HIV-I编码病毒蛋白R基因在真核细胞中的表达及其表达蛋白对KSHV溶解性周期复制的影响

目的:构建含人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)编码病毒蛋白R(Vpr)基因的重组真核表达质粒并初步探索Vpr基因编码蛋白对卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)溶解性周期复制的影响.方法:构建pVpr-Flag重组质粒并进行酶切鉴定和序列测定;将pVpr-Flag重组质粒临时转染BCBL-1和NIH3T3细胞,采用RT-PCR、IFA和Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测Vpr基因的表达情况:提取临时转染pVpr-Flag重组质粒的BCBL-1细胞总RNA,进行RT-PCR检测KSHV次要衣壳蛋白编码基因ORF26(仅在病毒裂解期表达)mRNA转录水平,初步探索HIV-1 Vpr基因编码蛋白对KSHV复制的影响.结果:克隆的Vpr基因序列与GenBank中已登记的Vpr序列100%同源.RT-PCR、IFA和Western blot结果显示Vpr基因mRNA及其编码蛋白在真核细胞中得到了转录和表达.RT-PCR结果进一步显示,Vpr基因编码蛋白能够降低KSHVORF26mRNA转录水平.结论:成功构建含Vpr基因序列的重组质粒并在真核细胞中获得正确表达:初步探索表明Vpr蛋白能够抑制KSHV溶解性周期复制.     

KSHV抗凋亡蛋白vFLIP编码基因的克隆表达及抗vFLIP多克隆抗体的制备与鉴定

目的： 制备由卡波济肉瘤相关疱疹病毒（Kaposi′s sarcoma associated herpesvirus,KSHV）编码的病毒FLICE抑制蛋白（viral FLICE inhibitory protein,vFLIP）的多克隆抗体,通过vFLIP重组蛋白对该抗体特异性进行鉴定,并将此抗体初步应用于天然病毒vFLIP蛋白表达的检测。方法： 对vFLIP蛋白抗原表位进行预测分析,设计并合成3条多肽,将合成肽与载体蛋白钥孔戚血蓝素（KLH）偶联作为抗原,免疫新西兰白兔,制备抗vFLIP的多抗;以pCDH-vFLIP质粒为模板扩增vFLIP片段,插入到真核表达载体pEF-MCS-Flag-IRES/Puro中,构建pEF-vFLIP表达载体,利用脂质体将其转染HEK293T细胞,并在其中表达vFLIP。采用ELISA、蛋白质印迹法鉴定vFLIP多克隆抗体的效价及特异性,将该抗体用于天然病毒vFLIP的检测。结果： 经限制性内切酶鉴定和核酸序列测定证实成功构建了重组质粒pEF-vFLIP,Flag抗体可以特异性识别该质粒在HEK293T和EA.hy926细胞内表达的vFLIP-flag融合蛋白。进一步的ELISA结果显示,制备的兔抗vFLIP多克隆抗体效价为1∶11 000以上。该抗体不但与HEK293T和EA.hy926细胞内表达的重组vFLIP-flag融合蛋白反应,而且能够特异性识别PEL细胞中天然的病毒vFLIP蛋白。结论： 构建了含vFLIP基因的重组真核表达载体;采用人工合成肽作为半抗原制备的抗KSHV vFLIP多抗,可以成功地检测重组vFLIP蛋白和天然病毒蛋白。     

结核分枝杆菌lhp-esat6融合基因原核表达载体的构建和表达

目的 :构建结核分枝杆菌 (MTb) 1hp -esat6融合基因及其原核表达载体并进行表达。方法 :用GeneSOEing法 ,将1hp基因和esat6基因体外重组 ,构建融合基因 ,克隆入pQE30质粒中进行表达。 结果 :构建的融合基因经测序证实完全正确 ,重组体转化表达菌DH5α后 ,经过IPTG诱导 ,表达出 2 6kDa左右的CFP10 -ESAT6融合蛋白。SDS -PAGE分析显示 ,IPTG诱导 4h表达量最高 ,表达蛋白以可溶性非包涵体形式存在于胞浆中 ,表达量占全菌蛋白质的 4 0 % ,Westernblotting证实其有良好的抗原性。表达蛋白经过Ni-NTA柱纯化后 ,获得了纯度为 98%的重组蛋白。结论 :成功构建MTblhp -esat6融合基因 ,成功构建原核表达载体pQE30 -CFP10 -ESAT6 ,并获得重组CFP10 -ESAT6融合蛋白 ,为MTb重组抗原的应用奠定了基础。     

人S100A6-GST融合蛋白的原核表达和纯化

目的:制备人S100A6-GST融合蛋白,为研究人S100A6((hS100A6)蛋白的功能奠定基础.方法:从pHAHA-hS100A6中双酶切获取hS100A6基因,亚克隆至原核表达载体pGST-moluc,构建pGST-moluc-hS100A6,转化BL21后,IPTG诱导重组菌表达hS100A6蛋白,SDS-PAGE及Western Blot鉴定表达产物,Glutathion-Sepharose 4B球珠分离纯化.结果:重组菌株表达出与理论预测值相符的一个约36ku的hS100A6融合蛋白,纯化后的融合蛋白的产量为3mg/L菌液,纯度约92%.结论:成功构建了hS100A6-GST原核表达质粒,在大肠杆菌中表达纯化后得到较高浓度的hS100A6-GST融合蛋白,为hS100A6蛋白功能的研究打下了基础.     

不同激酶活性的hPAK6基因原核表达载体的构建及重组蛋白的表达

目的 构建不同激酶活性的hPAK6原核表达载体并诱导和鉴定其融合蛋白表达.方法 野生型、激酶活型和激酶死型pcDNA3.1-PAK6经EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后,克隆至GST融合表达载体pGEX-5X-1,在E.coli BL21中诱导不同型GST-hPAK6融合蛋白表达,并经免疫印迹鉴定结果.结果 野生型、激酶活型和激酶死型hPAK6编码序列已被克隆至GST融合表达载体pGEX-5X-1,双酶切及测序鉴定正确,并在E.coli BL21中获得了诱导表达,蛋白的分子量均为101 kDa,免疫印迹检测到了融合蛋白表达.结论 成功构建不同激酶活性的hPAK6基因原核表达载体,并分别诱导表达出GST-PAK6融合蛋白.     

结核分枝杆菌esat6基因原核表达载体的构建和表达

目的：构建结核分枝杆菌(MTb)esat6基因原核表达载体并进行表达。方法：PCR扩增MTbeast6基因，克隆入pQE30质粒，测序正确后，再亚克隆入pET32a( )质粒，构建PQE30—ESAT6和PET32a( )—ESAT6重组体。结果：重组体分别转化DH5α和BL21(DE3)菌后，经IPTG诱导，pQE30—ESAT6未表达目的蛋白，而PET32α( )—ESAT6表达出19kDA左右重组蛋白。SDS—PAGE分析显示，IPTG诱导4h重组蛋白表达量最高，表达蛋白以可溶性非包涵体形式存在于胞浆中，表达量占全菌蛋白质的42％，用Westermblotting证实其有良好的抗原性；经过Ni—NTA柱纯化，获得纯度为92％的重组蛋白。结论：成功构建原核表达载体pET32a( )—ESAT6，并获得重组ESAT6蛋白，为MTb重组抗原的应用奠定基础。     

结核分枝杆菌1hp-esat6融合基因原核表达载体的构建和表达

目的：构建结核分枝杆菌(MTb)1hp—esat6融合基因及其原核表达载体并进行表达。方法：用Gene SOEing法，将1hp基因和esat6基因体外重组，构建融合基因，克隆入pQE30质粒中进行表达。结果：构建的融合基因经测序证实完全正确，重组体转化表达菌DH5α后，经过IPTG诱导，表达出26kDa左右的CFP10-ESAT6融合蛋白。SDS—PAGE分析显示，IPTG诱导4h表达量最高，表达蛋白以可溶性非包涵体形式存在于胞浆中，表达量占全菌蛋白质的40％，Western blotting证实其有良好的抗原性。表达蛋白经过Ni—NTA柱纯化后，获得了纯度为98%的重组蛋白。结论：成功构建MTb 1hp—esat6融合基因，成功构建原核表达载体pQE30-CFP10-ESAT6，并获得重组CFP10-ESAT6融合蛋白，为MTb重组抗原的应用奠定了基础。     

卡波济肉瘤相关疱疹病毒编码IL-6基因的分离克隆及在NIH3T3细胞中的表达研究

目的:分离克隆卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)编码IL-6基因(vIL-6),并导入NIH3T3细胞中进行真核表达。方法:根据KSHV编码IL-6基因核苷酸序列设计一对引物,在引物的5′端分别引入BamHⅠ、HindⅢ酶切位点,以原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞系BCBL-1细胞总DNA为模板,PCR扩增vIL-6基因,PCR产物经双酶切克隆进真核载体pcDNA3.1( )。进一步在原有的下游引物5′端加上一段flag序列,以经过序列测定正确的重组质粒为模板,PCR扩增vIL-6-flag融合基因,构建含vIL-6-flag的重组质粒。将该质粒转染NIH3T3细胞,经G418筛选获细胞抗性克隆。最后用抗flagM2单克隆抗体进行Westernblot检测vIL-6在NIH3T3细胞中的表达。结果:获得vIL-6-flag融合基因,全长671bp,其中vIL-6基因核苷酸序列与GenBank中所登记的KSHVvIL-6基因呈现100%同源性。Westernblot结果显示,在约25ku位置有目的条带,与预期的重组vIL-6-flag融合蛋白大小一致。结论:KSHVvIL-6编码基因在NIH3T3细胞中初步获得表达。     

人Heparanase基因真核和原核表达载体的构建及融合蛋白的表达

目的：构建人Heparanase基因的真核、原核表达载体，大肠杆菌表达其融合蛋白．方法：采用反转录．聚合酶链反应从人肝癌细胞株HepG2cDNA中，分别扩增出Heparanase编码基因，用限制性内切酶BamHI消化后，插入真核表达载体pcDNA3．1中，经酶切鉴定与测序证实后，连接成包括完整的人Heparanase基因ORF区的真核表达载体，以亚克隆法构建于原核表达载体pRSET的相应酶切位点，转化大肠杆菌BL21菌株，异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生融合蛋白．结果：构建的人Heparanase基因表达载体经序列测定证实，与GenBank登录结果完全一致；双酶切鉴定证实，克隆基因正确插入载体pcDNA3．1及pRSET；SDS-PAGE证实融合蛋白表达成功．结论：成功构建了人Heparanase基因真核、原核表达载体，成功正确表达了6His／Heparanase融合蛋白     

mompS-linker-flaA融合基因原核表达载体的构建及诱导表达

目的在嗜肺军团菌主要外膜蛋白S基因(mompS)和鞭毛亚单位蛋白基因(flaA)基因间加入一段柔性链接头(Linker),以构建mompS-Linker-flaA融合表达载体,并使其在大肠杆菌中表达。方法以嗜肺军团菌1型DNA为模板,PCR分别扩增获得嗜肺军团菌mompS基因和flaA基因,与带有硫氧还蛋白(Trx)基因的高效原核表达质粒pET32a( )定向重组,构建含mompS-Linker-flaA基因的重组质粒pET-LpSLF,经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,以IPTG诱导表达Trx-MOMPS-Linker-FlaA融合蛋白,用SDS-PAGE及Westernblotting进行鉴定。结果限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,我们扩增出了嗜肺军团菌906bp的mompS及1440bp的flaA基因,成功构建了重组质粒pET-LpSLF,SDS-PAGE及Westernblot分析显示重组质粒pET-LpSLF在原核系统中得到了表达。结论嗜肺军团菌mompS-Linker-flaA基因在大肠杆菌中得到了表达,为进一步从分子水平研究其免疫原性、免疫保护性及其在临床诊断上的应用价值提供研究基础。     

hISO基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达及鉴定

目的: 构建原核表达载体pET-28a(+)-hISO,探讨其融合蛋白在大肠杆菌中的稳定表达情况,为后续实验研究奠定基础。 方法: 以Caco-2细胞的总RNA为模版,采用RT-PCR方法扩增出大小为1770bp的人异麦芽糖酶(hISO)基因片段,将其插入到pET-28a(+)中,构建重组载体pET-28a(+)-hISO。经PCR、酶切及测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,亲和层析纯化重组蛋白,利用SDS-PAGE电泳、Western blotting对重组蛋白进行分析和鉴定。 结果: 经PCR、酶切及测序鉴定后,重组质粒pET-28a(+)-hISO构建正确,表达重组蛋白相对分子质量为68860,将融合蛋白进行纯化,经40和60mmol·L^-1咪唑缓冲液洗脱后能够得到浓度和纯度相对较高的蛋白。 结论: 成功地构建了hISO基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得了融合蛋白表达。     

人分化抑制因子3基因原核表达载体的构建及融合蛋白的表达

目的:在大肠埃希菌中表达和纯化人分化抑制因子3(Id3),为进一步研究Id3的生物学活性打下基础. 方法:PCR扩增人Id3基因编码区的DNA片段,将PCR产物克隆至pGEM-T Esay载体中并测序鉴定.将Id3 cDNA片段重组入原核表达质粒pET-32a( ),转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,用异丙基-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白的表达,表达产物经Western blot 鉴定,并通过镍亲和层析柱纯化His-Tag标记的融合蛋白. 结果:成功地构建了Id3的原核表达载体.Western blot分析证实,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了His-Tag融合蛋白,亲和层析法纯化后获相对分子质量为34 000的Id3融合蛋白. 结论:重组质粒pET32a( )-Id3能在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,镍亲和层析柱可纯化获得融合蛋白.     

hBDNF原核表达载体的构建及其表达

目的:利用基因重组技术构建人脑源性神经营养因子(human brain-derived neurotrophic factor,hBDNF)的原核表达载体pBV220/mhBDNF,诱导表达融合基因,鉴定BDNF的生物学活性。方法:制备重组质粒pGEM-T/hBDNF及hBDNF的成熟肽基因片段,经限制性内切酶联合酶切,将hBDNF亚克隆到原核表达载体pBV220,诱导表达克隆基因,培养鸡胚背根神经节,检测表达蛋白的活性。结果:重组原核表达质粒pBV220/mhBDNF构建正确,表达框架未发生改变。成功诱导表达了融合基因并成功地分泌表达hBDNF蛋白。表达蛋白组可见大量神经突起自神经节组织块外周缘向四周呈放射状长出,损伤组未见明显神经突起长出。结论:成功构建了原核表达载体pBV220/mhBDNF,重组质粒可分泌表达hBDNF蛋白,而且hBDNF蛋白有良好的生物活性。本实验为进一步开展hBDNF基因治疗感音神经性耳聋提供了可能。     

hBDNF原核表达载体的构建及其表达

目的：利用基因重组技术构建人脑源性神经营养因子（human brain-derived neurotrophic factor, hBDNF）的原核表达载体pBV220／mhBDNF,诱导表达融合基因,鉴定BDNF的生物学活性。方法：制备重组质粒pGEM-T／hBDNF及hBDNF的成熟肽基因片段,经限制性内切酶联合酶切,将hBDNF亚克隆到原核表达载体pBV220,诱导表达克隆基因,培养鸡胚背根神经节,检测表达蛋白的活性。结果：重组原核表达质粒pBV220／mhBDNF构建正确,表达框架未发生改变。成功诱导表达了融合基因并成功地分泌表达hBDNF蛋白。表达蛋白组可见大量神经突起自神经节组织块外周缘向四周呈放射状长出,损伤组未见明显神经突起长出。结论：成功构建了原核表达载体pBV220／mhBDNF,重组质粒可分泌表达hBDNF蛋白,而且hBDNF蛋白有良好的生物活性。本实验为进一步开展hBDNF基因治疗感音神经性耳聋提供了可能。     

转录因子Oct-4基因的克隆和原核表达

目的克隆转录因子Oct-4基因、构建原核表达载体。方法从人胚胎标本中提取总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增Oct-4基因的cDNA,再通过基因重组技术将该基因片段克隆到原核表达载体pET-22b(+)中,经酶切、测序鉴定后,用该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,纯化后SDS-PAGE分析表达产物。结果电泳证实RT-PCR扩增产物与预期长度一致,测序结果与GenBank公布的Oct-4基因序列一致较好,IPTG诱导后经SDS-PAGE电泳分析表明,在相对分子质量47KD左右出现目的蛋白表达条带。结论成功构建了pET-Oct-4原核表达载体,表达并纯化出Oct-4蛋白,为进一步研究Oct-4蛋白打下了实验基础。     

TAT-BPI融合蛋白原核表达载体的构建

目的 探讨使BPI能高效率穿透细胞膜或多种屏障,中和不同解剖部位的LPS,构建TAT-BPI原核表达载体并鉴定的方法,为研制多肽抗生素打下基础.方法 人工合成编码TAT蛋白转导区的DNA片段,插入载体pUC57后得到pUC57-TAT重组质粒;提取正常人外周血多形核粒细胞总RNA, 采用RT-PCR技术扩增BPI N端cDNA片段,构建pUC57-TAT-BPI克隆载体;用酶切和双脱氧测序法进行鉴定.结果 获得含有约630 bp的TAT-BPI融合蛋白基因片段序列,测序分析与Genebank中该序列相符,同源性分析TAT序列中第10、30位核苷酸有突变,氨基酸同源性为93%,蛋白质同源性为90%,在BPI序列中234、454、495、556位核苷酸有突变,氨基酸同源性为98%,蛋白质同源性为95%.结论 成功构建了TAT-BPI融合蛋白的原核表达载体,为进一步研究BPI的抗菌作用奠定了基础.Abstract：Objective To enable BPI efficiently penetrate the cell membrane or a variety of barriers, and neutralize endotoxin in different anatomical parts, construct and identify a prokaryotic expression vector of TAT-BPI, in order to lay the foundation for new bio-antibiotic development. Methods A synthesized DNA fragment encoding TAT protein transduction domain was inserted into pUC57 vector. Then Total RNA was extracted from human polymorphonuclear neutrophils(PMN) and then the human BPI cDNA gene was amplified by RT-PCR. The PCR product was cloned into pUC57 plasmid and the sequence was confirmed by restriction enzyme digestion and dideoxy-mediated-chain termination. Results Restriction enzyme digestion and DNA sequence analysis revealed that bioactive N-terminal fragment of BPI were not only identical to those of the published human BPI sequence but also were contained in the recombinant vector. Conclusions pUC57-TAT-BPI is successfully constructed, which lays the foundation for studying the protein of BPI.     

My027融合蛋白表达载体构建及其在大肠杆菌的表达

目的探索My027蛋白的体外表达,通过原核表达获得大量可溶性My027融合蛋白。方法逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法扩增出My027片段,插入原核表达载体pGEX-4T-2,构建质粒pGEX-My027。转化BL-21菌,IPTG低温诱导表达融合蛋白,亲和层析法获得融合蛋白,采用十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)、Western印迹法及质谱进行鉴定。结果融合蛋白以水溶形式分泌于大肠杆菌BL-21胞质中,纯化后的目的蛋白经SDS-PAGE、Western印迹法及质谱证实高效表达,氨基酸序列正确。结论人脂肪细胞新蛋白My027在pGEX-4T-2原核表达载体可获高效表达,为进一步研究其功能奠定基础。