Ad5-增强型绿色荧光蛋白和rAAV2-增强型绿色荧光蛋白转染脂肪间充质干细胞的对比

背景:利用基因转染技术诱导脂肪间充质干细胞成软骨细胞已有报道,但腺病毒和腺相关病毒转染脂肪间充质干细胞各有不同,且腺相关病毒载体能否转染脂肪间充质干细胞众说不一.目的:观察Ad5-增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)和Raav2-EGFP转染脂肪间充质干细胞后增强型绿色荧光蛋白的表达及转染后细胞增值能力的变化.方法:脂肪组织来源于6月龄新西兰大白兔颈背部.机械消化和酶消化法分取脂肪间充质干细胞,体外培养扩增.分别采用腺病毒载体(Ad5-EGFP)和腺相关病毒载体(Raav2-EGFP)转染脂肪间充质干细胞,并观察EGFP的表达.Raav2-EGFP转染后,需加入2 Μl丁酸钠(1 mol/L).采用MTT法检测基因转染对脂肪间充质干细胞增殖能力的影响.结果与结论:体外培养的脂肪间充质干细胞呈扁平状和长梭形,细胞形态均一,传代稳定.Ad5-EGFP组和Raav2-EGFP组均能观察到较多荧光细胞,转染效率分别达到88%和83%.腺病毒和腺相关病毒载体均能转染脂肪间充质干细胞,且转染效率很高.腺相关病毒需要借助丁酸钠来提高其基因表达水平.     

重组腺病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因转染兔骨髓间充质干细胞

背景:目前仍没有合适的标记方法追踪观察兔骨髓间充质干细胞组织修复及基因治疗的效果.目的:观察重组腺病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因在兔骨髓间充质干细胞中的表达,及转染后干细胞活性的变化,以寻找稳定标记兔骨髓间充质干细胞的方法. 设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-03/05在南京市第一医院骨科干细胞实验室完成. 材料:健康2月龄纯种新西兰大白兔4只,由南京医科大学实验动物基地提供.重组腺病毒Ad5/F35-EGFP为北京本元正阳基因有限公司产品. 方法:用密度梯度离心法分离纯化兔骨髓间充质干细胞,贴肇法纯化扩增.取传至第4代细胞,流式细胞仪检测细胞标志的表达,消化离心重悬后进行计数,平均分成5组,每组细胞数5.0×105个,接种于25 m2培养瓶,空白组加入50 μL的PBS液,剩余4组加入重组腺病毒Ad5/F35-EGFP进行转染,感染复数(MOI)分别为10,20,50,100,继续传代培养.主要观察指标:骨髓间充质干细胞的生长状态及表面标志鉴定,转染后骨髓间充质干细胞增强型绿色荧光蛋白的表达及活性变化.结果:原代培养48 h后见细胞贴壁,8 d时细胞铺满瓶底80%以上,绝大多数呈梭形,传代后细胞增殖速度加快,三四天即可传代,第4代细胞CD29和CD44呈阳性表达,CD34与CD45呈阴性表达.转染后24 h可见绿色荧光,7 d时荧光最强,细胞转染率与感染复数值的呈线性增长关系,至49 d时仍可见绿色荧光.转染后0,7,14,28,49 d,感染复数=50组的骨髓间充质干细胞数量均与空白组基本相似(P均>0.05),即转染后细胞增殖能力无明显变化. 结论:重组腺病毒载体能高效标记骨髓间充质干细胞,感染复数为50时较为理想,增强型绿色荧光蛋白基因可持续表达49 d,且标记后不影响骨髓间充质干细胞的增殖活性.     

不同重组病毒载体转染大鼠骨间充质干细胞的效率及其基因表达

背景:利用基因工程细胞进行替代治疗和基因治疗中合适的供体细胞、靶细胞以及相应载体是细胞和基因治疗最为困难的部分.目的:检测重组腺病毒Ad5和Ad5F35、腺相关病毒rAAV1/2和rAAV2、慢病毒LV对大鼠骨髓间充质干细胞的感染效率和外源基因表达水平,拟筛选能够高效转导骨髓间充质干细胞的载体.设计、时间及地点:细胞基因工程对照观察,于2006-10/2007-03在上海市第一人民医院中心实验室完成.材料:清洁级SD大鼠10只用于制备骨髓间充质干细胞.所有重组病毒均携带增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)报告基因,AdS由本实验室制备,Ad5F35由解放军第二军医大学钱其军教授惠赠,rAAV2及rAAV1/2为本元正阳基因技术有限公司产品,LV由中科院上海生化与细胞生物学研究所郭礼和教授惠赠.方法:采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,传至第4代用于实验.按1×105/孔接种于24孔细胞培养板中,1 d后细胞贴壁,设立5组:第1组向细胞培养液中加入10,100,1 000 MOI Ad5-EGFP,第2组加入10,100,1 000 MOIAdSF35-EGFP,第3组加入1×104,1×105vg rAAV1/2-EGFP,第4组加入1×104,1×105vg rAAV2-EGFP,第5组加入30 TU LV-EGFP.Ad病毒感染2d,rAAV及LV病毒感染6d.主要观察指标:EGFP阳性表达及荧光强度.结果:Ad3-EGFP感染24 h后镜下可见EGFP阳性细胞,随着病毒用量的增加EGFP阳性细胞数目增多,荧光亮度增强,12d后阳性细胞开始逐渐减少,荧光亮度减弱.AdSF35-EGFP感染情况与Ad5-EGFP基本相似,但EGFP阳性细胞数和荧光亮度均增加.rAAV1/2-EGFP或rAAV2-EGFP感染6 d后,EGFP阳性细胞数和荧光亮度均较弱.LV-EGFP感染第2天即可见少量EGFP阳性细胞,随着时间延长EGFP阳性细胞数目逐渐增多,至第6天表达EGFP荧光的细胞数量及亮度不再有明显变化.结论:腺病毒Ad5、AdSF35与慢病毒LV能够有效感染体外培养的骨髓间充质干细胞,并表达外源基因,感染效率与病毒用量之间存在量效关系.腺相关病毒rAAV1/2和rAAV2体外感染效果不佳.     

5和5/F35型腺病毒载体对人骨髓间充质干细胞转染效率的比较

背景:在以人骨髓间充质干细胞为基础的基因治疗中,提高腺病毒载体对人骨髓间充质干细胞的转染效率尤为重要.目的:对比观察5和5/F35型腺病毒载体对体外培养的人骨髓间充质干细胞的转染效率.设计、时间及地点:对比观察,于2008-03/10在解放军北京军区总医院血液科实验室完成.材料:骨髓来源于解放军北京军区总医院血液科异基因造血干细胞移植中健康供者,均无造血系统疾病.方法:采用密度梯度离心和贴壁筛选的方法体外分离培养人骨髓间充质干细胞,传至第3代后用流式细胞仪检测人骨髓间充质干细胞表型;按1×104/孔密度接种于24孔板,细胞贴壁后分别换用成骨、成脂诱导液培养,以碱性磷酸酶、油红O染色检测其分化特性.用不同滴度编码增强型绿色荧光蛋白基因的腺病毒载体Ad5增强型绿色荧光蛋白和Ad5/F35增强型绿色荧光蛋白按5,20,100,400感染复数转染体外培养的人骨髓间充质干细胞,荧光显微镜下观察.主要观察指标:流式细胞仪检测增强型绿色荧光蛋白阳性表达率,并用锥虫蓝拒染法检测不同病毒滴度感染后人骨髓间充质干细胞活细胞比例.结果:人骨髓间充质干细胞表面CD166、CD29、CD73、CD31、CD45、CD34和CD14阳性率分别为95.08%、99.53%、72.26%,1.50%,2.02%,3.80%和4.94%.人骨髓间充质干细胞成骨诱导后14 d碱性磷酸酶染色为阳性,成脂诱导后14 d油红O染色均为阳性.Ad5增强型绿色荧光蛋白和Ad51F35增强型绿色荧光蛋白按5,20,100,400感染复数分别感染人骨髓间充质干细胞,2 d后前者增强型绿色荧光蛋白阳性牢分别为(0.72±0.14)%,(4.97±0.46)%,(9.80±3.43)%和(45.53±6.32)%:后者增强型绿色荧光蛋白阳性率分别为(24.31±10.55)%,(55.19±13.73)%,(87.68±9.5)%和(96.57±5.64)%.在5,20,100的感染复数,各组细胞存活率均在95%以上.在400的感染复数,细胞存活率明显降低,在90%以下.结论:Ad5/F35对体外培养的人骨髓间充质干细胞的转染效率明显优于Ad5载体.     

不同培养基培养人脐血间充质干细胞的差异

背景：脐血间充质干细胞为干细胞领域的研究热点,但目前传代及扩增此类细胞尚无简单、有效、完美培养方法.目的：采用不同的培养基分离培养融合状态的间充质干细胞,以筛选一种较好的体外培养人脐血间充质干细胞的方法.方法：无菌条件下取正常足月剖宫产新生儿的脐血,随机分为5组：低糖DMEM（Dulbecco改良的Eagle培养基）组、高糖DMEM组、α-DMEM组、低糖DMEM＋干细胞因子组、低糖DMEM＋骨髓间充质干细胞培养上清组.用淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞.将脐血单个核细胞接种于含体积分数为10%胎牛血清的上述培养基中,放置于37℃、体积分数为5%的CO2培养箱内培养,倒置显微镜观察细胞数量和形态的变化并用流式细胞技术分析细胞的表面抗原.结果与结论：①各组间充质干细胞培养48 h后贴壁细胞数和细胞存活率的比较：低糖DMEM＋干细胞因子组、低糖DMEM＋骨髓间充质干细胞培养上清组的贴壁细胞数明显多于低糖DMEM组、高糖DMEM组、α-DMEM组（P〈0.05）,细胞存活率亦明显高于低糖DMEM组、高糖DMEM组、α-DMEM组（P〈0.05）.②各组间充质干细胞在不同培养时间下生长状态的比较：培养第3,6,9,12,15,18,21天低糖 DMEM＋干细胞因子组、低糖 DMEM＋骨髓间充质干细胞培养上清组细胞增殖的速度均快于低糖DMEM组、高糖DMEM组、α-DMEM组（P 〈0.05）.低糖DMEM＋干细胞因子组与低糖DMEM ＋骨髓间充质干细胞培养上清组比较差异无显著性意义.结果可见人脐血间充质干细胞与骨髓间充质干细胞培养上清或干细胞因子共孵育,对脐血间充质干细胞体外分离培养及扩增有支持作用.     

人骨髓和脐带来源间充质干细胞体外支持造血能力的比较研究

本研究分离鉴定人骨髓和脐带来源的间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）,比较两种间充质干细胞体外支持长期造血的能力。用密度梯度离心或酶消化方法分离骨髓和脐带间充质干细胞,通过贴壁培养的方法进一步纯化Msc。检测骨髓和脐带MSC的表型以及成脂、成骨分化潜能。通过LTC—IC（long—term culture—initiating cells）实验,检测骨髓和脐带间充质千细胞体外支持长期造血的能力,并在培养的第3、5、7周分析两种MSC组悬浮细胞的表型。结果表明,骨髓和脐带间充质干细胞体外培养时均呈纺锤形、贴壁生长,2种MSC均表达CD90、CD105、CD73、CD29、CD54、CD166和HLA—ABC,不表达HLA—DR、CD34和CD45。化学染色证实,2种MsC体外能分化为脂肪细胞和成骨细胞。LTC—IC实验第5周脐带间充质干细胞组CFC（colony forming cell）的产率与骨髓间充质干细胞组比较无统计学差异（P〉0．05）;第6、7、9周,脐带MSC组CFC的产率均低于骨髓MSC组（P〈0．05）。第3、5、7周悬浮细胞表型检测结果显示,随着培养时间的延长,2种MSC组CD34和CD117的阳性率均明显下降,而CD33、CD13、CD11b的阳性率逐渐上升。结论：从人骨髓和脐带组织中成功分离并鉴定出间充质干细胞,脐带间充质干细胞能够在体外支持长期造血,但其造血支持能力弱于骨髓间充质干细胞。     

寻找基因转染人脂肪来源的成体干细胞合适载体：脂质体介导质粒pEGFP-N1、重组腺病毒Ad5-EGFP与重组腺相关病毒rAAV-2／1-EGFP

目的:观察脂质体介导质粒pEGFP-N1、重组腺病毒Ad5-EGFP、重组腺相关病毒rAAV-2/1-EGFP基因转染人脂肪来源成体干细胞后增强型绿色荧光蛋白的表达及细胞毒性,探讨适用于脂肪来源的成体干细胞的转基因方法。方法:实验于2006-01/07在国家人类基因组北方中心和北京大学第三医院完成。全髋关节置换术患者的皮下脂肪由北京大学第三医院骨科提供,均征得患者及其家属同意。pEGFP-N1(Clotech公司),Ad5-EGFP,rAAV-2/1-EGFP(本元正阳公司)。②自成人皮下取少量脂肪组织,经机械剪切及Ⅰ型胶原酶消化后获取脂肪来源的成体干细胞,体外培养扩增。③采用脂质体介导质粒pEGFP-N1、重组腺病毒Ad5-EGFP、重组腺相关病毒rAAV-2/1-EGFP3种转染方法,观察增强型绿色荧光蛋白的表达及对细胞毒性的影响。④细胞转染后24h,将5×104细胞悬液接种于24孔板中,每周换液3次,绘制细胞生长曲线。以正常未转染细胞作为正常对照。观察不同转染方法对细胞增殖的影响。结果:①不同转染方法的感染效率比较:pEGFP-N1脂质体转染后细胞毒性较大,且感染效率低,仅为10.5%。重组腺病毒Ad5-EGFP转染率高,当感染复数为5×102时,感染效率达82.5%;当感染复数低于1×103时,对细胞无明显损害。重组腺相关病毒rAAV-2/1-EGFP转染法不能有效感染人脂肪来源的成体干细胞。②不同转染方法对细胞增殖的影响:重组腺病毒Ad5-EGFP转染和重组腺相关病毒AAV-2/1-EGFP转染人脂肪来源的成体干细胞后,对细胞增殖能力无明显影响,基本同正常对照细胞(P>0.05)。而pEGFP-N1脂质体转染后细胞增殖能力较正常对照明显下降,转染后3～10d差异有显著性意义(P<0.05)。结论:重组腺病毒Ad5-EGFP可作为一种高效的脂肪来源成体干细胞的示踪工具,提示5型复制缺陷型腺病毒是其合适的转基因载体。     

碱性成纤维细胞生长因子基因转染大鼠骨髓间充质干细胞后目的基因的表达

目的:观察碱性成纤维细胞生长因子基因转染大鼠骨髓间充质干细胞后bFGF目的基因的表达情况,并进行影响骨髓间充质干细胞的生物学特性分析。方法:实验于2005-03/2006-02在中山大学第二附属医院医学研究中心完成。①选择近交系4周龄雄性SD大鼠10只,贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,构建含bFGF基因的腺病毒表达载体,利用腺病毒介导转染SD大鼠骨髓间充质干细胞。②传2代后,将细胞接种12孔培养板,培养至90%融合时弃上清,调整转染病毒滴度范围为50～400。荧光显微镜下通过观察绿色荧光强度检测转染效果,以流式细胞仪检测细胞转染效率。③传2代后,胰酶消化,置于6孔板内,每孔细胞数量5×105,2d后细胞贴壁生长于盖玻片上,分别转染Ad.bFGF、Ad.GFP,同时设立空白对照。转染病毒滴度选择200。应用免疫组化和Western-Blot法鉴定碱性成纤维细胞生长因子的表达,ELISA法检测培养上清液中碱性成纤维细胞生长因子的浓度。观察转染后骨髓间充质干细胞形态和生长情况的变化。结果:①pcDNA3/bFGF的鉴定结果:成功构建碱性成纤维细胞生长因子腺病毒表达载体。②Ad.GFP转染骨髓间充质干细胞的效率测定:转染48h后,绿色荧光蛋白的表达明显增强。当转染病毒滴度≤200时,腺病毒的转染效率与病毒剂量呈明显的正相关(P<0.05),当>200时转染效率趋于稳定,均在96%以上。③Ad.bFGF转染骨髓间充质干细胞的表达情况:bFGF蛋白表达免疫组化检测可见转染Ad.bFGF骨髓间充质干细胞的胞浆内充满棕褐色颗粒,阳性表达率为86%,而转染Ad.GFP及空白对照的骨髓间充质干细胞均为阴性。Western-Blot示转染Ad.bFGF的细胞裂解产物中碱性成纤维细胞生长因子含量明显高于转染Ad.GFP及空白对照。ELISA检测结果表明转染Ad.bFGF的细胞培养上清液中碱性成纤维细胞生长因子浓度第15天达高峰1467ng/L,此后逐渐下降,但至转染第28天时仍显著高于空白对照(441ng/L,128ng/L,t=4.31,P<0.01)。④转染Ad.bFGF对骨髓间充质干细胞增殖的影响:骨髓间充质干细胞的增殖分化没有明显变化。结论:采用腺病毒介导的基因转染技术可以将碱性成纤维细胞生长因子转染至骨髓间充质干细胞中,并有外源性基因和蛋白的表达。提示骨髓间充质干细胞是碱性成纤维细胞生长因子基因治疗的理想载体。     

人脐带间充质干细胞分离培养及向脂肪与成骨细胞的分化

背景:研究报道显示人脐带间充质干细胞体外分离方法及效率、培养条件各不相同,并且尚未有统一的鉴定标准.因此建立高效、经济的培养体系十分必要.目的:建立从人脐带组织分离培养间充质干细胞的方法,并进行向脂肪细胞和成骨细胞的诱导分化.方法:采用组织块贴壁法和酶消化法分离纯化获得人脐带间充质干细胞,取对数生长期的第3代细胞,分析其细胞形态、增随方式和某些免疫表型,并在体外诱导其向脂肪细胞和成骨细胞分化.结果与结论:采用组织块贴壁法和酶消化法均能成功获得贴壁生长的人脐带间充质干细胞,并在体外扩增培养.流式细胞术分析结果显示,人脐带间充质干细胞强表达CD29,CD44,CD59,CD105,阴性表达CD28,CD31,CD34,CD45,CD40,CD86,HLA-DR.人脐带间充质干细胞在适当的诱导条件下能向脂肪和成骨细胞分化,体外能连续传代40次以上,且形态和表型保持稳定.这证实了人脐带组织存在间充质干细胞,且具有向脂肪和成骨细胞分化的潜能,因此将可能成为细胞治疗和组织工程新的种子细胞.     

骨髓间充质干细胞中大鼠白细胞介素10复制缺陷型重组腺病毒的表达

背景:研究显示,白细胞介素10在脓毒症等炎性疾病发挥了抑制炎症反应、促进疾病转归的重要作用。目的:构建大鼠白细胞介素10重组腺病毒,并以骨髓间充质干细胞为基因载体,观察外源基因在细胞中的表达情况。方法:采用反转录-聚合酶链反应方法从SD大鼠新鲜脾脏组织中提取出的总RNA中克隆大鼠白细胞介素10基因,通过AdEasy系统成功包装、扩增并纯化出含目的基因的重组腺病毒颗粒。取大鼠骨髓细胞,利用密度梯度离心法和贴壁法分离并扩增骨髓间充质干细胞,并使用流式细胞仪进行表型鉴定。以不同感染倍数的Ad.rIL-10/Ad.GFP感染骨髓间充质干细胞,在荧光显微镜下观察感染效率,并用反转录-聚合酶链反应和Weaternblot方法检测目的基因在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达。结果与结论:成功构建了重组腺病毒Ad.rIL-10,计算病毒滴度为6.0×1010pfu/mL。重组腺病毒Ad.rIL-10对骨髓间充质干细胞有较高的转染效率,当感染复数=200时为70%。提示含外源基因大鼠白细胞介素10的骨髓间充质干细胞持续高效地表达目的基因,是基因治疗的良好细胞载体。     

脐带间充质干细胞培养中的染色标记及示踪技术

背景：脐带间充质干细胞的培养是进行脐带间充质干细胞研究时极其重要的部分,细胞培养技术的优化对推动间充质干细胞的临床应用特别是细胞治疗至关重要。同时,脐带间充质干细胞标记及示踪技术是干细胞移植治疗的研究热点之一。目的：对国内外脐带间充质干细胞染色标记技术的研究与进展作一综述。方法：以“干细胞,间充质干细胞,脐带间充质干细胞,细胞培养,染色标记”为中文捡索词,以“Umbilical cord-derived mesenchymalstem cells,Cell culture,Labeling methods”为英文检索词,检索维普和中国知网（CNKI）期刊全文数据库、Medline,highwire和外文生物医学期刊全文数据库（Foreign Journals Integration System）2001年1月至2013年10月有关脐带间充质干细胞的培养及标记染色文献。最终纳入35篇文献进行综述。结果与结论：脐带间充质干细胞尚未得到广泛应用,最关键的原因是脐带间充质干细胞的分离培养及染色技术不是很成熟,这些方面都值得在研究中进一步优化。虽然近几年脐带间充质干细胞标记及示踪技术有了较快的进展,但仍存在许多问题有待进一步解决。     

两性霉素B处理人脐带间充质干细胞的培养与分化

背景：建立和完善避免真菌污染的方法,有效降低采集脐带时分离培养的污染率,以便获得优质高效的脐带间充质干细胞。目的：探讨两性霉素B对脐带间充质干细胞的生长状态及分化潜能的影响。方法：采用胶原酶消化法从正常顺产足月新生儿脐带中分离出间充质干细胞,经两性霉素 B 处理,用MesenPRO RS？培养基进行体外扩增培养。取对数生长期的第3代脐带间充质干细胞,分析其形态、增殖方式和免疫表型,在体外诱导其向成骨和脂肪细胞分化。结果与结论：经两性霉素B处理后,在体外仍能成功分离培养出脐带间充质干细胞。流式细胞术结果显示,人脐带间充质干细胞仍强表达CD44,CD105,CD73,CD90,阴性表达HLA-DR,CD29,CD31,CD34。两性霉素B处理后的人脐带间充质干细胞经体外诱导能向脂肪和成骨细胞分化。     

人脐带源间充质干细胞静脉移植治疗大鼠肝纤维化

背景：近来国内外研究证明,来自其他组织的干细胞能够归巢到肝脏,并可能参与肝组织的再生,这为发展干细胞治疗肝脏疾病提供了新的希望。目的：探究人脐带源间充质干细胞的分离、培养方法,观察脐带间充质干细胞移植对大鼠肝纤维化模型的修复作用,为脐带间充质干细胞的临床应用提供可靠的理论依据。方法：自然贴壁法分离、纯化人脐带间充质干细胞并进行体外培养和扩增,用皮下多点注射CCl4制备肝纤维化大鼠模型。将22只模型大鼠随机分为模型损伤组（n=11）和细胞移植组（n=11）。细胞移植组在模型制备成功后的第1,2,3周经尾静脉给予1＆#215;106脐带间充质干细胞治疗,4周后将大鼠处死,收集各组大鼠血液检测肝功能;摘取肝脏行苏木精-伊红染色,观察病理变化;免疫组化法观察库普弗细胞的数量及分布;免疫组化法观察治疗组脐带间充质干细胞的定位情况。结果与结论：脐带间充质干细胞经尾静脉移植入肝硬化大鼠后,大鼠的肝功能均明显改善,与对照组比较,差异有显著性意义（P＜0.05）;肝组织苏木精-伊红染色提示,肝纤维化程度明显改善;免疫组化法观察库普弗细胞的数量提示,库普弗细胞数量明显减少;免疫组化方法利用抗BrdU抗体在治疗组大鼠肝脏观察到BrdU标记的脐带间充质干细胞。说明脐带间充质干细胞移植可以改善大鼠外周血液的血生化特性和肝的组织学结构。     

ELISA法检测干细胞溶液中残留牛血清白蛋白含量

目的检测胎牛血清白蛋白（Fetalbovineserumalbumin,BsA）在脐带源间充质干细胞溶液的含量以代表异源蛋白在脐带源间充质干细胞溶液中的残留情况的适用性,并通过改进培养条件和增加清洗次数以进一步减少BSA等异源蛋白在脐带源间充质千细胞溶液内的残留。方法运用定量EuSA方法检测了脐带源间充质干细胞溶液中BSA的含量,并探讨改进培养方式与增加清洗次数等方法对干细胞溶液中残留的BSA含量的影响。结果对细胞清洗次数的增加能够有效减少BsA等异源蛋白的残留,并且采用无血清培养基进行干细胞培养是减少BSA等异源蛋白在干细胞溶液内残留量的最有效方法。结论通过检测BSA以代表异源蛋白在脐带源间充质干细胞溶液中残留情况具有适用性;并且增加清洗次数能有效地降低BSA的残留量;采用无血清培养基进行干细胞培养是减少BSA等异源蛋白在干细胞溶液内残留量的最有效方法。     

评价脐带间充质干细胞移植前细胞活性的指标

背景：脐带间充质干细胞已在临床多种疾病中展开研究,作为一种动态的活细胞,移植前的细胞活性将直接影响治疗效果,锥虫蓝染色虽然是目前评价细胞活性的常用指标,但由于其易受主观因素的影响,并不能准确反映细胞功能状态。目的：探寻可准确反映脐带间充质干细胞功能状态的活性指标。方法：体外分离培养人脐带间充质干细胞,生理盐水4℃条件下保存0,2,4,6h,采用多种具有代表性的细胞活性测定方法（锥虫蓝染色法、Annexin V-PI、TUNEL、CCK-8、Live-Dead Assay、贴壁实验）检测保存后细胞存活率,进一步观察它们与反映细胞功能状态指标克隆形成率之间的关联程度。结果与结论：人脐带来源的间充质干细胞体外培养呈梭形贴壁生长,第3代细胞表面标记CD29、CD44与CD105表达呈现阳性,CD34与CD45表达呈现阴性,成脂及成骨诱导均表达阳性。锥虫蓝染色法得到的细胞活力与相应的克隆形成率相关性不大,而其他检测方法较锥虫蓝染色法而言相关性较好,其中以贴壁实验最为明显。证明了贴壁实验是目前反映细胞活性状态相对最为精确的指标。     

人脐带间充质干细胞移植治疗大鼠急性肺损伤

背景：间充质干细胞具有免疫调节特性,脐带间充质干细胞因其特有的优势,将在急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征的临床应用中有着光明的前景。目的：探讨脐带间充质干细胞移植对内毒素性大鼠急性肺损伤模型的保护作用。方法：将48只健康雄性SD大鼠随机均分为正常对照组、急性肺损伤组和脐带间充质干细胞移植组。后两组采用经气管内滴注内毒素建立急性肺损伤模型。成功造模1h后,脐带间充质干细胞移植组,经气管内滴注脐带间充质干细胞混悬液,正常对照组和急性肺损伤组同法予以等量生理盐水。分别在干预后24,72h,观察肺组织病理改变,检测病理组织评分、肺组织干湿质量比、髓过氧化物酶活性及血浆白细胞介素6、白细胞介素10及肿瘤坏死因子α水平。结果与结论：脐带间充质干细胞移植可以减轻内毒素诱导的急性肺损伤模型的损伤程度;脐带间充质干细胞移植组在各时间点与急性肺损伤组比较,病理损伤评分、肺干湿质量比、肺组织髓过氧化物酶活性、血浆白细胞介素6和肿瘤坏死因子α水平均明显降低,血浆白细胞介素10水平明显升高。说明脐带间充质干细胞对内毒素性急性肺损伤模型有保护作用;其保护机制可能为脐带间充质干细胞移植维持肺内炎性递质和抗炎递质平衡。     

体外模拟干细胞微环境培养扩增脐血及脐带基质源性间充质干细胞

背景：建立稳健的扩增体系,在体外扩增时最大限度地获得治疗剂量的干细胞数,同时保存干细胞的特性是临床实验室亟待解决的问题。目的：建立体外模拟干细胞微环境细胞外基质扩增脐血间充质干细胞及脐带间充质干细胞的方法,并与传统的2-D培养体系比较。方法：建立体外模拟干细胞微环境细胞外基质,体外分离脐血间充质干细胞及脐带间充质干细胞后分别接种到细胞外基质及传统的2-D塑料培养体系,分别从细胞计数及细胞表面标志物的变化,评估两种扩增体系对脐血间充质干细胞及脐带间充质干细胞体外扩增的优劣。结果与结论：使用骨髓源性的细胞外基质培养体系单位时间脐血间充质干细胞及脐带间充质干细胞产量是2-D体系的4～6倍,并且流式细胞仪检测显示细胞外基质体系能更好地保持干细胞的表面标记。因此,3-D较2-D培养系更接近生理环境,已建立的骨髓源性细胞外基质培养体系能保持间充质干细胞的特性,为短时间内快速获取更大数目同质、高活性的间充质干细胞提供了可能。     

移植保存液中脐带间充质干细胞活性与氧化应激的影响

背景：目前临床移植常用的保存液可使人脐带来源间充质干细胞活性下降,影响移植效果,但关于其活性下降原因的报道目前还很少。目的：探索氧化应激是否为人脐带来源间充质干细胞临床移植保存过程中活性下降的因素;并在保存液中添加自由基清除剂是否可提高保存效果。方法：室温下用生理盐水保存人脐带来源间充质干细胞,0,2,4,6h后分别检测细胞内活性氧水平、检测丙二醛含量以及抗氧化酶活性以判定保存后细胞内氧化应激水平;保存液中添加自由基清除剂N-乙酰半胱氨酸后检测细胞贴壁率变化。结果与结论：经生理盐水保存后人脐带来源间充质干细胞内活性氧水平升高,细胞裂解液丙二醛含量呈时间依赖性增加,抗氧化酶超氧化物歧化酶、过氧化氢酶以及谷胱甘肽过氧化物酶活性均降低。添加N-乙酰半胱氨酸的移植保存液组比不添加组保存人脐带来源间充质干细胞后细胞活性氧水平降低、贴壁率升高。说明在临床常用移植保存液中人脐带来源间充质干细胞内活性氧升高是其活性下降的一个因素,在保存液中添加自由基清除剂N-乙酰半胱氨酸后能够一定程度的改善保存效果。     

脐带间充质干细胞对裸鼠胸腺发育的作用及机制

背景：自身免疫性疾病的传统治疗方法很难有效解决患者免疫耐受机制缺失的问题。间充质干细胞具有再生修复实质组织器官和免疫调节的生物学特性。目的：探讨人脐带源间充质干细胞对裸鼠胸腺发育的影响及作用机制。方法：采用腹腔注射的方式向Foxn1-/-的BABL/c裸鼠体内注射人脐带源间充质干细胞,2×106/只,分析治疗后裸鼠胸腺残基的组织结构变化、胸腺上皮细胞的分布及成熟度,以及发育后的胸腺成熟淋巴细胞输出功能,并探讨人脐带源间充质干细胞发挥治疗作用的机制。结果与结论：胸腺残基出现了清晰的皮髓质结构,胸腺上皮细胞数量增加并且胸腺输出功能增强,外周血中调节性T细胞增多。其作用机制可能是由于人脐带源间充质干细胞能够定植在胸腺组织内并且表达多种促进胸腺发育的细胞因子,尤其是对胸腺发育非常重要的角质形成细胞生长因子。结果表明人脐带源间充质干细胞能够为裸鼠胸腺的结构发育和功能成熟提供合适的微环境,促进裸鼠胸腺残基的发育和功能成熟,为间充质干细胞治疗免疫性疾病的作用机制提出了新的理论观点。