pEGFP-HPV16E6/E7表达载体的构建及转染角朊细胞的瞬时表达

目的：构建ｐＥＧＦＰ－ＨＰＶ１６Ｅ６／Ｅ７表达载体,观察其在角朊细胞中的瞬时。方法：基因重组技术,基因转染技术。结论 ｐＥＧＦＰ－ＨＰＶ１６Ｅ６／Ｅ７表达载体便于观察,转染细胞中ＨＰＶ１６Ｅ６／Ｅ７－ＧＦＰ融合蛋白的表达民政部及蛋白定位,适用于对ＨＰＶ１６Ｅ６／Ｅ７分子生物学特性及致瘤机理的研究。     

ZBTB5基因真核表达质粒的构建及其在HEK 293T细胞中的表达

目的构建ZBTB5基因的真核表达质粒,并检测其在细胞内的表达。方法以pET-28a(+)-ZBTB5质粒为模板,以ZBTB5全长编码基因特异性引物进行PCR扩增,将ZBTB5全长基因插入至pcDNA3.1-GFP真核表达载体构建重组pcDNA3.1-ZBTB5-GFP质粒。将该重组质粒双酶切及测序鉴定后,转染至HEK 293T中,荧光显微镜下及Western blot分别检测GFP和ZBTB5在细胞中的表达。同时设置pcDNA3.1和pcDNA3.1-GFP载体为对照。结果酶切及测序证实成功构建了真核表达重组载体pcDNA3.1-ZBTB5-GFP。荧光显微镜下可见GFP的表达,Western blot检测到融合蛋白ZBTB5-GFP的表达。结论成功构建真核表达质粒pcDNA3.1-ZBTB5-GFP,为探讨其进一步的功能奠定基础。     

高危型HPV-16E6在小鼠骨髓源性树突细胞的表达

目的探讨高危型HPV-16E6在树突细胞中的定位。方法构建真核表达载体pGFP-16E6,转染小鼠骨髓源性的树突细胞,在荧光显微镜下动态观察高危型HPV-16E6蛋白在树突细胞内的定位和表达水平。结果树突细胞在分别转染pGFP-16E6和pEGFP-C1质粒后,GFP-16E6主要定位于细胞核内,而对照组的只表达GFP的蛋白则均匀分布于树突细胞。蛋白表达水平的检测表明,在转染树突细胞后的12h,GFP-16E6和GFP蛋白开始表达（荧光强度分别为31.29,39.52）,转染后至24h,蛋白表达均到达高峰（荧光强度分别为119.37,134.23）,24h后,蛋白表达逐渐降低。结论 HPV-16E6主要定位于树突细胞核内,随时间其蛋白表达水平不同,这为HPV E6的树突细胞疫苗发挥有效的抗癌作用提供理论依据。     

ephrinB2真核表达载体的构建及其在Hela细胞的表达

目的构建ephrinB2重组真核表达载体,研究该质粒在细胞中的表达,为研究ephrinB2对肿瘤生长及血管生成的影响奠定基础。方法逆转录获得人ephrinB2全长cDNA序列,连接到pEGFPN1上,转化大肠杆菌,脂质体转染Hela细胞。RT-PCR检测转录情况,WB鉴定目的蛋白表达。结果酶切和测序证实正确构建重组质粒,并在Hela细胞中表达。结论成功构建了pEGFPN1-ephrinB2真核表达载体,并在Hela细胞中有效表达,为进一步研究ephrinB2的功能奠定基础。     

pBV-BPI600重组表达载体的构建及其在E.coli中的表达

①采用RT PCR技术 ,以HL 60细胞mRNA为模板扩增获得编码BPI氨基端 1 93个氨基酸 (rBPI2 1)的基因片段 (BPI60 0 ) ;EcoRI/BamHI酶切扩增产物获得BPI 2 0 0bp和BPI 4 0 0bp 2个基因片段。②成功构建PUC1 8 BPI2 0 0和PUC1 8 BPI4 0 0重组克隆载体 ,DNA测序分析结果与文献报道一致。③成功构建pBV2 2 0 BPI60 0重组表达载体 ;转化E .coliDH5α感受态细胞 ,诱导目的重组蛋白表达 ;经SDS PAGE电泳和Western blot鉴定 ,证实表达的重组蛋白确为外源基因 (BPI 60 0bp)编码的产物BPI2 1重组蛋白。     

pEGFP-N1-Fcy::Fur重组质粒的构建及其在卵巢癌细胞中的表达

目的:构建携带融合型自杀基因Fcy::Fur的荧光真核表达质粒pEGFP-N1-Fcy::Fur,并观察其在卵巢癌细胞中的表达.方法:应用基因重组技术,将pORF-Fcy::Fur中的Fcy::Fur目的基因亚克隆到荧光真核表达载体pEGFP-N1,以酶切1和测序鉴定重组质粒的正确性.应用脂质体介导的转染技术将该质粒导入SKOV3细胞,24 h后观察绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)瞬时表达情况,用Western blot方法检测Fcy::Fur表达.结果:酶切和测序鉴定证实插入片段正确.细胞转染24 h后,荧光显微镜下观察到GFP表达.60%转染细胞发出绿色荧光.Western-blot检测到Fcy::Fur表达.结论:成功构建pEGFP-N1-Fcy::Fur荧光真核表达质粒,并可在卵巢癌细胞中有效表达,为卵巢癌基因治疗提供实验基础.     

鹦鹉热嗜衣原体CPSIT_0018融合蛋白原核表达载体的构建、表达及其在Hela细胞中的定位

目的构建鹦鹉热嗜衣原体（Cps）CPSIT_0018原核表达载体,表达并纯化该融合蛋白,观察其在感染的Hela细胞中的定位。方法采用PCR技术从Cps 6BC基因组中扩增CPSIT_0018基因,并构建pET30a-CPSIT_0018原核表达载体,然后转化到宿主菌E.coli BL21中,IPTG诱导His-CPSIT_0018融合蛋白表达,进一步用该融合蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,间接免疫荧光法分析His-CPSIT_0018蛋白在Hela细胞中的分布特征。结果成功构建了pET30a-CPSIT_0018原核表达载体,并表达和纯化较稳定的重组蛋白;在Cps感染的Hela细胞中CPSIT_0018的分布与主要外膜蛋白MOMP相似,而与包涵体膜蛋白IncA的分布模式不同。结论成功克隆表达了His-CPSIT_0018,该蛋白定位在Cps包涵体内。     

SET-EGFP重组表达质粒的构建及表达

目的构建癌蛋白SET与增强型绿色荧光表达载体（EGFP）的融合表达质粒pEGFP—N2-SET并获得表达。方法根据人SET基因序列。设计了一对含有Kozak序列、终止密码子、HindⅢ和KpnI酶切位点的引物。从人L-02肝细胞提取总RNA，以逆转录后cDNA为模板，PCR扩增获得SET基因片段，经双酶切后回收得到有以上两个酶切位点的SET基因片段，将此基因片段克隆至相同酶切回收后的pEGFP—N2载体中，获得重组质粒pEGFP—N2-SET。以Lipofectamine^TM2000为载体，将构建好的真核表达质粒转染到L-02肝细胞中进行瞬时表达。结果。经DNA测序鉴定证实，pEGFP—N2-SET重组质粒构建成功，经荧光倒置显微镜观察，证实能在细胞内进行蛋白表达。结论SET表达质粒的成功构建及表达为其进一步结构和功能研究奠定了基础。     

人视网膜母细胞瘤蛋白真核表达载体的构建及其在前列腺癌细胞中的表达与定位

目的构建人视网膜母细胞瘤(retinoblastoma 1,RB-1)基因真核表达载体,并在前列腺癌细胞株PC-3中表达,为进一步研究其在前列腺癌发病中的作用和机制打下基础。方法采用PCR方法扩增RB-1基因编码区的全长序列,并加上FLAG标签,利用分子克隆技术将其重组于CMV载体中。利用酶切、序列分析鉴定克隆正确性。转染PC-3细胞,用Western Blot检测其表达,用免疫荧光检测其在细胞中的定位。结果克隆的RB-1真核表达载体完全正确,Western Blot检测到RB-1有表达,免疫荧光检测其主要定位于细胞核内。结论成功地构建了RB-1真核表达载体,其能够在PC-3中高效表达,并主要定位于细胞核内。     

人乳头瘤病毒16型 E6蛋白真核表达载体pGADT7-E6的构建与鉴定

目的 构建HPV16 E6基因的真核表达载体,为在酵母菌中表达以及进一步探讨HPV16 E6基因与宫颈癌发生的关系奠定前期实验基础.方法 用PCR扩增含EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点的E6基因序列,双酶切pGADT7载体与E6基因PCR产物,纯化回收后,用连接酶将二者连接并转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆,并对其进行双酶切和测序鉴定,构建HPV16 E6基因的真核表达载体pGADT7-E6.结果 双酶切pGADT7-E6后,琼脂糖凝胶电泳显示2个片段,分别在约500 bp与8.0 kb处.DNA测序结果经与GenBank登录的序列做BLAST分析,显示重组质粒含有477 bp的目的 基因片段,读码框正确,无碱基错配和移码突变.结论 成功构建了HPV16 E6基因真核表达载体pGADT7-E6.     

人乳头瘤病毒16型E6蛋白真核表达载体的构建及表达

目的构建在哺乳动物细胞中表达的人乳头瘤病毒16型早期蛋白6真核表达载体pcDNA3．1（-），E6，为研究HPV16 E6蛋白在细胞永生化作用中的机制奠定实验基础。方法用聚合酶链反应（PCR）扩增E6基因。将PCR产物纯化后与pUCm-T载体连接，经蓝白斑筛选、双酶切鉴定及序列分析后，亚克隆至pcDNA3．1（-）真核表达载体中；阳性克隆经双酶切鉴定后转染RAW264．7巨噬细胞，Western blotting鉴定其在RAW264，7细胞中的表达。结果重组载体经酶切、PCR及测序证明插入片断序列正确无误，转染RAW264．7细胞后可在细胞中表达HPV16E6蛋白。结论成功构建的HPV16E6真核表达载体pcDNA3，1（-）／E6能在RAW264．7细胞中表达E6蛋白。     

肿瘤转移抑制基因KAI1在宫颈癌的表达及其与HPV感染的关系

目的探讨肿瘤转移抑制基因KAI1在宫颈癌中的蛋白表达以及人乳头瘤病毒(HPV)16E6、E7和HPV18E6/E7感染对其表达的影响。方法采用免疫组化SP法检测70例浸润性宫颈癌、15例原位癌、20例正常宫颈组织中KAI1蛋白的表达,采用PCR扩增-琼脂糖凝胶电泳法检测浸润性宫颈癌组织中HPV16E6、E7和HPV18E6/E7的DNA状况。结果宫颈浸润癌及原位癌组织中的KAI1蛋白表达与正常宫颈上皮中的表达相比明显下调(P<0.05),原位癌与浸润癌中的表达差异无统计学意义;HPV16E6、E7和HPV18E6/E7在浸润性宫颈癌中的阳性率分别为67.1%、54.3%和12.9%,HPV16E6、E7和HPV18E6/E7感染与宫颈癌中的KAI1蛋白表达无相关性。结论肿瘤转移抑制基因KAI1在宫颈癌中呈下调表达,HPV16E6、E7和HPV18E6/E7感染不影响其表达。     

人乳头瘤病毒16型E5蛋白真核载体的构建及表达

目的构建人乳头瘤病毒115型（HPV16）E5蛋白真核表达载体pcDNA3．1（＋）／HPV16E5,分析E5在HeLa细胞及BALB／c小鼠肌肉组织中的表达。方法设计HPV16E5基因引物,PCR扩增E5基因。经Bam-HI、EcoR1酶切后将其连接入pcDNA3．1（＋）,PCR及双酶切筛选阳性克隆并测序。将构建的pcDNA3．1（＋）／HPV16E5转染HeLa细胞,利用RT—PCR测定HPV16E5mRNA表达。将6只BALB／c小鼠分为3组,分别取100mgpcDNA3．1（＋）／HPV16E5、100mgpcDNA3．1（＋）、100mLPBS经肌肉注射小鼠,2周1次,共4次;末次接种后第14天取小鼠股四头肌制成石蜡切片,免疫组织化学法检测E5蛋白在小鼠肌肉组织中的表达。结果PCR扩增得到252bpHPV16E5基因片段,DNA测序结果显示E5基因片段正确地连入pcDNA3．1（＋）。构建的pcDNA3．1（＋）／HPV16E5在HeLa细胞表达大小为252bp的HPV16E5mRNA。小鼠股四头肌细胞膜被染成棕黄色。结论构建的真核表达载体pcDNA3．1（＋）／HPV16E5能在HeLa细胞及小鼠肌肉组织中表达HPV16E5蛋白。     

GFP-HPV16 E2及其删除突变体融合蛋白在真核细胞中的表达与定位

目的构建人乳头瘤病毒16型E2(HPV16 E2)及其N端(TAD)、C端(DBD)删除突变体与增强型绿色荧光蛋白(GFP)融合蛋白的真核表达载体,观察其在Hela细胞中的表达与定位。方法HPV16 E2基因经PCR扩增后,与pMD-T载体连接,经蓝白斑筛选、PCR、双酶切鉴定及序列分析后,将E2基因亚克隆至pEGFP-C1真核表达载体中,构建荧光蛋白融合表达载体pEGFP-C1/HPV16 E2。PCR扩增TAD、DBD基因片段,将其双酶切后插入pEGFP-C1,构建荧光蛋白融合表达载体pEGFP-C1/TAD及pEGFP-C1/DBD。将3种质粒转染Hela细胞,在荧光显微镜下观察融合蛋白的表达与定位。结果重组载体经PCR、双酶切鉴定及测序证明插入片段序列正确,且在Hela细胞中能表达目的蛋白;GFP-E2融合蛋白在细胞核与细胞质中都有表达,但主要分布于细胞核;而GFP-DBD融合蛋白仅在细胞核内;GFP-TAD融合蛋白仅在细胞质中。结论构建的绿色荧光蛋白融合表达载体pEGFP-C1/HPV16 E2、pEGFP-C1/TAD及pEGFP-C1/DBD均在Hela细胞中表达,并确定了各自在细胞内的定位。     

HPV16、18E6基因在喉癌组织中的表达

目的 检测HPV16、18E6基因在喉癌中的表达，探讨其在喉癌发病过程中的作用。方法 应用RT－PCR、琼脂糖凝胶电泳方法检测30例声带息肉组织及48例喉癌组织。结果 30例声带息肉组织中6．67％（2／30）有HPV16、18E6基因表达，48例喉癌组织中87．5％（42／48）扩增HPV16E6基因，79．17％（38／48）有HPV18E6基因表达。HPV16、18E6基因与喉癌的临床分型、病理分化程度、临床分期无明显关系（P＞0．05），与淋巴结转移有关（P＜0．05）。结论 HPV16、18E6基因与喉癌的发生密切相关，是喉癌恶性转化的关键，预示着喉癌有较强的增殖能力及转移能力。     

RNA干涉抑制宫颈癌HPV16 E6基因的研究

目的采用RNA干涉（RNAi）技术干扰宫颈癌HPV16 E6基因转录,通过体外和体内实验了解其特异性抑制HPV16 E6基因的效率。方法设计合成针对HPV16 E6的小干扰RNA（siRNA）,借脂质体转染宫颈癌CaSki细胞,通过测定转染后不同时间点的细胞凋亡率、HPV16 E6mRNA及蛋白表达变化了解基因抑制的效率。体内实验中建立子宫颈癌荷瘤裸鼠模型,将E6 siRNA直接注入瘤体,观察肿瘤体积的变化,肿瘤切片HPV16 E6免疫组化染色,观察肿瘤坏死和细胞的凋亡。结果HPV16 E6siRNA转染细胞后24h、48h、5d和9d时凋亡率分别为7．7％、11．8％、37．4％和12．6％。RT-PCR显示转染后24h、48h、5d和9d HPV16 E6 mRNA量减少了77％、83％、59％和41％。Western blot显示转染后的HPV16 E6蛋白表达在24h、48h、5d明显减少,9d时有所恢复;流式细胞仪HPV16 E6蛋白定量测定结果显示,转染后24h、48h、5d和9d蛋白表达抑制率分别为79．7％、80．4％、71．3％和57．4％。体内实验瘤内注射HPV16 E6 siRNA明显抑制肿瘤的生长,HPV16 E6蛋白表达明显受抑,肿瘤组织坏死和细胞凋亡增加,重复给药较单次给药效果更好。结论体内和体外实验均表明RNA干涉HPV16 E6基因的效果具有特异性和高效性。     

应用荧光定量聚合酶链方法检测宫颈组织中人乳头瘤病毒16E6基因

目的　建立荧光定量聚合酶链 (FQ PCR)方法检测宫颈细胞中人乳头瘤病毒 16型(HPV16 )E6基因的方法。方法　以 2 2 0例新疆妇女宫颈不同病变组织DNA作为样本 ,人乳头瘤病毒 16型 (新疆株 )E6基因 (HPV16E6 ,AF32 785 1)作为扩增的靶基因 ,同时以人 β 肌动蛋白基因片段作为内参照 ,借助于设计的目的基因引物 ,两个特异的荧光探针 ,在筛选的FQ PCR优化反应体系中 ,同时对两个基因片段进行扩增 ,得到HPV16E6的相对含量。结果　对 β 肌动蛋白阳性的宫颈不同病变组织中HPV16E6阳性率及其相对含量进行统计分析 ,新疆妇女宫颈脱落细胞标本 96例中 ,HPV16E6阳性 3例 (3 3% ) ;宫颈癌蜡块组织 5 9例中HPV16E6阳性 4 9例 (83 0 % ) ;宫颈上皮内瘤变 (CIN)蜡块组织 6 5例中 ,HPV16E6阳性 2 8例 (75 7% ) ;宫颈炎蜡块组织 33例 ,HPV16E6阳性 2 8例 (93 3% )。HPV16E6的相对含量随病情加重呈上升趋势 ,二者呈显著正相关 ,相关系数为 0 83。结论　建立的FQ PCR检测宫颈不同病变组织内HPV16E6基因的方法 ,能反映单位细胞人乳头瘤病毒的复制情况 ,筛查宫颈癌患者 ,并可能应用于宫颈癌的风险评估和疗效观察。     

喉癌组织中HPV16及其早期区基因E6、E7蛋白的表达及意义

目的:观察喉癌组织中HPV16及其早期区基因E6、E7蛋白的表达,并初步分析其与喉癌组织临床分期、病理分级的相关性.方法:147例喉组织标本,其中喉鳞状细胞癌组织82例,非癌组织39例(声带息肉27例,距肿瘤＞1.0 cm的癌周正常组织12例),癌前病变(声带白斑)26例.免疫组织化学检测各组标本中HPV16及其早期区基因E6、E7蛋白的表达.分析喉鳞癌组织中3种蛋白表达情况与临床分期、病理分级的相关性.结果:喉鳞癌组织中HPV16蛋白及E6、E7蛋白的阳性率明显高于癌前病变组织(P＜0.05或0.01),后者高于非癌组织 (P＜0.05或0.01).非癌组织中HPV16蛋白阳性率明显高于E6、E7蛋白的表达(P＜0.05或0.01),而喉癌组织及癌前组织中三者间无显著差异.不同临床分期(Ⅰ～Ⅳ期)及不同病理分级(Ⅰ～Ⅲ级)喉癌组织中HPV16的阳性率间有显著差异(P＜0.05);而不同临床分期及病理分级间HPV16 E6、E7蛋白表达率无显著差异.结论:HPV16感染后其早期区基因E6、E7的表达可能是诱发喉癌的因素之一,应用免疫学方法抑制E7蛋白的表达对于喉癌的治疗有积极的意义,但其预防和治疗作用不应过分夸大.     

人乳头瘤病毒16型E2蛋白真核载体的构建与表达

目的构建人乳头瘤病毒16型（HPV16）E2蛋白真核载体,为研究其基因疫苗免疫活性奠定实验基础。方法 PCR扩增HPV16 E2基因片段,将其连接到真核表达载体pcDNA3.1（＋）,双酶切及测序鉴定。将质粒pcDNA3.1（＋）与pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2分别转染HeLa细胞,RT-PCR鉴定E2基因在HeLa细胞中的表达。结果 HPV16 E2基因片段插入到pcDNA3.1（＋）相同酶切位点,即构建了真核表达载体pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2;转染pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2的细胞,检测到HPV16 E2 mRNA。结论构建的真核表达载体pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2能在HeLa细胞内有效表达。