重组质粒pBud-CD44v6的构建及其在胃癌细胞内的表达

目的 构建含人的肿瘤侵袭和转移的特异性抗原CD44v6编码基因的真核表达的重组载体,进行核苷酸序列分析,并在肿瘤细胞中表达.方法 ①以pBud作为真核表达载体,选择CD44v6编码基因进行RT-PCR扩增,构建重组表达质粒,进行酶切鉴定和测序分析.②在Lipofectamine 2000的介导下,将构建成功的pBud-CD44v6重组表达质粒转染到肿瘤细胞中,通过免疫组织化学方法检测CD44v6的表达.结果 经酶切鉴定和测序分析表明,插入的目的 基因片段为CD44v6的编码基因,长为129 bp,与GenBank中登录的cDNA相比较,同源性高达100%,且方向正确;重组质粒pBud-CD44v6转染对数生长期胃癌细胞株SGC-7901,进行免疫组织化学检测结果显示,与空质粒转染组对比,重组质粒组肿瘤细胞的细胞质中可见大量CD44v6基因编码的表达,其蛋白呈棕黄色,而对照组呈阴性.结论 成功构建了pBud-CD44v6真核表达的重组载体,并在肿瘤细胞中表达.     

PCNA和CD44v6在鼻咽癌组织中的表达及其相互关系

目的：研究PCNA和CD44v6在鼻咽癌的表达及其相互关系。方法：应用免疫组化S-P法检测23例慢性鼻咽炎、62例鼻咽癌组织（38例伴有淋巴结转移）中PCNA和CD44v6的表达。结果：62例鼻咽癌组织PCNA和CD44v6阳性表达率分别为69.3%、77.4%,与23例慢性鼻咽炎PCNA、CD44v6阳性率比较,差异有统计学意义（P〈0.05）。鼻咽癌转移组和非转移组PCNA的阳性率分别为68.4%、70.8%,差异无统计学意义（P〉0.05）;转移组CD44v6阳性率要高于非转移组,阳性率分别为89.4%、58.3%,差异有统计学意义（P〈0.05）。PCNA和CD44v6共同阳性表达有39例,共同阴性表达10例,两者表达呈正相关（r=0.436,P〈0.01）。结论：PCNA和CD44v6在鼻咽癌组织中存在高表达,在鼻咽癌的发生、发展中起着重要作用。     

慢病毒介导的siRNA靶向干扰EIF4G1鼻咽癌稳定细胞株的建立

目的 检测人真核翻译起始因子4G1(EIF4G1)基因在8株鼻咽癌细胞中的差异表达,寻找最高表达的细胞株.构建EIF4G1基因的小干扰RNA(siRNA)表达载体,建立稳定干扰EIF4G1表达的鼻咽癌细胞株,测定干扰效率.方法 应用荧光定量PCR检测EIF4G1 mRNA在鼻咽癌细胞株5-8F、6-10B、C666-1、CNE1、CNE2、HNE1、HONE1、SUNE1表达水平.构建重组靶向EIF4G1 shRNA慢病毒表达质粒pLenti6/BLOCK-iT-DEST/EIF4G1shRNA.用293FT细胞包装后产生的成熟慢病毒颗粒感染5-8F细胞.经杀稻瘟菌素筛选后,建立稳定表达siRNA的5-8F鼻咽癌细胞株.最后荧光定量PCR检测干扰效率.结果 在8个鼻咽癌细胞株中,EIF4G1显示在5-8F细胞株中表达最高.PCR和测序验证pLenti6/BLOCK-iT-DEST/EIF4G1shRNA重组质粒构建成功;经293FT细胞病毒包装,感染5-8F细胞后,与阴性对照组和未十扰组相比可明显抑制EIF4G1 mRNA水平EIF4G1表达.结论 成功构建TpLenti6/BLOCK-iT-DEST/EIF4G1shRNA慢病毒重组质粒,建立了稳定靶向干扰EIF4G1表达的siRNA5-8F鼻咽癌细胞株.     

KAI1/CD82基因在不同转移习性人鼻咽癌细胞株中的表达

目的 体外培养5种不同组织学类型的人鼻咽癌细胞株,探讨不同转移潜能的人鼻咽癌细胞株中KAI1/CD82基因mRNA和蛋白表达水平的差异,为鼻咽癌的基因治疗提供理论和实验依据.方法 ①应用实时荧光定量PCR法检测5种人鼻咽癌细胞株中KAI1/CD82基因mRNA的表达水平;②Western blot法检测5种人鼻咽癌细胞株中KAI1/CD82蛋白表达水平.结果 ①不同转移习性的人鼻咽癌细胞均扩增出KAI1/CD82mRNA,且随着细胞转移习性增高,KAI1/CD82 mRNA表达水平逐渐降低(P<0.05);②KAI1/CD82在SUNE-1-6-10B和CNE-1中表达增高,其中在SUNE-1-6-10B中增高明显(P<0.05).结论 ①KAI1/CD82基因在mRNA水平和蛋白水平的表达具有一致性,随着KAI1/CD82基因在不同人鼻咽癌细胞株中mRNA水平表达的增高,在蛋白水平表达也呈增高趋势;②KAI1/CD82基因在低转移性细胞中高表达,而在高转移性细胞中低表达,提示了KAI1/CD82可能在鼻咽癌肿瘤细胞转移机制中发挥重要的抑制作用.     

鼻咽癌中CD44v6和nm23-H1的表达与淋巴结转移关系

目的探讨CD44v6和nm23-H1在鼻咽癌的表达及其与颈淋巴结转移的关系.方法应用免疫组化SP法检测81例鼻咽癌组织中CD44v6和nm23-H1蛋白产物.结果81例鼻咽癌中CD44v6和nm23-H1阳性表达率分别为72.8%和29.6%.51例颈淋巴结转移阳性组CD44v6蛋白表达率(82.4%)高于30例阴性组(56.7%)(P＜0.05),而nm23-H1蛋白表达率(21.6%)低于阴性组(43.3%)(P＜0.05).CD44v6阳性表达伴nm23-H1阴性表达的患者发生淋巴结转移可能性大.结论CD44v6和nm23-H1基因在鼻咽癌淋巴结转移过程中起重要作用,检测CD44v6和nm23-H1基因的表达可作为临床预测淋巴结转移和估计预后的重要指标.     

鼻咽癌组织中环氧化酶-2和CD44v6的表达及其相互关系

目的 研究环氧化酶-2(COX-2)和CD44v6在鼻咽癌的表达及它们在鼻咽癌淋巴道转移中的作用及相互关系.方法 应用免疫组化S-P法检测26例鼻咽黏膜慢性炎、65例鼻咽癌组织和30例鼻咽癌颈部淋巴结转移灶中COX-2和CD44v6的表达.结果 COX-2在鼻咽癌、淋巴结转移灶中的阳性表达率分别是61.5%和83.3%,明显高于鼻咽慢性炎组(P＜0.01);CD44v6在鼻咽慢性炎组的阳性率为15.4%,而在鼻咽癌及淋巴结转移灶中的表达率分别为50.8%和86.7%,两两比较差异有显著性(P＜0.01);在鼻咽癌和淋巴结转移灶中,COX-2阳性表达组CD44v6的表达要高于COX-2阴性组,两者的表达呈正相关(分别P＜0.05,P＜0.01).结论 COX-2在鼻咽癌组织和淋巴结转移灶中异常高表达.COX-2可能通过上调CD44v6的表达来促进鼻咽癌细胞的浸润和转移.     

GM-CSF对膀胱癌EJ细胞株CD44v6表达的影响

目的：明确GM－CSF对EJ细胞增殖及对CD44v6表达的影响。方法：MTT法检测GM－CSF和IFN对EJ细胞增殖的影响，免疫细胞化学法观察GM－CSF对CD44v6表达的影响。结果：GM－CSF以不同浓度作用EJ细胞对其增殖无影响，但GM－CSF联用IFN可抑制J细胞增殖，GM－CSF连用IF可降低CD44v6表达。结果：GM－CSF＋IFN可降低CD44v6在EJ细胞中的表达。     

慢病毒载体介导的RNAi技术构建稳定抑制β-catenin的人鼻咽癌细胞株

目的建立稳定抑制β-catenin基因表达的人鼻咽癌6-10B细胞株,为探讨Wnt/β-catenin信号在鼻咽癌发生中的作用提供细胞模型。方法于β-catenin CTNNB1基因编码区选择3个siRNA靶点合成3对shRNA干扰序列,分别与pLKO.1载体连接,构建pLKO.1-sh-β-catenin质粒(干扰组1)、pLVTHM-sh-β-catenin(干扰组2)和pLKO.1-sh-β-catenin-Neg质粒(阴性对照组);将重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,收集含慢病毒颗粒的上清液感染人鼻咽癌6-10B细胞,感染pLKO.1-sh-β-catenin和pLKO.1-sh-β-catenin-Neg质粒的细胞经嘌呤霉素筛选并扩大培养后得到稳定克隆株。Western blot检测干扰组β-catenin抑制效率及下游基因c-myc蛋白的表达;四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测比较细胞增殖状况,Transwell细胞迁移实验检测细胞迁移率。结果 Western blot检测结果显示pLKO.1-sh-β-catenin(干扰组1)干扰效率最佳,β-catenin及c-myc蛋白表达减少;MTT检测显示干扰β-catenin后细胞吸光度下降,细胞增殖受到抑制;穿过Transwell小室底膜的细胞数:干扰组1为(23.5±4.6)个,明显低于阴性对照组(50.3±5.3,P<0.01)及空白对照组(54.3±5.6,P<0.01)。结论成功构建了β-catenin shRNA慢病毒表达载体,建立了稳定抑制β-catenin基因表达的人鼻咽癌6-10B细胞株,为进一步研究以β-catenin为靶点的鼻咽癌基因治疗奠定基础。     

CD44在脑膜瘤、多形性胶质母细胞瘤及脑转移瘤中的表达

目的　研究 CD44粘附分子在脑膜瘤、多形性胶质母细胞瘤和脑转移瘤中的表达及其在瘤细胞转移、侵袭中的作用 .方法　采用免疫组化 SABC法检测脑膜瘤、多形性胶质母细胞瘤和脑转移瘤各 2 0例及 10例正常脑组织中 CD44 s,CD44 v3,CD44 v6和 CD44 v3- 10的表达 .结果　 1CD44 s在脑膜瘤、多形性胶质母细胞瘤和脑转移瘤中的表达率分别为15 % ,10 0 %和 90 % ,其表达在前两者间有显著性差异 (P<0 .0 1) ;2 CD44 v3,CD44 v6和 CD44 v3- 10在脑膜瘤和多形性胶质母细胞瘤中无阳性表达 ,在脑转移瘤中表达率分别为40 % ,5 0 %和 75 % (P<0 .0 1) ;3CD44 s,CD44 v3,CD44 v6和CD44 v3- 10在正常脑组织中均无阳性表达 .结论　 1CD44 s蛋白可能在多形性胶质母细胞瘤的脑内侵袭过程中起重要作用 ;2 CD44 v蛋白可能在部分脑转移瘤向颅内转移的过程中起作用 ,且有可能成为脑转移瘤诊治的有用指标     

可视化人鼻咽癌细胞模型6-10B-EGFP的建立

目的利用pEGFP-N1质粒转染鼻咽癌细胞株,建立稳定表达绿色荧光蛋白的鼻咽癌细胞株6-10B-EGFP,为整体鼻咽癌可视化研究提供良好的实验材料。方法利用脂质体转染法,将pEGFP-N1质粒转染鼻咽癌细胞株,通过G418抗性筛选、亚克隆扩增获得GFP稳定表达的人鼻咽癌细胞株6-10B-EGFP。结果成功获得多个稳定表达GFP的人鼻咽癌6-10B-EGFP细胞株,比较6-10B和6-10B-EGFP发现,两者生长曲线、细胞周期分布、裸鼠成瘤能力等差异都没有显著性。结论成功建立了非G418依赖、稳定表达GFP且保持母株细胞特性的人鼻咽癌细胞株6-10B-EGFP,为鼻咽癌整体可视化研究打下了坚实基础。     

人KIAA1173基因的克隆、转染及生物学特性的实验研究

目的 建立表达KIAA1173基因的鼻咽癌6-10B细胞模型,并观察转染细胞的生物学活性。方法 从新鲜肌肉组织中提取总RNA,采取逆转录PCR得到人KIAA1173基因cDNA。获得的人KIAA1173基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),进行酶切和序列鉴定。将重组质粒pcDNA3.1(+)-KIAA1173和空载体利用阳离子脂质体介导转入鼻咽癌6-10B细胞,经G418筛选阳性克隆。用RT-PCR、原位杂交及免疫细胞化学等方法检测KIAA1173基因在6-10B细胞中的稳定表达情况,并通过MTT法、肿瘤细胞侵袭实验及裸鼠体内成瘤性实验方法,检测KIAA1173基因对鼻咽癌细胞的增殖、侵袭及成瘤能力的影响。以空白质粒转染组作为对照。结果 在mRNA和蛋白水平证实,转染细胞内有KIAA1173基因的高表达,表明细胞可表达人KIAA1173基因。6-10B在转染了pcDNA3.1(+)-KIAA1173后,较转染空载体pcDNA3.1(+),肿瘤细胞的增殖能力、侵袭能力及裸鼠体内成瘤能力明显降低(P<0.05)。结论 结果提示KIAA1173基因可能是一鼻咽癌肿瘤抑制基因。获得生物学活性稳定的KIAA1173基因高表达的鼻咽癌细胞模型,为进一步研究奠定了基础。     

miR-940慢病毒表达载体的构建以及对鼻咽癌细胞的影响

目的 构建microRNA-940(miR-940)的慢病毒表达栽体,制备重组慢病毒感染人鼻咽癌细胞5-8F,检测其对细胞迁移和增殖的影响。方法 构建慢病毒载体,包装后感染人鼻咽癌细胞,通过加药筛选方法获得稳定过表达miR-940的人鼻咽癌细胞株5-8F/miR-940。实时定量PCR(RT-PCR)检测miR-940的表达量。MTT测定miR-940对5-8F体外增殖的影响。划痕试验检测miR-940对5-8F迁移的影响。结果 构建稳定过表达miR-940的慢病毒表达栽体。MTT证明miR-940可以抑制5-8F在体外的增殖。划痕试验说明miR-940可以抑制5-8F的迁移能力。结论 miR-940能够抑制5-8F在体外的增殖以及迁移能力。     

人KIAA1173基因的克隆、转染及生物学特性的实验研究

目的建立表达KIAA1173基因的鼻咽癌6-10B细胞模型,并观察转染细胞的生物学活性.方法从新鲜肌肉组织中提取总RNA,采取逆转录PCR得到人KIAA1173基因cDNA.获得的人KIAA1173基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1（＋）,进行酶切和序列鉴定.将重组质粒pcDNA3.1（＋）-KIAA1173和空载体利用阳离子脂质体介导转入鼻咽癌6-10B细胞,经G418筛选阳性克隆.用RT-PCR、原位杂交及免疫细胞化学等方法检测KIAA1173基因在6-10B细胞中的稳定表达情况,并通过MTT法、肿瘤细胞侵袭实验及裸鼠体内成瘤性实验方法,检测KIAA1173基因对鼻咽癌细胞的增殖、侵袭及成瘤能力的影响.以空白质粒转染组作为对照.结果在mRNA和蛋白水平证实,转染细胞内有KIAA1173基因的高表达,表明细胞可表达人KIAA1173基因.6-10B在转染了pcDNA3.1（＋）-KIAA1173后,较转染空载体pcDNA3.1（＋）,肿瘤细胞的增殖能力、侵袭能力及裸鼠体内成瘤能力明显降低（P＜0.05）.结论结果提示KIAA1173基因可能是一鼻咽癌肿瘤抑制基因.获得生物学活性稳定的KIAA1173基因高表达的鼻咽癌细胞模型,为进一步研究奠定了基础.     

利用RNA干扰技术研究PTX1在鼻咽癌中的功能

目的: 探讨位于鼻咽癌高频扩增区 12p12-p11的PTX1基因在鼻咽癌中的表达及生物学功能.方法:用RT-PCR和荧光定量RT-PCR检测PTX1在36例鼻咽癌及8例慢性鼻咽炎中的表达.构建发夹状pSUPER-shPTX1干扰载体,转染鼻咽癌细胞系6-10B.mRNA水平检测PTX1基因的干扰效果,采用细胞周期及细胞凋亡检测PTX1被干扰后对鼻咽癌细胞6-10B细胞生物学特性的影响.结果:RT-PCR和荧光定量RT-PCR显示PTX1在鼻咽癌中高表达(P＜0.05).RNA干扰PTX1能抑制鼻咽癌细胞系的细胞增殖,诱导凋亡.结论: RNAi对 PTX1的表达阻断改变了鼻咽癌细胞系6-10B的生物学特性,提示鼻咽癌12p12-p11扩增区获得的PTX1基因可能通过促进细胞的增殖和减少凋亡双途径来参与鼻咽癌的发生发展.     

潜伏膜蛋白1基因真核表达载体的构建及其在鼻咽癌细胞中的表达

目的：构建真核细胞中表达潜伏膜蛋白1（LMP1）基因的增强荧光表达载体,观察其在鼻咽癌细胞中的表达。方法：从鼻咽癌C15细胞中获取编码LMP1的cDNA片段,经双酶切亚克隆到pEGFP-C1质粒载体,构建pEGFP-C1-LMP1真核表达载体。重组质粒经双酶切和测序鉴定,利用脂质体介导的方法将pEGFP-C1-LMP1体外瞬时转染鼻咽癌CNE2细胞,激光共聚焦显微镜观察LMP1的表达及其细胞内定位。结果：重组载体经SalⅠ和BglⅡ双酶切后,行琼脂糖凝胶电泳,可见1条与理论预测值一致的目的条带。DNA序列鉴定证实插入片段与GenBank提供的序列一致。将pEGFP-C1-LMP1瞬时转染鼻咽癌细胞株CNE2后,LMP1基因表达产物定位于细胞膜和细胞质中。结论：成功构建LMP1真核表达载体,并可在鼻咽癌CNE2细胞株中表达。     

抑制核转录因子κBp65对鼻咽癌CNE2细胞的生物学影响

目的  探讨核转录因子κBp65（NF-κBp65）沉默对鼻咽癌的生物学作用。方法  构建NF-κBp65特异性小干扰核糖核酸（siRNA）质粒表达载体（pGPU6/RFP/Neo-NF-κBp65）和阴性对照质粒表达载体（pGPU6/RFP/Neo-NC）。采用非脂质体脂类转染剂将重组质粒表达载体转入人鼻咽癌CNE2细胞,建立NF-κ Bp65沉默的稳定转染CNE2细胞株（NF-κBp65沉默组）和阴性对照细胞株（阴性对照组）;蛋白质印迹法（Western blot）分析癌细胞中NF-κBp65基因的表达水平,MTT实验及流式细胞术分析癌细胞的增殖能力和细胞周期变化;复制裸鼠移植瘤模型,分析沉默NF-κBp65对癌细胞成瘤性的影响。结果  成功获得稳定转染CNE2细胞株,NF-κBp65沉默组细胞中NF-κBp65蛋白表达水平降低;NF-κBp65沉默后,CNE2细胞周期阻滞于S期,增殖速度减慢;NF-κBp65沉默组裸鼠移植瘤生长慢,重量轻,与阴性对照组和空白对照组比较,差异有统计学意义（F =14.386,P <0.05）。结论  NF-κBp65沉默能降低鼻咽癌CNE2细胞的恶性生物学行为。

     

间质蛋白Periostin高表达对鼻咽癌6-10B细胞凋亡的影响及可能机制

目的探讨间质蛋白Periostin高表达对鼻咽癌6-10B细胞凋亡的影响及其可能机制。方法流式细胞术及Western blot技术检测Periostin高表达前后6-10B细胞凋亡率的变化及凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、P53和p-Akt的表达；用稳定转染POSTN的6-10B细胞(6-10B POSTN细胞)及对照组6-10B系列细胞的培养上清,分别刺激6-10B细胞,检测刺激前后6-10B细胞中凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、P53和p-Akt的表达。将人P53 shRNA干扰载体转染到6-10B、6-10B-GFP和6-10B-POSTN细胞中,流式细胞术检测干扰P53后细胞的凋亡率。结果与对照组比较,Periostin高表达后6-10B细胞凋亡率明显升高,Bax和P53蛋白表达上调,Bcl-2的表达差异无显著性,但Bax/Bcl-2比值显著升高,p-Akt蛋白表达显著下调。Periostin高表达的6-10B细胞培养上清培养6-10B后,凋亡率较对照组显著升高。下调6-10B细胞中P53基因后,6-10B细胞的凋亡率较对照组无明显改变,而Periostin高表达的6-10B细胞的凋亡率较对照组显著升高。结论Periostin蛋白的表达上调可以促进鼻咽癌细胞的凋亡；其促凋亡机制与鼻咽癌组织中P53蛋白表达上调无关。     

下调STGC3基因表达对NP69细胞增殖的影响

目的探讨STGC3基因在鼻咽癌发生发展中的作用机制。方法设计基于miRNA30框架的STGC3特异性shRNA,构建STGC3特异性miR30-shRNA真核表达载体pRNAT-U6/shRNA-STGC3,转染永生化人鼻咽上皮细胞系NP69;采用RT-PCR检测未转染、转pRNAT-U6空质粒和转pRNAT-U6/shRNA-STGC3组NP69细胞中STGC3基因mRNA的表达;使用流式细胞仪检测3组细胞周期分布与细胞凋亡情况。结果与未转染组和转pRNAT-U6空质粒组相比,转染pRNAT-U6/shRNA-STGC3的NP69细胞中STGC3基因mRNA表达下降（P（0.05）,G0/G1期细胞比例下降,G2期和S期的细胞比例之和增加（P（0.05）。结论 miR30-based shRNA成功地下调了STGC3在NP69细胞系中的表达;STGC3基因在NP69细胞系的表达下调,使NP69细胞生长增殖速度加快,凋亡减少,提示STGC3对NP69细胞增殖具有抑制作用。     

人B7-H4基因转染细胞株的构建及其对T细胞的作用

目的克隆人B7-H4基因,构建人B7-H4基因转染细胞株并初步研究其对T细胞的作用。方法通过RT-PCR的方法获得人B7-H4分子的基因,将目的片段双酶切(EcoRⅠ和BamHⅠ)后与pIRES2-EGFP真核表达载体连接,构建重组真核表达载体pIRES2-EGFP-B7-H4并进行鉴定;脂质体转染法将重组载体导入L929细胞,经G418加压筛选并通过流式细胞术和RT-PCR检测表达载体是否转入L929细胞中,通过检测活化T细胞上CD25,CD69的表达及T细胞增殖实验对B7-H4转基因细胞的生物学功能进行初步研究。结果从外周血活化单核细胞中扩增出目的基因,构建重组表达载体pIRES2-EGFP-B7-H4并将其转染至L929细胞,构建了一株稳定表达人B7-H4分子的基因转染细胞株,对其生物学功能的研究显示B7-H4分子可以下调活化T细胞上CD25,CD69的表达,并且对T细胞的活化增殖起到抑制作用(P<0.05)。结论成功构建了稳定表达B7-H4分子的基因转染细胞株,为进一步研制B7-H4分子的单克隆抗体提供了有效的免疫原。