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相似文献
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1.
目的:构建一个能在哺乳动物细胞中高表达人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)cDNA的重组质粒。方法:利用化学合成引物,进行PCR,对人G-CSFcDNA5AUG侧翼序列进行翻译优化突变。测序确证后,重组人表达载体pED,构建成质粒PED-GCSF,用DEAE-Dextran法转染COS7细胞,ELISA法定量测定rhG-CSF表达水平。结果:转染COS7细胞后48h收集的上清rhG-CSF表达量为5  相似文献   

2.
目的:使重组人促红细胞生成素(rhEPO)在CHO细胞中获得高效表达。方法:利用基因重组构建了两个人促红细胞生成素cDNA重组表达质粒pED-EPO和pEF-EPO,分别用DEAE-dextran法转染COS7细胞,作瞬时高表达,选pEF-EPO用磷酸钙共沉淀法转染CHO-dhfr-细胞,加入氨甲喋呤(MTX)扩增、选择,作稳定性高表达。结果:pED-EPO和pEF-EPO转染COS7细胞后72h表达量分别为17.8和21.0ng/ml,pEF-EPO转染CHO-dhfr-细胞,随着MTX浓度的增加,CHO-dhfr+的克隆数减少,而混合克隆的EPO表达量逐渐升高。筛选了一株稳定性高表达rhEPO的细胞株,其3d表达量为16μg/ml。结论:rhEPO在CHO细胞中获得了高表达  相似文献   

3.
重组人β—防御素基因在COS—7细胞的转染表达   总被引:2,自引:0,他引:2  
为探索建立持续稳定表达hBD-2的哺乳类动物工程细胞的可能性,作者研究构建真核重组表达载体pCMV.tag2B/hBC-2以进行COS-7细胞转染表达实验。将本室克隆获得的hBD-2全长cDNA片段插入带有报告基因的真核表达质粒pCMV.tag2B构建出hBD-2的重组表达载体pCMV.tag2B/hBD-2,并经DNA测序证明hBD-2cDNA片段的插入方向和其全长cDNA的碱基组成顺序均准确无误。通过脂质体转染法将pCMV.tag2B/hBD-2导入COS-7细胞。RT-PCR法和免疫印迹法分别从mRNA水平和蛋白质水平检测到被转染的COS-7细胞系能有效表达hBD-2。  相似文献   

4.
目的:克隆人血小板生成素(hTPO)cDNA,并研究其在COS-7细胞中的表达。方法:通过RT-PCR法获得hTPO cDNA,测序后克隆到真核表达载体pED上,以DEAE-dextran法转染COS-7细胞,巨核细胞集落形成培养法测表达产物活性。结果和结论:获得的hTPO cDNA和献报道的序列一致。转染细胞RNA斑点杂交结果显示TPO cDNA获得转录,转染后48和72h的细胞上清均可测到T  相似文献   

5.
建立Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制剂(PAⅠ-1)cDNA哺乳动物细胞表达体系。用人工合成的6个寡核苷酸连接成编码PAⅠ-1N-端10个氨基酸和23个氨基酸的信号肽顺序;将构成的完整PAⅠ-1cDNA插入真核表达质粒pSV2dhfr中,获得真核表达质粒pZYS-1;将pMA212中的hMT-ⅡA的起动子再插入pZYS-1,使PAⅠ-1cDNA受SV40和hMT-ⅡA双启动子控制,得pZYS-2。2个表达质粒分别在COS-7细胞中进行表达。结果:获得两个真核表达质粒,在COS-7细胞中得到表达,在培养液中的PAⅠ-1活性和抗原含量分别为234.7IU/ml和30μg/L。结论:pZYS-1和pZYS-2两株PAⅠ-1cDNA真核表达质粒在COS-7细胞中能有效表达和分泌。  相似文献   

6.
血红素加氧酶—1 cDNA在COS—1细胞内的表达   总被引:2,自引:0,他引:2  
通过构建表达质粒pcDNA3HO1,并在COS-1细胞中的瞬时表达,证实分离的cDNA编码血红素加氧酶-1,以探讨HO-1在新生期黄疸中的作用机制。实验中构建含编码HO-1 cDNA的表达型质粒pcDNA3HO1,培养COS-1细胞,表达型质粒pcDNA3HO1转染COS-1,收集细胞,超声破膜,超速离心得到微粒体颗粒,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定和酶活性检测,结果显示:HO  相似文献   

7.
双诱导模式原核表达系统的建立与应用   总被引:1,自引:0,他引:1  
将yG-CSF cDNA片段克隆于T7噬菌体RNA聚合酶启动子系统的表达载体pJGW1中,并与可热诱导T7RNA聚合酶产生的质粒pGP1-2共同转化大肠杆菌DH5α,经化学诱导或温度诱导,hG-CSF重组蛋白表达率〉30%,并具有特异的生物活性。  相似文献   

8.
人B7.2cDNA的克隆及其核表达   总被引:1,自引:0,他引:1  
为克隆人B7.2cDNA,构建B7.2真核表达质粒,并在哺乳动物细胞中表达。分离正常人淋巴结淋巴细胞,经LPS诱导后,以RT-PCR,克隆B7.2cDNA;构建真核表达质粒pBCMGSNeo-B7.2,转染哺乳细胞,进行表达。结果成功克隆了B7.2cDNA,并经测序证实:所构建的B7.2抗原真核表达质粒可在哺乳动物细胞中高效表达。表明经LPS诱导的人淋巴细胞可表达B7.2mRNA,所建立的pBCM  相似文献   

9.
目的:研究不同真核载体对人促红细胞生成素cDNA的表达效率。方法:人促红细胞生成素cDNA分别用真核表达载体pcDNA3、pcDI、pAdCI进行重组,脂质体法转化COS 7细胞,以TF 1细胞检测EPO的表达活性。结果:感染pcDNA3 EPO,pcDI EPO,和pAdCI EPO的COS 7细胞培养上清中人促红细胞生成素活性分别为05×102,15×103和22×102。结论:已构建成可表达具生物活性的重组人促红细胞生成素的真核表达克隆,嵌合内含子序列可增强人促红细胞生成素CDNA的表达效率  相似文献   

10.
绿色荧光蛋白GFP在转化细胞和肿瘤细胞中的表达   总被引:4,自引:0,他引:4  
目的:在肿瘤基因治疗研究中建立一个用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)为标记基因的合适条件。方法用带有GFP突变体的质粒转染到表达细胞,观察GFP瞬时表达的情况:1.直接测定GFP在COS-7细胞中的表达并观察表达的稳定性;2比较不同启动子驱动的pcDNA3-EGFP和pSVK3-S65T两种质粒在不同肿瘤细胞中的转染效率;3用LacZ基因与GFP基因共转染  相似文献   

11.
利用基因工程手段获取编码人补体1抑制物(C1-inhibitor,C1-INH)的基因片段,将其插入双顺反子表达载体pED中,构建成功可在CHO细胞中有效表达人C1-INH的表达质粒。采用Lipofectin法将其转染二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞(CHO-dhfr-),获得有效表达人C1-INH的CHO-dhfr 细胞克隆。经Northern印迹、免疫及Western印迹等试验检测证实,重组的细胞克隆可以表达人C1-INH,特异性ELISA检测其表达水平在0.4μg/ml左右。重组C1-INH活性检测采用酯酶裂解抑制法。  相似文献   

12.
目的:报道一种新的基因治疗方法。方法:将人全长血小板生成素(thrombopoietin,TPO)基因克隆至pBacMam2载体,与BacVector3000病毒DNA共转染昆虫sf9细胞,经筛选后获得可在哺乳类动物细胞高效表达的昆虫病毒,以此为载体,将人TPO基因导入小鼠体内。结果:获得可在哺乳类动物细胞高效表达的昆虫病毒株,动物实验外周血小板计数升高至正常的2~3倍,RTPCR结果显示TPO在小鼠组织中得到表达。结论:重组rhTPO昆虫病毒是一种有效的基因治疗载体。  相似文献   

13.
间隙连接蛋白connexin43基因在真核细胞中的表达   总被引:1,自引:0,他引:1  
目的:构建携带间隙连接蛋白connexin43 cDNA的真核表达载体,建立connexin43蛋白高表达细胞株。方法:connexin43 cDNA在大肠杆菌中扩增后连入真核表达载体pEN4,转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,用甲氨喋呤(MTX)筛选得到connexin43基因高表达细胞。结果:酶切电泳结果显示载体pED4-Cx43按设计构建。经MTX筛选得到不同抗性的CHO细胞,免疫组织化学方法显示有connexin43蛋白的表达,但表达量有限。细胞间染料传递实验证实不同MTX抗性的CHO细胞间传递小相对分子质量物质的能力有差异。结论:利用载体pED4可以使connexin43基因在真核细胞内表达。  相似文献   

14.
人红细胞生成素cDNA在COS7细胞中高效表达   总被引:1,自引:1,他引:0  
  相似文献   

15.
目的:研究双质粒T7表达系统在真核细胞中表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的情况。方法:脂质体介导的T7双质粒共转染真核细胞,以斑点酶免疫试验(DOT-EIA)检测HBsAg表达情况。结果:HBsAg在质粒转染细胞后24h开始表达,72h达高峰。结论:T7双质粒表达系统能在体外培养的真核细胞中高效表达HBsAg,该系统可能在乙型肝炎病毒(HBV)基因免疫、外源性蛋白的制备等方面发挥重要作用。  相似文献   

16.
目的:构建颗粒溶解素(granulysin)cDNA真核表达载体。方法:采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术从健康志愿者外周血单个核细胞(PBMC)中扩增出颗粒溶解素蛋白cDNA,经限制性核酸内切酶消化后,插入真核表达载体pcDNA3.1(-)的相应酶切位点,将此重组质粒进行序列测定,并将重组质粒转染COS7细胞,进行基因表达鉴定。结果:重组质粒插入基因序列测定证实为颗粒溶解素cDNA,并能在COS7细胞稳定表达。结论:成功构建颗粒溶解素真核表达载体,为进一步研究其抗结核作用奠定了基础。  相似文献   

17.
目的 建立逆转录病毒载体介导的人凝血因子Ⅷ (FⅧ )体外高效表达体系。方法 将一B区缺失 (76 0aa~ 16 39aa)的人FⅧcDNA(FⅧcDNABD)克隆至逆转录病毒载体pLNCX ,构建了重组表达载体LNC ⅧBD。经PA317细胞包装后 ,感染多种靶细胞。分别采用一期法、ELISA法和RT PCR检测细胞培养上清中人FⅧ的凝血活性 (FⅧ∶C)和抗原含量 (FⅧ∶Ag)以及细胞中FⅧcDNABD的转录。结果 重组逆转录病毒载体LNC ⅧBD在四种靶细胞中有不同程度的表达。其中以NIH3T3细胞的表达最高 ,FⅧ∶C为 1.6U/ 10 6细胞·2 4hrs 1,FⅧ∶Ag为 5 0 0ng/ 10 6细胞·2 4hrs 1。CHO细胞表达的FⅧ∶C活性为 0 12U/ 10 6细胞·2 4hrs 1,FⅧ∶Ag为 6 2 4ng/10 6细胞·2 4hrs 1。FⅧ在Cos 7和一正常成人肝细胞系L 0 2中表达较低。RT PCR可检测到靶细胞中人FⅧcDNABD的转录的mRNA。结论 逆转录病毒载体能够介导人FⅧ的体外高效表达 ,为血友病A的基因治疗奠定了基础  相似文献   

18.
目的:采用质粒尾静脉快速输注以获得肝细胞生长因子(HGF)小鼠体内高表达.方法:扩增HGF质粒,并酶切鉴定.将不同剂量的HGF质粒通过尾静脉快速注入6~8周龄的非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠体内,ELISA法检测外周血中HGF水平,同时Western法检测小鼠肝组织内HGF蛋白含量.结果:快速注入HGF质粒后,体内HGF水平明显上升,以20 μg/1.6 ml剂量组最高.注射后4 h即可见到HGF水平明显上升,12 h达到顶峰,然后逐渐下降,但6天后仍可测到较高水平的HGF.Western结果显示注射后肝组织中HGF表达量迅速上升,峰值在第8 h左右出现,而后逐步下降.结论:HGF质粒尾静脉快速注射可使小鼠体内HGF高表达.  相似文献   

19.
Role of adhesion molecules in mobilization of hematopoietic cells   总被引:7,自引:0,他引:7  
Objectie To study the changes of adhesion molecules‘ expressions during the recombinant human granulocyte-colony-stimulating factor(rhG-CSF)mobilization in peripheral bolld stem cell transplantation (PBSCT),and to confirm the influence of rhG-CSF on hematopoietic stem cells,which are proposed to guide mobilization in PBSCT.Methods Mice were injected subcutaneously with diluted rhG-CSF or normal saline for 7 days.The blood Sca-1^ stem cell count and bone marrow(BM)nucleated cell count were enumerated.The expressions of CD49d and CD44 and the adhesive ability of mononuclear cells to bone marrow matrix(fibronectin)were examined by flow cytomety and ^51Cr adhesive assay,respectively.Results The mobilizing effect of rhG-CSF on mice was the same as on humans.The number of Sca-1^ cells in peripheral blood reached the peak on the seventh day,the BM nucleated cell count was reduced,and the expressions of CD49d and the cells‘ adhesive adility in BM and PB declined.Conclusions rhG-CSF can reduce some cell adhesion molecules‘ expressions and the adhesive ability of hematopoietic stem cells to BM matrix,therefore mobilizing hematopoietic stem cells(HSC) from the BM to the peripheral blood.  相似文献   

20.
Li Y  Chen N  Yu HJ  Dong XP  Huang QH 《中华医学杂志》2006,86(8):544-548
目的构建骨形成蛋白-7(BMP-7)全长基因表达质粒,观察BMP-7过表达对转化生长因子(TGF)-β诱导的人肾小管上皮细胞细胞外基质分泌(ECM)的作用。方法将BMP-7全长cDNA连接进入真核细胞表达质粒pcDNA3·1中,以脂质体Superfect介导的方法将重组表达质粒pcDNA3·1-BMP-7转染入人肾小管上皮细胞,挑选阳性克隆,以获得稳定转染的人肾小管上皮细胞株。采用Western印迹方法检测BMP-7在肾小管上皮细胞培养上清液中的表达。给予TGF-β(5ng/ml)进行处理,应用RT-PCR和ELISA的方法,观察BMP-7过表达对纤维粘连蛋白(FN)、胶原Ⅰ、Ⅲ(ColⅠ、Ⅲ)等细胞外基质mRNA和蛋白质表达的作用。结果EcoR I限制性酶切鉴定以及DNA双向测序结果均说明所构建的重组质粒为BMP-7全长基因表达质粒。Western印迹方法检测稳定转染人肾小管上皮细胞蛋白表达量明显高于空载体转染组(P<0·05)。TGF-β处理24、48、72h后,5ng/ml TGF-β处理组、空白质粒转染(pcDNA3·1)+5ng/ml TGF-β组ColⅠ、Ⅲ、FN mRNA的表达量明显高于正常对照组,空白质粒转染组(pcDNA3·1)[ColⅠ(A值):0·897±0·100、1·054±0·090vs0·286±0·010、0·319±0·080;ColⅢ(A值):1·114±0·040、0·961±0·090vs0·354±0·020、0·403±0·040;FN(A值):1·257±0·090、1·188±0·060vs0·413±0·020、0·454±0·060,均P<0·05];Col I、FN mRNA表达量pcDNA3·1-BMP-7转染组+5ng/ml TGF-β组明显低于TGF-β处理组(0·591±0·007、0·687±0·020,P<0·05),ColⅢmRNA表达有降低趋势(0·809±0·090),但差异无统计学意义。细胞培养上清液FN含量5ng/ml TGF-β处理组、空白质粒转染(pcDNA3·1)+5ng/mlTGF-β组明显高于正常对照组(P<0·05),而pcDNA3·1-BMP-7转染组+5ng/ml TGF-β组表达明显低于TGF-β处理组(P<0·05)。结论BMP-7过表达可以显著减少TGF-β所致的人肾小管上皮细胞FN、ColⅠ、ⅢmRNA和细胞培养上清液中的FN的表达。表明BMP-7减少小管间质炎症反应和纤维化的发生,改善肾功能的作用,部分是通过抑制肾小管上皮细胞分泌细胞外基质实现的。  相似文献   

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