PCR-RFLP方法检测锰超氧化物歧化酶基因V（16）A多态性的实验条件研究（摘要）

目的为确定PCR-RFLP技术检测锰超氧化物歧化酶基因（MnSOD）V（16）A多态性的最适实验条件,对影响PCR的主要因素进行了研究.结果最适变性温度为95℃;最适退火温度为55℃；最适引物浓度为0．25μmol／L；最适Mg^2＋浓度为1．5mmol／L；最适dNTP浓度为0．20mmol／L；最适反应体系为25μL，以0．6U为最适Taq酶量．酶切体系为15μL体系中加8μL产物用2U的酶消化．为后续研究奠定了实验基础．     

PCR-RFLP方法检测锰超氧化物歧化酶基因V(16)A多态性的实验条件研究

目的：确定PCR-RFLP技术检测锰超氧化物歧化酶基因（MnSOD）V（16）A多态性的最适实验条件．方法：对影响MnSOD基因PCR反应以及用限制性内切酶BsawI切割主要因素进行了系统研究．结果：最适退火温度为55℃；最适引物浓度为0．25μmol／L；最适Mg^2＋浓度为1．5mmol／L；最适dNTP浓度为0．20mmol／L；以0．6U为最适Taq酶量．酶切体系为15止体系中加8pL产物用2U的酶消化，为后续研究奠定了实验基础．     

PCR-RFLP法检测葡萄糖激酶基因启动子-30位点变异的实验条件研究

目的：确定PCR扩增葡萄糖激酶基因启动子区以及用Alw21I内切酶切割-30位点的最佳实验条件。方法：对影响PCR反应以及酶切的实验因素进行系统研究。结果：最佳引物浓度为0．3μmol／L；以1 U酶量效果最满意；最适dNTP浓度为167μ mol／L；最适镁离子浓度为1．5mmol／L。20μL的酶切体系中，最佳酶切产物为5μL，最佳内切酶量为5 U，酶切时间应超过9h。以上参数偏离最适条件将会导致实验失败。     

PCR-RFLP技术检测RANTES基因启动子区-28C/G多态性的实验研究

目的为研究PCR—RFLP技术检测RANTES基因启动子区-28C／G多态性的最适实验条件．方法对主要影响因素设系列浓度梯度进行PCR后观察电泳结果，设置不同的体系对RFLP方法进行了研究．结果最适变性温度为94℃；最适退火温度为60℃；最适引物浓度为0．6μmol／L；最经济有效的酶切体系为12μL体系中加4μL产物用3U的酶消化．结论最佳的实验条件的摸索是进行大批量实验研究的关键．     

PCR-RFLP技术检测SUMO4基因163A/G多态性的实验条件研究

目的确定PCR-RFLP技术检测小泛素样修饰蛋白4（SUMO4）163A/G多态性的最适实验条件.方法对影响SUMO4基因PCR反应的主要因素设定系列浓度梯度分别进行研究.结果最适变性温度为94℃;最适退火温度为55℃;最适引物浓度为0.25μmol/L;最适Mg2＋浓度为1.5mmol/L;最适dNTP浓度为0.25mmol/L;以2.5U为最适Taq酶量;酶切体系为31μL体系中加10μL产物用10U的酶消化.结论最佳实验条件的摸索是进行糖尿病实验研究的关键.     

PCR扩增肺癌组织puma基因第四外显子的实验研究

目的探讨PCR扩增肺癌组织中puma基因第四外显子（GC含量76．44％）的最适实验条件．方法通过改变PCR反应体系各组分的浓度和反应条件,探讨PCR反应体系最适浓度和反应条件．结果PCR反应体系为dNTP200μmol／L,普通MgCl2 1．0mmol／L,引物500nmol／L,TaqDNA聚合酶0．1U／μL,模板量不低于4000ng,普通10×扩增体系缓冲液5μL,总体积50μL.反应条件为94℃预变性5min,94℃ 45s、61℃ 45s、72℃ 45s循环33次,最后72℃延伸5min．结论确立了puma基因第四外显子的PCR扩增条件,为后续的突变研究奠定了基础．     

香加皮ISSR—PCR条件体系的优化

采用正交设计法、均匀设计法,对影响香加皮IssR—PCR43体系的引物、Mg2＋、dNTP、TaqDNA聚合酶浓度进行优化,通过两种方法的比较建立了适合香加皮ISSR-PCR的反应体系：在20μL反应体系中,含Mg2＋1mmol／L、dNTP0．15mmol／L、引物1．0μmol／L、TaqDNA聚合酶1U、buffer2．5μL和模板DNA约50ng。在此基础上对扩增程序中的退火温度进行筛选,通过比较将退火温度定为50℃,最终扩增程序定为：94℃预变性4min接着进行40个循环：94℃变性30S,50~C退火1min,72℃2延伸90s;循环结束后72℃延伸10min。     

PCR-RLFP方法检测IL-6基因启动子区-634C/G多态性的实验条件研究

目的探讨PCR-RFLP技术判断IL-6基因启动子区-634C/G多态性的最适实验条件.方法对影响PCR的部分因素和影响RFLP方法的一些因素进行研究.结果PCR扩增IL-6基因启动子区的最适条件为:引物浓度为0.2μmol/L;Taq酶量为1.5 U;dNTP浓度为120μmol/L;Mg2 浓度为2.0 mmol/L.最经济有效的酶切体系为20μL体系中加4μL产物用2.5 U的酶消化9 h以上.结论最佳实验条件的探索是进行大批量实验研究的关键.     

溶菌酶降解壳聚糖条件的研究

研究了溶茵酶对壳聚糖的降解条件，结果表明：脱乙酰度约70％的壳聚糖较易被溶菌酶水解；水解反应的最适温度为55℃、pH值为4．0，低速摇床振荡对水解有利；在壳聚糖水解初期，溶液中还原糖浓度迅速增加，0．5h后水解速率逐渐减慢，至8h后还原糖浓度的增加已很缓慢；酶解液中还原糖的生成量瞳壳聚糖及溶茵酶浓度的增加而增大，当壳聚糖溶液浓度为20mg／mL、溶茵酶浓度为2．48mg／mL时，水解6h后，还原糖的含量可达6．758mmol／L。水解6h后酶解液中还原糖浓度与壳聚糖的浓度呈线性关系。     

人纤溶酶原K5突变体在大肠杆菌中的优化表达

【目的】提高K5突变体（mK5）在原核系统的单位表达量。【方法】调整可能影响表达的参数：抗生素浓度、pn、A600值、IPTG终浓度、诱导时间、诱导温度，同时固定其它参数。通过电泳分析，获得mK5在原核系统pET22b-BL21的最优表达条件；组氨酸结合柱亲和层析、纯化获得mK5蛋白，SDS-PAGE和Western-blot方法鉴定mK5蛋白；MTT法分析mK5对人视网膜毛细血管内皮细胞（HRCEC）增殖的影响。【结果】优化后的表达条件为：最适细菌培养温度为37℃．最佳抗生素浓度为50μg／mL羧苄青霉素．最适pH值为7．0,在A600为0．9～1．0时加入终浓度为1．0mmol／L的IPTG为最佳诱导条件，37℃诱导10h为最佳诱导时间；优化条件后mK5纯化蛋白得率为21mg／L．产量较优化前（15mg／L）提高近30％：mK5特异性地抑制HRCEC的增殖．IC50=40nmol／L。【结论】本研究确定了mK5蛋白诱导表达的最适参数．并获得具有生物活性的高纯度、高表达量的重组蛋白，为工业化大规模发酵生产提供了基本参数。     

长寿机制探讨——线粒体基因多态性

近年来,随着人类对与衰老相关疾病的重视,人类平均寿命延长和人口老龄化,与衰老相关的研究有了很大的进展。利用分子生物学手段筛选与长寿有关的易感基因,是探讨长寿机制的有效研究方法,也是近年来长寿遗传机制研究的热点。线粒体是细胞内能量产生的主要场所,因此,线粒体异常将会影响大脑和心脏等持续高度度耗能脏器的功能。本文就线粒体基因多态性的研究进展进行简要综述。     

2型糖尿病肾病付氧酶的基因多态性

目的：探讨付氧酶（PON）基因多态性与单纯2型糖尿病及2型糖尿病肾病（DN）的关系。 方法：应用PCR-RELP法检测97名正常人（对照组）、154例单纯2型糖尿病、145例2型DN患者PON1、PON2、PON3多态性。 结果：PON2（G148A）各基因型频率3组间比较差异有显著性(P<0.001),PON2（C311S）各基因型频率3组间比较差异有显著性(P<0.001)。PON1（Q192R）、PON1（L55M）、PON3（A99A）各基因型频率3组间比较差异无显著性（P>0.05）。 结论：PON2（G148A）和PON2(C311S)基因多态性都可能作为DN的预测指标,PON1（Q192R）、PON1（L55M）、PON3（A99A）可能与DN发生无相关性。     

Y-STR多态性与人类学

人类Y染色体短串联重复序列(Y-STR)具有父系遗传、缺乏重组、分型简单、信息量大、多态性高等特点,是研究人类的起源进化、民族差异、种族差异、群体及地区分布等的有力工具。本文就Y-STR多态性与其在人类学方面的应用作一综述。     

头孢呋新酯的多晶型研究

用不同有机溶剂重结晶制备了头孢呋新酯的多晶型,通过差热分析、红外光谱、Ｘ－射线粉末衍射法等进行鉴别,确定头孢呋新酯的晶体存在两种晶型,即低熔点晶型α和高熔点晶型β。测定了不同温度下,两晶型在０．０７ｍｏｌ／Ｌ盐酸溶液中的平衡溶解度,并计算其溶解热。     

基因多态性与儿童白血病预后

细胞遗传学和分子生物学的快速发展为儿童白血病亚型分类、预后判断和最佳治疗方案的制订提供了有力手段,近年来,儿童白血病预后的分子因素的研究有大量文献报道。现仅对基因多态性对儿童白血病预后意义的研究文献进行综述分析,试图为相关研究提供线索。     

原发性高血压基因多态性的相关研究进展

原发性高血压是由遗传因素和环境因素共同影响所致的复杂的多基因遗传病。至今对其发病机制仍不完全清楚,但遗传背景是其发病的重要原因,在其发病中所起的作用占30%～50%。随着人类基因组计划的顺利完成,人们从基因遗传学方面进行了深入研究,并发现了多个原发性高血压候选基因。现对近几年原发性高血压相关的热点基因多态性研究成果予以综述。     

PCR-RFLP方法检测PARL基因Leu262Val多态性的实验研究

目的探讨聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法（PCR-RFLP）检测PARL基因Leu262Val多态性的最适实验条件.方法在PCR实验中,运用降落PCR（touchdown PCR,TD-PCR）方法优化PCR条件;对引物终浓度设定0.8μmol/L、0.6μmol/L、0.4μmol/L和0.32μmol/L四个浓度梯度进行扩增;通过2%琼脂糖凝胶电泳观察结果.在RFLP实验中,在内切酶量10 U不变的情况下,PCR产物量分别设定为5μL、10μL、15μL;酶切时间分别设定为12 h、8 h、4 h、2 h、1 h酶切,反应完毕后通过2%琼脂糖凝胶电泳观察结果.结果 （1）降落PCR方法能有效降低或避免非特异性扩增;（2）引物浓度为0.4μmol/L时,PCR产物量高且引物二聚体较少;（3）10μL的PCR产物进行酶切,电泳结果清晰;（4）在37℃条件下酶切4 h能完全消化一个酶切体系中的PCR产物.结论 PCR实验中,TD-PCR优化了PCR条件,为扩增目的条带提供了快速、特异、可靠的方法,最适引物浓度为0.4μm/L;RFLP实验中,最有效酶切方案为20μL的体系中加10μL产物和10 U内切酶,37℃消化4 h.     

基因芯片检测慢性乙肝患者HBV-DNA变异的临床研究

目的应用新型基因芯片研究乙肝病毒多点基因变异在慢性乙肝患者中的意义，为临床诊断和治疗提供依据。方法对132例慢性乙肝患者采用DNA芯片技术，检测HBV—DNA基因6个位点的变异。结果132例慢性乙型肝炎患者均存在HBV—DNA位点的变异，其中前C区1896G—A变异率为23．5％。e抗原阳性者占4．O％（4／74）。e抗体阳性者占48．3％（28／58），后者变异株显著高于前者，此突变有助于HBV逃避免疫攻击而形成慢性感染状态；前C区1814变异率为3．8％；C区启动子1762变异率为56．1％，1764变异率为53．8％，且两种变异常同时出现，与重型肝炎、肝硬化和肝癌的发生相关；P区528变异率为9．8％，552M—I变异率38．6％，552M—V变异率为10．6％，552变异与核苷类似物耐药相关。结论HBV—DNA位点变异对于判定疾病的稳定与进展有重要作用。     

不同人群细胞因子基因多态性分布的比较

目的研究上海地区部分汉族健康人群的细胞因子基因调节区或启动子区的多态性分布情况。方法随机选取上海地区60名汉族健康成人为研究对象,分别取外周静脉血2 mL,加入400μL 5?TA抗凝,抽提DNA;采用序列特异性引物聚合酶链反应(PCR-SSP)法,对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、白细胞介素(IL)、干扰素-γ(IFN-γ)等细胞因子进行基因调节区或启动子区多态性分析。本组检测结果与采用同种方法测定的两组人群数据(文献报道)进行比较。结果三组人群IL-10的基因多态性分布差异不显著;TNF-α、TGF-β1、IL-6和IFN-γ的基因多态性分布,三组之间差异非常明显。结论不同人群的细胞因子基因多态性分布存在差异。     

不同人群细胞因子基因多态性分布的比较

目的研究上海地区部分汉族健康人群的细胞因子基因调节区或启动子区的多态性分布情况.方法随机选取上海地区60名汉族健康成人为研究对象,分别取外周静脉血2 mL,加入400 μL 5%EDTA抗凝,抽提DNA;采用序列特异性引物聚合酶链反应(PCR-SSP)法,对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、转化生长因子-β 1(TGF-β 1)、白细胞介素(IL)、干扰素-γ(IFN-γ)等细胞因子进行基因调节区或启动子区多态性分析.本组检测结果与采用同种方法测定的两组人群数据(文献报道)进行比较.结果三组人群IL-10的基因多态性分布差异不显著;TNF-α、TGF-β 1、IL-6和IFN-γ的基因多态性分布,三组之间差异非常明显.结论不同人群的细胞因子基因多态性分布存在差异.