RNA干扰沉默促肝细胞再生磷酸酶-3基因对结直肠癌细胞基质金属蛋白酶2和9表达的影响

目的 探讨促肝细胞再生磷酸酶-3(PRL-3)基因对结直肠癌细胞侵袭的影响和可能机制.方法 应用PRL-3基凶小干扰RNA(siRNA)转染处理结直肠癌细胞系HCT116后,分别采用实时定量PCR和Western印迹检测PRL-3基因和基质金属蛋白酶家族(MMP)-2、MMP-9的mRNA和蛋白水平;分别采用软琼脂集落培养试验和Boyden小室模型试验检测癌细胞的锚着不依赖性增殖和侵袭能力;其次,将转染48 h的细胞接种裸鼠,观察其在体内生长情况.结果 体外实验结果显示,PRL-3 siRNA可有效抑制结直肠癌细胞集落生长和侵袭能力,且与浓度相关(P＜0.05,P＜0.01));转染组细胞MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白水平明显下调(P＜0.05).体内实验结果显示,对照组裸鼠组织癌细胞侵袭横纹肌和血管,而转染组未见这些现象.结论 采用PRL-3siRNA转染可抑制结直肠癌细胞侵袭,其机制可能与下调MMP表达有关.     

特异性siRNA下调Cr-1基因表达对人结直肠癌细胞侵袭的影响

目的探讨RNA干扰(RNA interference,RNAi)沉默Cr-1(Cr-1)基因对人结直肠癌细胞侵袭的影响。方法应用Cr-1基因小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)转染处理结直肠癌SW480细胞后,分别采用荧光实时定量RT-PCR和蛋白质印迹检测Cr-1基因mRNA和蛋白水平,分别采用软琼脂集落培养试验和Boyden小室模型试验检测癌细胞的锚着不依赖性增殖和侵袭能力。结果 siRNA转染组Cr-1mRNA和蛋白水平明显下调,且呈浓度和时间依赖性(P<0.05)。体外试验发现,Cr-1siRNA可有效抑制结直肠癌细胞集落生长和侵袭能力,且与浓度相关(P<0.05)。结论 Cr-1在结直肠癌细胞侵袭中起着重要的作用,采用Cr-1siRNA转染可抑制结直肠癌细胞侵袭。     

特异性siRNA沉默TDGF-1基因表达对乳腺癌细胞迁移侵袭的影响

目的 探讨RNA干扰(RNA interference,RNAi)沉默TDGF-1基因表达对乳腺癌细胞侵袭的影响.方法 根据TDGF-1基因序列特点设计3个小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)后,转染人乳腺癌MDA-MB-468细胞,用荧光实时定量RT-PCR筛选出效果最好的siRNA.以该siRNA转染处理乳腺癌MDA-MB-468细胞后,分别采用实时定量RT-PCR和western blot检测TDGF-1基因mRNA和蛋白水平,以划痕试验方法评测癌细胞迁移能力;用Boyden模型观察癌细胞侵袭能力.结果 根据TDGF-1基因序列特点设计的3个siRNA均能抑制TDGF-1基因mRNA水平,以S1效果最好.S1 siRNA转染组TDGF-1 mRNA和蛋白水平明显下调,且呈浓度和时间依赖性(P＜0.001,P＜0.001).体外试验发现,TDGF-1 siRNA转染可有效抑制乳腺癌细胞集落生长、侵袭和迁移能力,且与浓度相关(P＜0.005,P＜0.005,P＜0.005).结论 TDGF-1在乳腺癌细胞迁移、侵袭中起着重要的作用;采用TDGF-1 siRNA转染可抑制乳腺癌细胞侵袭.     

特异性小干扰RNA下调中期因子基因表达对膀胱癌细胞化疗敏感性的影响

目的 观察中期因子(MK)基因小干扰RNA(siRNA)对膀胱癌细胞化疗药物敏感性的影响.方法 设计合成3个MK siRNA,转染人膀胱癌RT4细胞株,定量RT-PCR方法筛选下调MK mRNA效果最好的siRNA;以该siRNA转染RT4细胞后分组:空白对照组(Con-A)、空载对照组(Con-B)、错配对照组及MK siRNA 3.125、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00、200.00 nmol/L组,实时定量RT-PCR和蛋白质印迹方法检测各组细胞MK表达情况;噻唑盐法检测紫杉醇(PTX)对各组细胞生长的影响;通过检测caspase-3活性和TUNEL方法观察癌细胞凋亡情况.结果 3个siRNA均明显下调MK mRNA水平,以S3效果最好.PTX组、Con-A十PTX组、Con-B+PTX组、siRNA 12.50 nmol/L组、3.125 nmol/L+PTX组、siRNA 6.25 nmol/L+PTX组、siRNA 12.50nmol/L+PTX组肿瘤细胞抑制率分别为(18.21±0.36)%、(18.19±0.29)%、(17.89±0.33)%、(1.86±0.52)%、(32.56±0.53)%、(53.83±0.38)%、(78.95±0.55)%.TUNEL结果显示,ConA、Con-B、siRNA 3.125、6.25、12.50 nmol/L组凋亡指数分别为(1.81±0.36)%、(1.89±0.38)%、(5.56±0.58)%、(9.68±0.55)%和(15.25±0.56)%.结果 MK基因siRNA可增强膀胱癌细胞化疗敏感性,诱导凋亡是其重要机制之一.     

RNA干扰REG1A基因抑制人膀胱癌EJ细胞增殖并降低其侵袭

目的 观察小干扰RNA(siRNA)抑制REG1A(REG1A)基因的表达对人膀胱癌EJ细胞增殖及侵袭的影响.方法 化学合成针对REG1A基因的3对siRNA,使用脂质体转染EJ细胞.实时定量聚合酶链反应( Real-time PCR)和免疫印迹(Western blot)法分别检测转染细胞REG1A的mRNA及蛋白表达,细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测转染细胞的增殖,流式细胞术检测转染细胞的周期,Transwell侵袭小室检测转染细胞的侵袭能力.结果 REG1A siRNA转染组EJ细胞与空白对照Mock组比较,REG1A的mRNA及蛋白表达明显下调,分别下调了(75.58±1.17)％及(51.22±6.63)％ (P ＜0.01);REG1A siRNA转染组EJ细胞增殖速度较空白对照Mock组及阴性对照NC组明显减慢(P＜0.05),且G0/G1期细胞百分比明显增多,为(43.37±2.15)％(P＜0.01);REG1AsiRNA转染组EJ细胞穿过Transwell小室的数目为(95.84±6.49)个,明显少于空白对照Mock组的(179.93 ±8.38)个和阴性对照NC组的(186.96±6.28)个(P＜0.01).结论 REG1A siRNA能抑制体外培养的膀胱癌EJ细胞增殖并降低其侵袭能力.     

吴茱萸碱对大肠癌细胞侵袭和中期因子基因表达的影响

目的 观察吴茱萸碱对大肠癌细胞侵袭的影响和可能机理.方法 采用不同浓度的吴茱萸碱处理人大肠癌SW620细胞后,以软琼脂集落培养试验检测癌细胞锚着不依赖性增生,以Boyden小室模型方法检测癌细胞侵袭能力;分别以荧光实时定量RT-PCR和Western blot方法检测癌细胞中期因子(midkine,MK)基因mRNA和蛋白水平.结果 大肠癌Sw620细胞经吴茱萸碱处理后,恶性增生和穿膜细胞数均明显下降,且呈剂量依赖性(P<0.05,P<0.05).吴茱萸碱处理组MK基因mRNA和蛋白水平均明显下调,且呈时间和浓度依赖性(P<0.05,P<0.05). 结论 吴茱萸碱可明显抑制大肠癌细胞侵袭,其机制可能与下调MK基因表达有关.     

肿瘤相关钙信号传导蛋白-2基因对人乳腺癌细胞黏附和侵袭力的影响

目的 观察肿瘤相关钙信号传导蛋白-2(TROP-2)基因小干扰RNA (siRNA)对乳腺癌细胞黏附和侵袭力的影响.方法 培养人乳腺癌Bcap-37、LCC1、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435、MDA-MB-468及ZR75-1细胞株,以荧光实时定量聚合酶链反应(PCR)方法检测TROP-2基因mRNA表达;筛选出TROP-2表达最高者.采用TROP4基因siRNA转染乳腺癌细胞,分别以荧光实时定量RT-PCR和免疫荧光方法观察TROP-2基因mRNA和蛋白水平,然后以噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞黏附性,以Transwell方法检测癌细胞侵袭能力.结果 人乳腺癌Bcap-37、LCC1、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-35、MDA-MB-468及ZR75-1细胞株TROP-2 mRNA分别是1.362±0.057、2.207±0.056、2.997±0.052、0.136±0.045、0.122±0.025、0.194±0.028和2.706±0.039,以MCF-7细胞最高;以TROP-2 siRNA转染乳腺癌MCF-7细胞后,癌细胞TROP-2基因mRNA和蛋白水平明显下降,且呈浓度依赖性;黏附实验结果显示,5、10、20 nmol/L siRNA组黏附率分别为(52.9±2.5)％、(25.6±2.3)％、(12.8±2.2)％(P＜0.01);Transwell实验结果显示,5、10和20 mol/L siRNA组穿过滤膜的细胞分别为78±17、39±15、19±16,而对照组分别为136±25、139±21(P＜0.01).结论 TROP-2基因在乳腺癌细胞黏附和侵袭中发挥着重要作用;以siRNA转染乳腺癌细胞,可抑制乳腺癌细胞黏附和侵袭能力.     

HER-2/neu siRNA对人胶质瘤细胞株T98G侵袭性的抑制作用

目的 探讨人表皮生长因子受体-2(HER-2/neu)特异性siRNA对高表达HER-2/neu的人胶质瘤细胞株T98G侵袭性的影响及其机制.方法 用脂质体介导终质量浓度50 nmol/LHER-2/neu siRNA转染人胶质瘤细胞株T98G,实时定量聚合酶链反应(real-time PCR)和免疫印迹法检测转染后HER-2/neu mRNA和蛋白表达变化.Transwell体外侵袭实验检测终质量浓度25、50、100 nmol/L HER-2/neu siRNA转染T98G后细胞侵袭能力的变化.免疫印迹法检测转染后细胞基质金属蛋白酶-9(MMP-9)蛋白表达变化.明胶酶谱法检测转染后MMP-9活性变化.结果 终质量浓度50 nmol/L HER-2/neu siRNA转染T98G细胞后HER-2/neu mRNA和蛋白表达为对照组的(29.3±6.2)%和(13.1±8.9)%(P＜0.01).终质量浓度25、50、100 nmol/L HER-2/neu siRNA转染后细胞侵袭抑制率分别为(37.7 ±7.2)%、(65.0±10.1)%和(69.7±9.3)%,三者与对照组的差异均有统计学意义(P＜0.01).与对照组比较,转染组细胞MMP-9蛋白表达减少(49.9±10.7)%,酶活性下降(55.6±12.7)%(P＜0.01).结论 HER-2/neu siRNA转染人胶质瘤细胞株T98G后明显抑制细胞的侵袭能力,其机制与MMP-9蛋白表达和活性显著受到抑制有关.     

RNA干扰畸胎瘤源性生长因子基因对食管鳞癌细胞生物学行为的影响

目的 探讨RNA干扰畸胎瘤源性生长因子（PCDGF）基因对食管鳞癌细胞Eca-109的影响.方法 脂质体介导PCDGF-shRNA的表达载体转染Eca-109细胞,应用RT-PCR、Westernblot检测转染后细胞PCDGF mRNA及蛋白的表达情况,分别采用Counting Kit-8（CCK-8）试剂盒和Boyden小室法检测转染后Eca-109细胞的增殖能力和侵袭能力.结果 转染组PCDGF mRNA和蛋白表达水平均较其他组下调.转染24、48和72 h转染组细胞增殖均受到抑制,抑制率分别为20.4％、21.1％和20.9％,其细胞增殖活性较未转染组、阴性质粒组和脂质体组均明显降低（均 P＜0.05）.未转染组、阴性质粒组、脂质体组和转染组的细胞迁移数分别为118.8±12.0、100.8±9.0、114.3±4.7和 53.5±16.3,转染组与其余3组比较,差异均有统计学意义（P=0.001,P=0.002,P=0.002）.结论 RNA干扰PCDGF基因可抑制食管鳞癌细胞的体外增殖及侵袭能力,PCDGF基因可能成为基因治疗的新靶点.     

小干扰RNA沉默血管内皮生长因子对ACHN肾癌细胞黏附、侵袭及迁移的影响

目的 观察小干扰RNA (siRNA)沉默血管内皮生长因子(VEGF)对ACHN肾细胞癌细胞生物学行为的影响.方法 化学合成针对VEGF的小干扰RNA,实验分4组,转染后收集细胞,通过蛋白印迹方法检测VEGF的表达,噻唑蓝(MTT)比色法、细胞黏附实验、划痕实验及Transwell法测定细胞的增殖、黏附、迁移及侵袭能力.结果 siRNA 1～2组VEGF表达水平明显低于空白对照组及阴性对照组;在24、48、72 h,siRNA 1～2的增殖抑制率均高于空白对照组及阴性对照组(P＜0.05),其中以siRNA2组最为显著;与空白对照组比较,siRNA 1～2组的细胞黏附数量明显下降[(81.5±3.1)％比(40.5±2.6)％、P＜0.05,(81.5±3.1)％比(22.5±2.4)％、P＜0.05],其中以siRNA2组最为明显;siRNA1～2组的细胞迁移数量明显下降(162±9比81±5,P＜0.05;162±9比38±4,P＜0.05);siRNA1～2组细胞侵袭能力明显下降(P＜0.05),且siRNA 2组的细胞侵袭能力明显低于siRNA 1组(P＜0.05).结论 VEGF基因在肾细胞癌细胞黏附、迁移和侵袭中发挥着重要作用;以靶向VEGF的siRNA转染肾细胞癌细胞,可抑制肾细胞癌细胞黏附、迁移和侵袭能力.     

血管内皮生长因子-C和人表皮因子受体2共沉默对人肺腺癌细胞生物学行为的影响

目的 观察靶向血管内皮生长因子-C(VEGF-C)、人表皮因子受体2(HER2/neu)基因的小干扰RNA(siRNA)转染对肺腺癌细胞株A549生物学行为的影响.方法 构建靶向VEGF-C、HER2/neu的siRNA表达质粒,转染A549细胞,Transwell小室检测细胞体外侵袭能力,噻唑蓝(MTY)比色法检测细胞增殖活性,流式细胞术测定凋亡率.结果 siVEGF-C组、siHER2/neu组、共转染组的细胞侵袭数分别为(42.76±2.87)、(47.10±3.63)、(40.50±3.21),显著低于阴性对照组(61.00±2.48,P＜0.01);转染48 h生长抑制率分别为(19.77±1.15)%、(22.98±2.13)%、(41.27±0.51)%,显著高于阴性对照组(4.99±0.14)%(P＜0.01);转染48 h肿瘤细胞凋亡率分别为(10.8±1.8)%、(11.7±1.5)%、(20.2±3.4)%,显著高于阴性对照组(2.6±0.7)%(P＜0.01).与单独一种siRNA转染比较,联合转染肿瘤细胞生长抑制率增加(P＜0.01),凋亡率增加(P＜0.01).结论 靶向VEGF-C、HER2/neu的siRNA转染后可以显著降低A549细胞侵袭能力,抑制增殖,诱导细胞凋亡,共转染后对增殖和凋亡影响更显著.     

siRNA沉默survivin基因对肺癌细胞凋亡的影响

目的观察siRNA（Small interference RNA,siRNA）介导survivin基因对肺癌细胞凋亡作用。方法设计、合成针对survivin的siRNA并构建相应载体,转染对数生长期肺癌细胞A549,对比阴性对照组和空白对照组;半定量RT-PCR检测survivin mRNA的表达,MTT法检测细胞生长,流式细胞仪检测肺癌细胞的凋亡。结果转染siRNA组survivin mRNA表达明显低于阴性对照组和空白对照组（P〈0.05）。MTT法检测各组细胞生长曲线阴性对照组与空白对照组相比,转染后24,48,96小时及1周时细胞生长未受影响,siRNA组在转染后24,48小时细胞生长未受明显影响,而96小时及一周时明显抑制。转染siRNA组的细胞的凋亡率与阴性对照组与空白对照组相比显著增加（14.94%±1.60%vs 3.23%±0.46%,4.22%±0.34%,P〈0.05）。结论本实验提示siRNA沉默survivin基因能促进肺癌细胞的凋亡,survivin siRNA基因治疗有可能成为肺癌治疗的新靶点。     

RNA干扰下调肿瘤相关钙信号传导蛋白-2基因表达对胃癌细胞黏附、迁移和侵袭的影响

目的 观察肿瘤相关钙信号传导蛋白-2(TROP-2)基因小干扰RNA(siRNA)对胃癌细胞生物学行为的影响.方法 培养人胃癌MGC-803、HGC-27及BGC-823细胞株,以荧光实时定量聚合酶链反应(PCR)检测TROP-2基因mRNA表达;筛选出TROP-2表达最高者.采用TROP-2基因小干扰RNA转染胃癌细胞株,分别以荧光实时定量PCR和免疫荧光方法观察TROP-2基因mRNA和蛋白水平,然后以计数法检测细胞黏附,以划痕法观察癌细胞迁移、以Boyden方法检测癌细胞侵袭力.结果 荧光实时定量PCR方法显示,3株胃癌细胞中,TROP-2均有不同程度的表达,以胃癌BGC-823细胞最高;以TROP-2 siRNA转染胃癌BGC-823细胞后,癌细胞TROP-2基因mRNA和蛋白明显下降,且呈浓度依赖性;细胞黏附结果显示,转染组细胞黏附数量明显下降;划痕试验和Boyden试验结果显示,细胞迁移和侵袭力明显下降.结论 TROP-2基囚在胃癌细胞黏附、迁移和侵袭中发挥着重要作用;以siRNA转染胃癌细胞,可抑制胃癌细胞黏附、迁移和侵袭能力.     

MTA1基因调控人前列腺癌PC-3细胞失巢凋亡的研究

目的:探讨MTA1基因小干扰RNA(siRNA)对前列腺癌细胞PC-3增殖和失巢凋亡的影响。方法:应用MTA1 siRNA转染处理人前列腺癌细胞系PC-3后,采用实时定量PCR和W estern印迹检测MTA1基因mRNA和蛋白水平,采用软琼脂集落培养试验检测锚着不依赖性增殖,采用琼脂糖凝胶电泳和流式细胞术检测癌细胞失巢凋亡。结果:与对照组比较,MTA1基因siRNA转染组MTA1 mRNA和蛋白水平明显下降,且呈浓度依赖性(r=0.935,P=0.0001)。MTA1 siRNA转染组软琼脂集落形成数明显减少,且与浓度相关(r=0.901,P=0.0005)。琼脂糖凝胶电泳和流式细胞术结果显示,MTA1 siRNA转染可诱导前列腺癌细胞失巢凋亡,且与浓度相关(r=0.916,P=0.0003)。结论:MTA1 siRNA可抑制人前列腺癌细胞增殖,诱导失巢凋亡是其机制之一。     

RNA干扰沉默JMJD2A基因表达对人乳腺癌细胞MCF-7的影响

目的 观察特异性小干扰RNA(siRNA)技术沉默JMJD2A基因表达对人乳腺癌细胞MCF-7生物学特性的影响.方法 体外化学合成JMJD2A序列特异性双链siRNA,经HiPerFect Transfection Reagent转染人乳腺癌细胞株MCF-7.收集siRNA干扰的细胞,Real time逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白印迹分别检测JMJD2A mRNA和蛋白的抑制水平,并采用WST-8法、流式细胞仪测定细胞增殖能力和细胞周期的变化,Transwell小室测定细胞侵袭、迁移能力的变化.结果 JMJD2A siRNA能有效抑制JMJD2A mRNA和蛋白的表达(P<0.05);经siRNA干扰后的细胞,细胞增殖能力显著减低[1.45±0.05比1.73±0.02(48 h A值),P<0.05];Go/G1期细胞百分比明显增加(53.80±1.80比44.84±1.86,P<0.05).S期细胞百分比明显减少(36.55±1.52比47.06±1.26,P<0.05);细胞侵袭、迁移能力明显降低(P<0.05).结论 采用siRNA干扰JMJD2A mRNA和蛋白表达后,能有效逆转乳腺癌细胞的某些恶性生物学特点,表明JMJD2A与乳腺癌的发生、发展及转移有一定关系.