562),包含一个1 530bp的开放阅读框(ORF),编码509个氨基酸残基。对应的基因组分析表明,C4H基因含2个内含子,3个外显子。在根、茎、叶各器官中均有表达,其中根中最多。胁迫因素紫外照射(UV-B)、茉莉酸甲酯(Me JA)、脱落酸(ABA)和赤霉素(GA3)在一定程度上能够诱导C4H的表达上调。结论首次从菘蓝植物中克隆得到C4H基因的c DNA全长序列,并证实其在根中表达量最高,且在胁迫因素下表达量上调,为进一步研究菘蓝中抗病毒活性成分木质素类成分的次生代谢工程奠定基础。     

罗马洋甘菊吉马烯A合成酶基因的克隆与表达分析

目的从罗马洋甘菊Chamaemelum nobile中克隆萜类化合物合成关键酶吉马烯A合成酶(germacrene A synthase,GAS)cDNA全长,并对其进行生物信息学和组织表达分析。方法基于前期对罗马洋甘菊转录组测序结果,设计特异性引物,利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增得到GAS的cDNA全长,利用生物信息学手段对其核苷酸和编码的氨基酸序列进行分析,并预测其编码的蛋白质的理化性质和功能。通过实时定量PCR技术(qRT-PCR)检测罗马洋甘菊GAS基因(CnGAS)在罗马洋甘菊不同组织的表达水平。结果扩增得到的罗马洋甘菊吉马烯A合成酶基因的cDNA全长为1 785 bp,命名为CnGAS(GenBank登录号为KU589283),包含1个1 683 bp的开放阅读框(ORF),编码561个氨基酸,预测的相对分子质量和等电点分别为6 470和5.21。CnGAS基因编码的氨基酸序列与其他植物的GAS蛋白高度同源,且含有DDxx D保守序列。系统进化树表明CnGAS基因与菊科植物的GAS基因的亲缘关系最近。qRT-PCR结果显示CnGAS基因在罗马洋甘菊各组织中均有表达,且花中表达量最高。结论从罗马洋甘菊中克隆得到CnGAS基因,分析了该基因在不同组织中的表达水平,为罗马洋甘菊萜类化合物的生物合成代谢途径的研究奠定了基础。     

藏药川西獐牙菜中SmMK基因的克隆及生物信息分析

目的了解川西獐牙菜Swertia mussotii Franch甲羟戊酸途径中的关键酶甲羟戊酸激酶基因(MK)的功能,并进一步推进川西獐牙菜中的甲羟戊酸途径的研究。方法根据川西獐牙菜的转录组信息,获得了川西獐牙菜MK(SmMK)基因的全长c DNA序列,并且设计了特异性引物,利用RT-PCR对该基因进行了克隆;利用生物信息学方法,对Sm MK基因的序列进行分析;构建原核表达载体MBP-SmMK,转入大肠杆菌Rosetta(DE3)中,然后对Sm MK基因进行了原核表达,并对其进行了纯化。结果 Sm MK基因cDNA全长为1 164 bp,共编码387个氨基酸。SmMK与其他植物中的MK具有较高相似性。对其信号肽、跨膜区域、蛋白定位及二级结构和三维构象进行了预测分析。SDS-PAGE检测表明所纯化蛋白与预期蛋白的大小相一致,为40970。结论为进一步研究川西獐牙菜中MK的功能奠定了基础,并为进一步研究川西獐牙菜中的甲羟戊酸途径,提高川西獐牙菜中类异戊二烯化合物的产量提供了依据。     

基于UPLC-Triple TOF-MS/MS技术分析不同加工方法对太子参化学成分的影响

目的 分析不同加工方法对太子参Pseudostellariae Radix中化学成分的影响。方法 采用UPLC-Triple TOF-MS/MS技术对20批样品进行测定,通过多级串联质谱分析,结合Mass数据、软件数据库及相关文献对总离子流图主要分子离子峰进行归属,数据处理用SIMCA-P软件进行多元统计分析。结果 鉴定出11种化合物;主成分得分图显示,不同加工方法太子参样品间的差异得到明显区分,通过载荷图筛选出差异显著的11种标志物,且这11种标志物呈现出不同的变化规律。结论 为揭示不同加工方法对太子参代谢产物差异性的影响规律提供科学依据。     

当归咖啡酸-O-甲基转移酶基因克隆和序列分析

目的克隆当归Angelica sinensis咖啡酸-O-甲基转移酶(caffeic acid O-methyltransferases,COMT)编码基因全长c DNA,并对序列进行生物信息学分析。方法提取当归叶片总RNA为c DNA合成模板,利用同源克隆结合c DNA末端快速扩增(RACE)技术克隆当归COMT全长c DNA,并利用NCBI、Ex PASy网站上的Blast N、Blast P、ORF Finder、Compute PI/Mw、Prot Scale、PROSITE、SWISS-MODEL等序列在线分析工具和MEGA、DNAMAN生物信息学软件对序列进行分析。结果获得COMT全长c DNA序列,并在Gen Bank注册(登录号KP188587)。序列分析表明,克隆的c DNA全长为1 436 bp,其中包括5’-UTR(76 bp)和3’-UTR(362 bp),含有1个1 098 bp的完整开放阅读框(opening reading frame,ORF),编码365个氨基酸的多肽链;预测蛋白质相对分子质量为40 230,理论等电点(p I)为5.43;无信号肽,具有典型的II型氧甲基转移酶结构域SAM_OMT_II。结论首次克隆当归COMT基因全长c DNA,为当归COMT基因功能研究和当归阿魏酸生物合成与调控的机制研究奠定基础。