快速诊断疟疾胶体金免疫层析试条方法的建立与评价

目的 建立一种能区分恶性疟的快速、简便诊断疟疾的胶体金免疫层析试条方法，并对其进行评价。 方法 筛选基于恶性疟原虫乳酸脱氢酶制备的单克隆抗体对，采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，标记筛选到的单克隆抗体F4H12、G4C9和D8F7，并将其吸附于样品垫；将单克隆抗体B2G10（针对恶性疟原虫与间日疟原虫）和D6A7（只针对恶性疟原虫）分别划线包被于同一硝酸纤维素膜适当位置，制成免疫层析检测试条。用该试条检测疫区非疟疾发热病人血样（107份）和内脏利什曼病患者血样（17份）以评价其特异性，检测确诊的疟疾患者血样（间日疟110份， 恶性疟54份）以评价其敏感性。均用单盲法检测。 结果 检测107份疫区非疟疾发热病人血样和17份内脏利什曼病患者血样，有119份显示为阴性，特异性约为96.0%；其中17份内脏利什曼病患者血样全部为阴性。检测164份疟疾患者血样，阳性153份，敏感性为93.3%，其中间日疟检出率为92.7%（102/110），恶性疟检出率为94.4%（51/54）。 结论 研制出的快速诊断疟疾胶体金免疫层析试条敏感性、特异性均较高。     

两种鉴别诊断恶性疟和间日疟免疫层析试条检测效果评价

目的 对两种快速、简便能区分诊断恶性疟和间日疟的胶体金免疫层析试条的检测效果进行评价. 方法 筛选基于恶性疟原虫富组蛋白Ⅱ和恶性疟原虫乳酸脱氢酶制备的单克隆抗体对,采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记筛选到的单克隆抗体C6E9和G4C9,并将其同时吸附于样品垫;将单克隆抗体B2G10(针对恶性疟原虫与间日疟原虫)和C6H.(只针对恶性疟原虫)分别划线包被于同一硝酸纤维素膜适当位置,制成免疫层析检测试条.用该试条检测疫区非疟疾发热病人血样(120份)和内脏利什曼病患者血样(20份)以评价其特异性,检测确诊的疟疾患者血样(间日疟105份,恶性疟95份)以评价其敏感性.均用单盲法检测,同时用基于恶性疟原虫乳酸脱氢酶制备的单克隆抗体对制备的试条进行平行检测. 结果 检测120份疫区非疟疾发热病人血样和20份内脏利什曼病患者血样,有138份显示为阴性,特异性为98.6％,其中20份内脏利什曼病患者血样全部为阴性.检测200份疟疾患者血样,阳性190份,敏感性为95.0％,其中间日疟检出率为93.3％ (98/105),恶性疟检出率为96.8％ (92/95).基于恶性疟原虫乳酸脱氢酶制备的单克隆抗体对制备的试条检测的敏感性和特异性分别为93.5％ (187/200)和95.7％ (134/140),与本研究制备的基于恶性疟原虫富组蛋白Ⅱ和恶性疟原虫乳酸脱氢酶制备的单克隆抗体对的试条比较两者敏感性(x2=0.42,P＞0.05)和特异性(x2=1.09,P＞0.05)的差异均无统计学意义. 结论 研制出的基于恶性疟原虫富组蛋白Ⅱ和恶性疟原虫乳酸脱氢酶制备的单克隆抗体对的快速诊断疟疾胶体金免疫层析试条敏感性、特异性均较高.     

套式/多重PCR方法应用于疟疾诊断与监测的初步评价

目的 与镜检法比较评价标签引物-套式/多重PCR（UT-PCR）在疟疾监测中的应用价值。 方法 在海南、云南省恶性疟和间日疟混合流行区和广西疟疾控制区的疟疾监测中,采集初诊为疟疾或疑似疟疾的发热患者的血片与滤纸血样400份,在双盲条件下比较镜检法与UT-PCR的初检结果,对结果不一致的血片再次镜检复查,同时对其滤纸血样重复PCR 2～3次;评估UT-PCR与镜检法的敏感性和特异性。 结果 400例发热患者血样中,镜检法初检检出疟原虫阳性234例,其中恶性疟125例,间日疟109例;UT-PCR检出疟原虫阳性235例,其中恶性疟124例,间日疟109例;恶性疟和间日疟混合感染2例。两法初检结果一致的血样占92.5%（370/400）,其中阴性154例,阳性216例（间日疟117例,恶性疟99例）。复查25份初检结果不一致的血样,包括镜检阴性PCR阳性11例,镜检阳性PCR阴性10例,镜检为恶性疟PCR为间日疟3例,镜检为间日疟而PCR为混合感染1例,其中15份与UT-PCR的初检结果一致,7份“假阳性”原因不明,仅3份为PCR的假阴性。根据复查结果评估PCR的敏感性为99.6%,特异性为98.8%。 结论 采用更敏感的UT?鄄PCR疟疾诊断方法有助于解决疟疾诊断与鉴别诊断中的疑难问题,提高疟疾监测的质量和效率。     

标签引物-套式/多重PCR检测恶性疟原虫和间日疟原虫的研究

目的 建立简便、灵敏、低本底、可同时检测恶性疟原虫和间日疟原虫的套式/多重聚合酶链反应（PCR）系统。 方法 应用标签引物扩增技术、Primer Premier 5.0软件、美国生物信息中心(NCBI-BLAST)网络资源和矩阵试验法优化套式/多重PCR，检测疟疾患者滤纸血样并与镜检结果进行比较。 结果 新建立的标签引物套式/多重PCR，检测模拟现场滤纸血样的敏感性为恶性疟原虫1～2个虫/μl血，间日疟原虫5～10个虫/μl血。检测71份现场采集的镜检疟原虫阳性滤纸血样（恶性疟24份和间日疟47份）的结果与镜检结果的符合率分别为87.5%和100%。 结论 通过标签引物扩增技术优化的套式/多重PCR系统，适用于检测现场采集的滤纸血样，其检出低原虫血症的敏感性和鉴定虫种的准确性均优于镜检法，是很有潜力的疟疾诊断技术。     

高通量基因芯片在口岸疟原虫检测中的应用

目的验证及应用一种同时快速检测4种疟原虫的高通量基因芯片方法。方法收集上海口岸现场经显微镜镜检及荧光PCR确认后的间日疟、恶性疟、三日疟、卵形疟病例血样,采用高通量基因芯片对4份疟原虫阳性血样同时进行验证检测。提取4种疟原虫DNA,采用实时荧光定量PCR进行定量,使用芯片检测经梯度稀释的疟原虫DNA样品,评价芯片的灵敏度。将4种疟原虫DNA和相同数量级浓度的诺氏疟原虫、微小隐孢子虫、结肠小袋纤毛虫DNA进行交叉反应检测,评价芯片的特异性。采集50例云南现场疑似疟疾病例血样,采用芯片进行检测,并与镜检结果进行比较。结果芯片检测上海口岸4份疟原虫阳性血样的结果与镜检和PCR结果相符,检测过程仅需2 h。芯片灵敏度检测结果显示,其对疟原虫DNA的检测下限分别为间日疟原虫78 copies/μl、三日疟原虫87 copies/μl、恶性疟原虫135 copies/μl、卵形疟原虫302 copies/μl。芯片特异性检测结果显示, 4种疟原虫均可检出,诺氏疟原虫、微小隐孢子虫、结肠小袋纤毛虫均未检出,无交叉反应。云南现场采集的50份疑似疟疾病例血样芯片检测结果显示,间日疟原虫阳性18份、恶性疟原虫阳性12份、三日疟原虫阳性1份,与镜检结果相符。结论该高通量基因芯片可以同时检测4种疟原虫,具有快速、准确、灵敏度高的特点,适合现场筛检及疟疾疫情防控的需要。     

PCR检测疟疾混合感染的现场应用研究

目的　评价PCR检测技术在间日疟与恶性疟混合感染区诊断疟疾的现场应用价值。　方法　采集海南省疟疾混合感染流行区 3 0 4份滤纸干血滴样本 ,根据红内期疟原虫SSUrRNA基因序列 ,设计合成 3条引物 ,采用PCR技术在同一反应体系中扩增出间日疟原虫和恶性疟原虫不同的DNA片段 ,检测现场所采样本中的间日疟原虫或恶性疟原虫DNA ;同时与镜检法进行比较。　结果　在 3 0 4份样本中 ,PCR法阳性 15份 ,其中间日疟 7份 ,恶性疟 8份 ;镜检法阳性11份 ,其中间日疟 6份 ,恶性疟 5份。镜检阳性的样本PCR均为阳性 ;镜检阴性而PCR阳性的 4份样本 ,其扩增产物经限制性酶切鉴定 ,证实为间日疟原虫或恶性疟原虫DNA。　结论　此PCR检测体系灵敏、特异 ,对诊断或鉴别诊断间日疟原虫和恶性疟原虫混合感染具有实用价值。     

PCR检测疟疾混合感染的现场应用研究

目的 评价PCR检测技术在间日疟与恶性疟混合感染区诊断疟疾的现场应用价值。方法 采集海南省疟疾混合感染流行区304份滤纸干血滴样本，根据红内期疟原虫SSUrRNA基因序列，设计合成3条引物．采用PCR技术在同一反应体系中扩增出间日疟原虫和恶性疟原虫不同的DNA片段，检测现场所采样本中的间日疟原虫或恶性疟原虫DNA；同时与镜检法进行比较。结果 在304份样本中，PCR法阳性15份，其中间日疟7份．恶性疟8份；镜检法阳性11份，其中间日疟6份，恶性疟5份。镜检阳性的样本PCR均为阳性；镜检阴性而PCR阳性的4份样本，其扩增产物经限制性酶切鉴定，证实为间日疟原虫或恶性疟原虫DNA。结论 此PCR检测体系灵敏、特异．对诊断或鉴别诊断间日疟原虫和恶性疟原虫混合感染具有实用价值。     

逆转录聚合酶链反应检测和鉴定疟原虫的研究

在同一反应体系中建立能同时检测和鉴定恶性疟、间日疟及混合感染的逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测方法,并用于现场采集血样检测。先以恶性疟原虫小亚单位核糖体核糖核酸基因为靶片段,设计1对针对恶性疟原虫的特异性引物,建立RT-PCR检测恶性疟原虫方法,在此基础上,增加1条针对间日疟原虫的种特异性引物,使在同一反应体系中,能够同时扩增恶性疟原虫和间日疟原虫的特异片段。恶性疟原虫和间日疟原虫模板在同一反应体系中分别被扩增出预期大小为359bp和449bp特定扩增带,健康人血样和空白对照均未见扩增带。用建立的RT-PCR检测方法对现场采集128份血样进行检测,与镜检的阳性符合率为9609%,14份镜检为阴性的发热病人全血标本中2份RT-PCR检测为间日疟阳性。RT-PCR检测疟原虫方法具有敏感性高、特异性强的特点,对疟疾诊断、镜检质量控制和流行病学研究具有较大的实用价值。     

恶性疟原虫重组乳酸脱氢酶胶体金免疫层析法检测试纸条的研制

目的 用氯金酸标记抗恶性疟原虫乳酸脱氢酶（LDH）单克隆抗体（McAb），研制用于诊断恶性疟原虫和间日疟原虫感染的胶体金免疫层析（GICA）试纸。方法 采用柠檬酸盐还原法制备胶体金颗粒、标记抗恶性疟原虫重组乳酸脱氢酶单克隆抗体，制成免疫层析检测试纸条。用该试纸条检测已知疟疾病人及健康人血样，鉴定方法的敏感性和特异性。结果 检测重组LDH抗原的最小量为5ng／ml；对30例恶性疟病人血样及40例间日疟病人血样进行检测，敏感性分别为83．33％和57．50％，检测100例健康者血样特异性为98．00％。结论 初步建立了同时诊断恶性疟原虫和间日疟原虫感染的GICA检测法。     

间日疟原虫环子孢子蛋白基因片段的扩增应用于诊断间日疟感染的研究

根据间日疟原虫环子孢子蛋白（ＣＳＰ）基因序列，设计并合成间日疟原虫特异性引物一对，采用聚合酶链反应技术，进行间日疟原虫感染的检测。结果：（１）从间日疟原虫患者的全血ＤＮＡ中扩增出约７７２ｂｐ的基因片段，经限制性内切酶切，证实为间日疟原虫ＣＳＰ基因片段；（２）与间日疟原虫亲缘关系相近的三株恶性疟原虫、弓形虫、利什曼原虫和正常人全血核酸抽提物经扩增后均未见特异性的扩增条带；（３）该检测体系可检测出间日疟原虫感染血样中２．８虫／μｌ血的水平；（４）将该检测体系用于深圳地区及湖北随州地区间日疟感染患者血样的检测，１４７份患者的血样中１４４份检出阳性，可见一条特异性扩增带，与镜检的符合率达９８％，而２０正常人血样均为阴性。上述结果表明该法灵敏、特异且稳定性好，适用于间日疟感染的检测。     

应用巢式PCR评价低流行区疟疾诊断结果

目的初步评价大连市疾控人员对疟疾的诊断能力,为低流行区疟疾诊断方法的选择提供理论依据。方法收集2010--2012年大连市上报的27例疟疾阳性病例的血液样本．应用巢式PCR（nest—PCR）方法对诊断结果进行复核：以复核结果为标准,比较镜检和快速诊断试剂盒（rapid diagnosistest．RDT）方法的检测敏感性及对虫种鉴定的正确率。结果27份样本的巢式PCR结果为恶性疟23份,间日疟2份,卵形疟l份,阴性1份,无混合感染。镜检对阳性样本的敏感度为76．9％（20／26）,远低于RDT方法的96．2％（25／26）;镜检和RDT联合使用,敏感度可达100％。对虫种的鉴别,镜检对阳性样本的正确检测率为50％（13／26）：RDT方法仅能鉴别恶性疟和非恶性疟．对恶性疟阳性样本的正确检测率为100％（23／23）。结论采用镜检和RDT联合应用的方法,能够提高检测的敏感性。建议在有条件的疾控单位建立人体疟原虫的分子检测体系．更有效地防止对疟疾病例的漏诊和误诊。     

缅甸拉咱市氯喹治疗间日疟的敏感性评价

缅甸拉咱市单纯间日疟原虫感染者48例分为氯喹A方案组（26例）和B方案组（22例）,分别采用成人总剂量1 200 mg （第1天顿服600 mg,第2、3天300 mg/d）和1 500 mg（第1天顿服750 mg,第2、3天375 mg/d）的三天疗法治疗。于服药当天、服药后第1、2、3、7、14、21和28天采集指血或耳垂血制作厚、薄血涂片检查疟原虫,测量体温和观察药物不良反应。氯喹治疗后,两组病例血内无性体原虫3 d内全部阴转。第28天随访治愈率为100%。结果表明,缅甸拉咱市的间日疟病例对氯喹治疗均敏感,该边境地区间日疟病例可采用氯喹进行临床治疗。     

Detection of Plasmodium vivax infection in the Republic of Korea by loop-mediated isothermal amplification (LAMP)

Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) is a novel technique that rapidly amplifies target DNA in isothermal conditions. In a previous study, the sensitivities and specificities of LAMP, microscopy, and nested PCR were compared in the context of rapid malaria detection. In the present study, LAMP detected vivax malaria parasites in 115 of 117 microscopically positive samples (sensitivity, 98.3%; 95% CI, 97.4-100%), which agreed well with the nested PCR results (sensitivity, 99.1%; 95% CI: 96.0-100%). No positive cases of malaria were detected by LAMP or nested PCR in 50 consecutive feverish patients other than malaria from malaria endemic areas. LAMP performed on DNA extracted from heat-treated blood had a sensitivity of 93.3% (28/30, 95% CI: 84.4-100%) and specificity of 100% (30/30, 95% CI: 100%). The present study shows that LAMP based assays have high sensitivity, specificity, and amplification efficiencies for Plasmodium vivax detection. The authors recommend that LAMP can be considered as a rapid nucleic acid amplification assay for the molecular diagnosis of P. vivax in both clinical laboratories and malaria clinics in areas where vivax malaria is endemic.     

用多重PCR技术检测小管福寿螺体内广州管圆线虫幼虫

目的建立一种多重PCR方法检测小管福寿螺体内的广州管圆线虫幼虫。方法根据广州管圆线虫核糖体小亚基rDNA基因序列(GenBank登录号为AY295804)设计特异性引物,并与小管福寿螺16srDNA的特异性引物组合,建立多重PCR检测方法。分别以阳性和阴性小管福寿螺DNA为模板进行多重PCR扩增,电泳鉴定并测序。用阴性小管福寿螺DNA倍比稀释200条广州管圆线虫Ⅲ期幼虫DNA模板,使之浓度分别为1200ng/μl、120ng/μl、12ng/μl、1200pg/μl、120pg/μl和12pg/μl,检测该方法的敏感性。野外采集小管福寿螺172只,肺检法检测后,进行多重PCR扩增,计算敏感性和特异性。结果电泳和测序结果证实该多重PCR检测方法能有效扩增出目的片段,小管福寿螺和广州管圆线虫的目的片段分别为550和405bp。该方法可检测出广州管圆线虫Ⅲ期幼虫DNA的最小浓度为120pg/μl。肺检法和多重PCR法检测均为阳性结果的45只,两法均为阴性的100只。肺检法为阴性、多重PCR法为阳性的24只,肺检法为阳性而多重PCR法检测为阴性的3只。多重PCR的敏感性和特异性分别为93.8%(45/48)和80.6%(100/124)。多重PCR法的阳性检出率为40.1%(69/172),肺检法阳性检出率为27.9%(48/172),差异具有统计学意义(χ2=14.8,P0.01)。结论建立了检测小管福寿螺体内广州管圆线虫的多重PCR方法。     

双重免疫色谱技术检测恶性疟和间日疟的初步观察

用双重免疫色谱技术 ( ICT)对疟区门诊的“四热”病人进行疟疾检测 ,以镜检结果为对照 ,评价 ICT诊断疟疾的效果。检测 93例 ,敏感度和特异性恶性疟为 91.7%和 94.7% ,间日疟为 88.2 %和 10 0 % ,两者之间无交叉反应。显示双重 ICT检测疟疾快速简便 ,准确性高 ,且能区分虫种 ,具有广阔的应用前景     

2010-2016年溧阳市消除疟疾监测效果评价

目的 评价溧阳市消除疟疾监测效果,为制定消除疟疾防控策略和措施提供依据。方法 收集2010-2016年溧阳市疟疾疫情、发热病人血检和疟疾病例个案流行病学调查表等监测资料,采用描述性流行病学方法进行分析。结果 2010-2016年共报告疟疾病例67例,血检发热病人39 196 人次,镜检检出阳性65例,阳性率为0.17%。另有2例镜检阴性病例为出现发热症状后自行服用抗疟药,镜检未查见疟原虫,但疟疾快速诊断试剂盒（RDTs）检测显示阳性。67例疟疾病例中,恶性疟49例、卵形疟13例、间日疟5例。67例病例均为境外输入性疟疾病例,来自非洲的病例占94.03%（63/67）。67例病例中,男性占97.01%（65/67）,30 ~ 49岁占73.13%（49/67）,农民占病例数的80.60%（54/67）。全市10个镇均有病例分布,发病时间无明显季节特征。病例报告及时率、血片复核及时率、规范治疗率、流行病学个案调查率、疫点调查与处置率均达100%。主动病例侦查18 076人,未查见疟原虫阳性携带者。采用诱蚊灯法和人饵半通宵诱捕法进行蚊媒监测,分别捕获按蚊187只和78只,均为中华按蚊。2012-2016年溧阳市疾病预防控制中心门诊采用镜检与RDTs检测,共检测88人次,镜检查出疟原虫阳性35人次,其中恶性疟28人次、卵形疟7人次,恶性疟和卵形疟镜检阳性率差异无统计学意义（校正[χ2] = 0.05,P > 0.05）;RDTs检测阳性为34例,其中恶性疟14例,恶性疟或混合感染其他3种疟疾17例,恶性疟以外3种疟疾单一或混合感染3例,RDTs检测阳性率差异有统计学意义（校正[χ2] = 13.75,P < 0.05）。结论 溧阳市境外输入性疟疾病例仍有再传播风险,今后还需加强疟疾监测工作,强化传染源管理,巩固消除疟疾成果。     

2008年全国疟疾形势

本文根据2008年全国有疟疾发病的 22 个省（市、区）专业单位上报的年度疟疾防治工作总结和有关疫情报表（年报系统）汇总整理,除特别注明“网络直报”外,所有疫情数据均来自年报系统。2008年全国疟疾报告疫情在2007年基础上继续下降,22个省（市、区）858个县有疟疾病例报告,病例总数为26 873例,较上年（50 148例）下降46.4%。云南、安徽、海南、广西、辽宁、湖北、上海、四川、浙江、江苏、河南、重庆、广东、江西和山东等15省（市、区）疟疾发病均有不同程度的下降,其中云南和安徽两省降幅达50%以上;海南、广西、辽宁等3省（区）降幅达40%以上。甘肃、福建、山西、贵州、湖南、西藏、陕西等7省（区）疟疾发病有所上升,其中甘肃省升幅达116.7%;福建省升幅达86.4%。云南、安徽、浙江和湖北等4省的10县24乡（镇）93村,约3.3万人口范围内发生疟疾局部暴发,暴发病例（266例）占发病总数的1.0%。     

不同梅毒血清学检测方法的临床价值

目的:评价常用的4种梅毒血清学试验检测方法在临床诊断中的价值。方法:分别用快速血浆反应素试验(RPR)、胶体金免疫层析法(GICA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和微粒子化学发光法(CMIA)对264例标本进行梅毒血清学试验检测,同时与明胶颗粒凝集法(TPPA)的检测结果进行比较,得出不同检测方法的敏感度和特异性。结果:RPR、GICA、ELISA、CMIA的敏感度分别为67.5%、92.1%、96.0%和98.4%,特异性分别为89.1%、100%、100%和100%。结论:RPR可结合其他方法对梅毒进行联合诊断和对已诊断的患者进行疗效观察;GICA适合快速初筛,检测结果需结合其他方法进一步确认;ELISA和CMIA均可替代TPPA法作为临床诊断试验选用。     

应用聚合酶链反应在海南检测间日疟原虫的效果

目的： 建立适合疟疾流行区现场应用的ＰＣＲ 检测间日疟的方法, 并在现场与常规涂片镜检法进行比较。方法： 通过改良血样的采集及模板处理, 设计引物及优化反应条件等, 建立简便、敏感与特异的ＰＣＲ检测间日疟原虫的方法, 并在海南省疟疾流行区对３１０ 例间日疟患者与镜检法进行比较。结果： ＰＣＲ 检测间日疟原虫具有特异性, 其敏感性为１０ 个原虫／μｌ。ＰＣＲ检测和镜检法的阳性率分别为３４．２％ 和３１．９％ , 与ＰＣＲ比较, 镜检法有５ 例误诊或漏诊。结论： 此ＰＣＲ 法可用于现场检测间日疟患者。