c-myc反义寡核苷酸对结肠癌HT-29细胞增殖、凋亡及化疗敏感性的影响

目的:研究体外c-myc反义寡核苷酸(ASODN)对人结肠癌HT-29细胞增殖、凋亡及化疗敏感性的影响.方法:利用脂质体LipofectamineTM2000介导将c-myc ASODN转染入大肠癌HT-29细胞中, 逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)、Westernblot方法检测c-myc基因mRNA及蛋白的表达,MTT、流式细胞仪(FCM)检测c-myc ASODN对人结肠癌HT-29细胞增殖抑制及其对奥沙利铂敏感性影响.结果:转染c-myc ASODN后, HT-29细胞内c-myc mRNA水平显著降低(0.464±0.029 vs0.974±0.027, 0.945±0.012, 均P<0.01). 在HT-29细胞中存在分子质量62 kDa的特异性条带, 与c-myc分子质量相符, ASODN组在PVDF膜上的特异性条带明显弱于对照组; MTT结果显示转染c-myc ASODN 48 h后的HT-29细胞的增殖速度较对照组细胞明显减慢. FCM显示c-myc ASODN转染后72 h后, 奥沙利铂+ c-myc ASODN组细胞凋亡率显著高于对照组( P<0.05).结论:体外c-myc ASODN可抑制c-myc mRNA及蛋白的表达, 阻断c-myc可抑制HT-29细胞增殖并增强其对奥沙利铂的敏感性, 可能为大肠癌的基因治疗提供新的靶点.     

局部应用c-myc反义寡核苷酸对血管成形术后内膜增殖的影响

目的探讨局部转运cmyc反义寡核苷酸对兔腹主动脉粥样硬化狭窄球囊成形术后内膜增殖的影响。方法75只日本纯系雄性大耳白兔采用高胆固醇饮食加血管内皮剥脱的方法建立腹主动脉粥样硬化狭窄模型(狭窄>50%),并随机分为4组:反义治疗组(Ⅰ组)、正义治疗组(Ⅱ组)、生理盐水对照组(Ⅲ组)及单纯扩张组(Ⅳ)组。分别对各组狭窄段血管进行球囊扩张并进行血管内局部药物转运,分别于局部药物转运后24h及4周时取局部药物转运段血管,进行反转录PCR(RTPCR)半定量分析、cmyc蛋白免疫组化分析及组织形态学观察。结果局部药物转运后24h,Ⅰ组cmycmRNA水平明显低于Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组,局部药物转运后4周时,Ⅰ组新生内膜面积(NIA)、中膜面积(MA)及二者比值(NIA/MA)均明显小于Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组。结论经微孔球囊导管血管内局部应用cmyc反义寡核苷酸可抑制实验性兔腹主动脉粥样硬化狭窄球囊成形术后内膜增殖。     

反义c-myc寡核苷酸对转染FHIT基因胃癌细胞MKN28的影响

目的: 探讨脂质体介导的c-myc反义寡核苷酸对导入脆性组氨酸三联体(FHIT)基因的胃癌细胞增殖及凋亡的影响.方法: 通过脂质体将重组FHIT基因PRC/CMV质粒和空载体转染到人类胃癌细胞系MKN28,并分别转染c-myc反义寡核苷酸,RT-PCR和Westen b1ot法检测FHIT基因的转染,Westem b1ot法检测细胞c-mHyc的表达,MTT法分析细胞增殖,AO/EB染色法和流式细胞分析技术检测细胞凋亡.结果: 转染FHIT基因后,MKN28细胞检测到FHIT基因片段和FHIT蛋白,而未转染的细胞及转染空载体的细胞未检测到FHIT基因片段及FHIT蛋白.转染c-myc反义寡核苷酸后.对MKN28细胞c.myc的表达有明显的抑制作用,并呈明显的时间依赖性;c-myc asODN对FHIT MKN28细胞抑制率(F=177.480,P<0.05),凋亡率(F=41.500,P<0.05)和凋亡比例明显高于FHIT MKN28细胞.结论: 癌基因c-myc的表达抑制联合FHIT基因的表达可以发挥较强的抗肿瘤细胞作用,为多基因治疗肿瘤提供了理论基础.     

BCL-2反义寡核苷酸对膀胱癌EJ细胞的影响

目的探讨BCL-2反义寡核苷酸对膀胱癌EJ细胞致瘤能力和对荷瘤裸鼠肿瘤的影响。方法以膀胱癌EJ细胞中加入BCL-2PS-ASO、BCL-2PS-SO、培养液共同孵育作为实验组、阴性对照组和空白对照组,处理72 h的三组细胞做集落形成及裸鼠移植瘤形成实验;向荷瘤裸鼠的肿瘤内注射上述三组药物,观察肿瘤生长情况。结果体外实验显示,上述三组克隆数分别为8.5±1.5、22±2.2、20±2.1,肿瘤重量(g)分别为1.3±0.3、3.3±0.4、3.0±0.2 g,实验组明显低于其他两组(P<0.05);体内实验显示,实验组、阴性对照组肿瘤抑制率分别为(47.6±5.41)%、(3.03±0.23)%,实验组明显高于阴性对照组(P<0.05)。结论BCL-2PS-ASO能降低膀胱癌EJ细胞致瘤能力,对荷瘤裸鼠的肿瘤有抑制作用。     

端粒酶hTR反义寡核苷酸对K562细胞端粒酶活性的影响

目的：探讨端粒酶RNA反义寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)对人白血病K562细胞端粒酶活性及细胞生长的影响。方法：应用与人端粒酶RNA组分模板区互补的硫代ASODN处理K562细胞，用端粒酶重复扩增分析（telomere repeat amplification protocol,TRAP)-PCR-ELISA检测法观察端粒酶活性的变化；用Annexin V分析法及流式细胞术检测凋亡细胞。结果：经ASODN作用后，细胞端粒酶活性明显受到抑制，并与ASODN的浓度和处理时间相关。作用5d后，凋亡细胞明显增加。结论：端粒酶RNA模板区ASODN可明显抑制白血病K562细胞端粒酶活性，抑制细胞生长和增殖，诱导细胞凋亡，可能成为白血病基因治疗新靶点。     

反义寡核苷酸抑制β-catenin表达及细胞生长的研究

反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)可以选择性和特异性地阻断目的基因的表达,是基因治疗的重要组成部分。随着ASODN硫代磷酸化修饰技术的出现,ASODN在透膜性和抗核酸酶降解方面都有很大提高,一些ASODN药物已进入了临床试验。ASODN技术目前主要应用于抗病毒和抗肿瘤的研究。     

反义寡核苷酸转染对SGC-7901胃癌细胞端粒酶活性及细胞凋亡的影响

目的：探讨端粒酶反义寡核脱氧核苷酸（PS－ASODN）对SGC－7901胃癌细胞端粒酶活性及细胞凋亡的影响。方法：脂质体介导的PS－ASODN作用于SGC－7901细胞后，台盼蓝拒染法计算细胞生长抑制剂，采用半定量TRAP－银染法检测端粒酶活性，用流式细胞仪观察细胞凋亡率及细胞周期变化，采用光镜及电镜观察细胞凋亡形态。结果：终浓度为3、2及1μM的PS－ASODN对SGC－7901细胞均有抑制作用，抑制率与对照组比较，差异有显著性（P＜0．01）；PS－ASODN转染后48h，端粒酶活性明显降低（P＜0．05）。以上抑制作用呈剂量依赖性及序列特异性。流式细胞仪检测到凋亡峰，细胞受阻于G0/G1期；光镜及电镜显示典型的细胞凋亡形态改变。对照寡核苷元上述作用。结论：以端粒酶RNA模板区为靶点的反义寡核苷不但明显抑制胃癌细胞的增殖，降低端粒酶活性，而且具有促凋亡作用，对胃癌具有重要治疗价值。     

反义寡核苷酸治疗淋巴瘤的研究

随着对淋巴瘤细胞遗传学和分子生物学的深入研究 ,人们对其发病机制有了深入的了解。近年来 ,人们对淋巴瘤的基因治疗产生了浓厚的兴趣 ,并取得了一定进展。反义寡核苷酸 (ＡＯ)是与表达基因互补的 ,短小的 (通常是 13～ 2 0对碱基 )单链ＤＮＡ或ＲＮＡ。ＡＯ被合成后 ,通常需加以修饰 ,以防止其被酶降解。ＡＯ的作用是抑制特定癌基因的表达 ,继而抑制其蛋白产物的产生。众所周知 ,淋巴瘤最常见的染色体重排是ｔ(8;14 ) ,ｔ(14 ;18)等[1] 。ｔ(8;14 )累及癌基因ｃ ｍｙｃ[2 ] ,ｔ(14 ;18)累及癌基因ｂｃｌ 2 [3 ] 。目前研究ＡＯ治疗淋巴瘤…     

RelA反义寡核苷酸调节胰腺癌细胞对阿霉素敏感性的效果及机制

目的探讨转染核因子-κBp65(RelA)反义寡核苷酸(RelA AsODN)调节胰腺癌细胞对阿霉素敏感性的效果及机制。方法采用RelA反义寡核苷酸和对照序列转染胰腺癌细胞株Capan-2。MTT法检测细胞活力;流式细胞仪检测细胞凋亡率;RT-PCR法检测RelA AsODN作用后凋亡相关基因bcl-xL表达变化。结果 10μg/mL阿霉素单独及其与RelA AsODN联合作用24 h后的细胞存活率分别为60.9%和43.8%,凋亡率分别为6.77%和17.46%,P均<0.01。RelA AsODN作用后bcl-xL mRNA表达下降。结论 RelA AsODN可增加胰腺癌细胞Capan-2对阿霉素的敏感性,下调bcl-xL mRNA表达可能是其作用机制之一。     

川芎嗪对人骨肉瘤MG-63细胞生长的抑制作用观察及机制探讨

目的 探讨川芎嗪对人骨肉瘤MG-63细胞生长的抑制作用及可能机制.方法 取对数生长期的人骨肉瘤MG-63细胞,随机分为川芎嗪低浓度组、高浓度组和对照组,川芎嗪低浓度组、高浓度组分别予3、30 mg/mL的川芎嗪,对照组加入完全培养液;48 h后采用四氮唑盐比色法检测MG-63细胞增殖抑制率;流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞周期分布;Westemblot法检测Bcl-2、CyclinD1及NF-κB p65蛋白表达水平.结果 与对照组比较,川芎嗪低浓度组、高浓度组MG-63细胞增殖抑制率、凋亡率及G0/G1期细胞比例均明显升高,NF-κB p65及其靶基因Bcl-2、CyclinD1蛋白表达水平均明显降低,且川芎嗪高浓度组作用更明显;P均＜0.05.结论 川芎嗪对体外培养的MG-63细胞有增殖抑制作用,其机制可能与其促进MG-63细胞凋亡、诱导G0/G1期阻滞、抑制NF-κB及其靶基因的蛋白表达有关.     

放射性PDGFR-β反义寡核苷酸对血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响

目的研究32P标记血小板衍化生长因子β受体（PDGFR-β）的反义寡核苷酸（AON）对血管平滑肌细胞（VSMC）增殖的影响,为抑制血管术后再狭窄的形成提供可能的干预。方法体外进行大鼠VSMC的培养,以510代细胞为实验对象,人工合成PDGFR-βAON,并进行32P标记,按实验目的分组。MTT法分析细胞增殖活力,以流式细胞仪测定细胞周期,用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法（TUNEL）检测细胞凋亡。结果32P标记PDGFR-βAON作用后,VSMC的增殖强度明显弱于空白对照组（P<0.01）,而处于DNA合成前期（G0/G1）细胞百分比高于空白对照组（P<0.01）;32P标记AON组细胞凋亡率明显高于空白组（P<0.01）。结论32P-PDGFR-βAON可以诱导VSMC凋亡,抑制其增殖。     

Survvin反义寡核苷酸诱导人胃癌细胞凋亡的作用

目的探讨生存素（Survivin）反义寡核苷酸（ASODN）诱导人胃癌细胞SGC7901凋亡的作用。方法设计合成特异性靶向Survivin的ASODN,将胃癌细胞株分为空白对照组（Sham组）、脂质体转染对照组（Lip组）、正义链转染对照组（Lip-SODN组）和ASODN转染组（Lip-ASODN组）。作用48h后,Westemblot法检测各组Survivin表达情况,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,免疫组化SP法检测细胞中PCNA表达情况。结果脂质体介导Survivin ASODN转染后的胃癌细胞Survivin蛋白表达明显下降;ASODN转染组细胞凋亡率明显高于各对照组（P均〈0．05）,各对照组间无统计学差异（P〉0．05）。ASODN转染后胃癌细胞中PCNA表达水平明显降低。结论 Survivin ASODN转染胃癌细胞能下调Survivin蛋白表达,诱导胃癌细胞凋亡,抑制细胞增殖,具有明显的抗癌作用。     

PDGFR-β反义寡核苷酸对大鼠血管平滑肌细胞凋亡的影响

目的 :探讨血小板衍化生长因子 β受体 （PDGFR- β）反义寡核苷酸对培养的大鼠血管平滑肌细胞 （VSMC）凋亡的影响。方法 :建立 SD大鼠胸主动脉 VSMC体外增殖模型 ,取 5～ 10代细胞为实验对象 ,按实验目的分为以下几组 :1反义寡核苷酸组 ;2正义寡核苷酸组 ;3错义寡核苷酸 ;4空白对照组。利用透射电镜等观察 VSMC加药前后形态学和超微结构的变化 ,采用原位末端脱氧核苷酸转移酶介导的 d U TP缺口末端标记法 （TU NEL）和流式细胞仪观察和分析 PDGFR- β反义寡核苷酸对 VSMC凋亡的影响。结果 :1加药后 2 4h细胞形态和超微结构较加药前无明显改变 ,48h细胞形态和超微结构较加药前有明显改变。2加药后 2 4h TU NEL 染色各组未发现凋亡细胞 ,48h后反义寡核苷酸组细胞爬片染色有较多凋亡阳性细胞出现。 3加药 2 4h流式细胞仪检测未发现加药组细胞凋亡量与对照组之间有显著差异 ,48h加药组细胞凋亡量明显高于对照组。结论 :PDGFR- β反义寡核苷酸对大鼠VSMC凋亡有诱导作用。     

雷公藤内酯醇、顺铂对骨肉瘤细胞体外增殖的影响

目的 研究中药制剂雷公藤内酯醇（TP）和顺铂（PDD）对骨肉瘤（MG63）细胞增殖的抑制作用,寻求骨肉瘤的中西医结合治疗方案。方法 将TP与PDD单独及联合于MG63细胞．采用MTT法检测细胞抑制率。结果 TP在1～125μg／ml的范围内对MG63细胞生长有明显抑制作用;PDD在1～20μg／ml的范围内对MG63细胞生长有明显的抑制作用;TP1～15μg／ml和PDD1μg／ml联合对MG63细胞生长有明显抑制作用;与对照组比较。P均〈0．01;TP10～15μg／ml和PDD1μg／ml联合细胞抑制率明显高于单用;二者单独及联合对细胞抑制率的影响均有明显时间依赖性。结论TP与PDD单独及联合均可抑制骨肉瘤细胞的增殖。     

表皮生长因子受体反义寡聚核苷酸抑制人结肠癌细胞的增殖

目的:建立稳定表达反义表皮生长因子受体(EGFR)的人结肠癌细胞系,研究细胞的生物学行为.方法:应用脂质体介导法将重组克隆携带反义EGFR的逆转录病毒载体转染人结肠癌细胞系LST174,利用细胞计数、生长曲线、MTT法及软琼脂集落形成率测定细胞生长、增殖及恶性表型的转化.结果:转染稳定后的细胞易脱落,细胞膜毛糙,细胞生长呈小片状,不密集.细胞继续培养后,LST174/AS-EGFR组细胞生长受到抑制,生长曲线较LST174组速度减慢,差别显著(A值:0.322±0.014vs0.422±0.033,P<0.05);细胞生长抑制率为23.7%,LST174/AS-EGFR组细胞几乎失去了集落形成能力,且少、松散,而对照组呈叠落堆积生长.结论:反义EGFR对内源性EGFR自分泌因子表达的阻断可抑制结肠癌细胞的生长、增殖及恶性表型的转化.     

Flavopiridol在人骨肉瘤多药耐药MNNG／ADM细胞凋亡中的作用及机制

目的探讨细胞周期蛋白酶抑制剂Flavopiridol对耐阿霉素（ADM）骨肉瘤细胞（MNNG／ADM）增殖抑制及凋亡诱导的作用机制。方法采用MTT法测定ADM及Falvopiridol对骨肉瘤MNNG及MNNG／ADM细胞的半数抑制浓度（IC砷）,计算其耐药倍数;用流式细胞计数仪（FCM）检测给药后MNNG／ADM周期变化;Western-blotting方法检测细胞中Bcl-2、pro—caspase-3、活化型多聚ADP核糖多聚酶（PARP一85）蛋白水平。结果MNNG及MNNG／ADM细胞增殖明显受抑,凋亡增加,二者的IC50浓度相近;细胞PARP．85（PARP活性型）的表达明显上调,pro—caspase-3及Bcl-2表达下调,其效应具有剂量相关性。结论Flavopiridol可有效诱导MNNG／ADM细胞凋亡,其机制可能与线粒体信号传导途径有关。     

亚砷酸和顺铂对骨肉瘤MG-63细胞生长的抑制作用比较

目的 观察亚砷酸和顺铂对骨肉瘤MG-63细胞生长的抑制作用.方法 采用细胞培养的方法,体外培养人骨肉瘤株MG-63细胞.应用倒置相差显微镜、透射电镜、四氮唑盐(MTT)比色、流式细胞仪检测等方法,观察亚砷酸和顺铂[各加入100μl(1 g/L)]对骨肉瘤MG-63细胞生长的抑制作用和对细胞凋亡、细胞周期的影响.结果 相差显微镜下,对照组MG-63细胞贴壁生长良好,细胞核呈圆形,细胞呈上皮样细胞排列;亚砷酸组MG-63细胞排列无规则,有细胞死亡;顺铂组MG-63细胞多变小,变圆,胞质的空泡化明显.电镜下,对照组MG-63细胞表面可见球形质膜突起,线粒体嵴粗大,双层核膜结构清晰;亚砷酸组MG-63细胞表面的球形突起消失,线粒体嵴变细,细胞核缩小,凋亡细胞核膜清晰;顺铂组MG-63细胞表面球形突起脱离,细胞核膜增厚,核内染色质形成细纱状.亚砷酸和顺铂均能抑制MG-63细胞生长,抑制率(%)组间比较差异有统计学意义(F=78.859,P<0.05);在2、4、8、16、32、64、128 h,亚砷酸(56.31±0.03、70.00±0.06、79.84±0.03、87.31±0.13、84.70±0.09、90.68±0.06、91.18±0.05)和顺铂(7.55±0.15、15.70±0.17、30.72±0.07、49.80±0.05、45.11±0.13、61.62±0.08、93.80±0.12)对细胞生长的抑制率与对照组(2.03±0.07、2.78±0.08、3.11±0.01、5.67±0.04、12.23±0.04、18.65±0.04、24.45±0.04)比较明显升高(P均<0.05);但与顺铂比较,亚砷酸起效快,在2～32 h抑制率明显高于同时间顺铂(P均<0.05).亚砷酸和顺铂均可导致MG-63细胞凋亡,凋亡率组间比较差异有统计学意义(F=13.317,P<0.05);亚砷酸在24、36、48 h(20.5±3.78、45.76±9.90、25.16±15.41),顺铂在24、36、48 h(12.55±1.51、18.85±3.40、12.37±5.43),MG-63细胞凋亡率(%)明显高于同时间对照组(6.57±1.48、8.03±2.08、6.54±1.30,P<0.05或<0.01).亚砷酸和顺铂均对MG-63细胞周期G1、S、G2/M期有抑制作用,抑制率组间比较差异有统计学意义(F值分别为54.579、43.429、21.795,P<0.05或<0.01);对G1期抑制率(%)亚砷酸(78.26±5.24)和顺铂(80.48±2.81)与对照组(57.49±6.65)比较明显升高(P<0.05或<0.01).结论 亚砷酸和顺铂都可抑制骨肉瘤MG-63细胞生长,诱导细胞凋亡;亚砷酸作用快于顺铂,亚砷酸和顺铂对MG-63细胞的抑制作用发生在细胞周期中的G1期.     

Growth inhibition of leukaemic cells carrying the t(3;21) by the AML1/EVI-1 -specific antisense oligonucleotide

Summary. The t(3;21)(q26;q22) translocation is thought to play an important role in the acute phase transformation of CML. The formation of the AML1/EVI-1 fusion gene by the translocation leads to expression of the AML1/EVI-1 fusion protein. Here we demonstrate that the AML1/EVI-1 -specific antisense oligonucleotide markedly decreases the [H]thymidine incorporation and growth of leukaemic cells carrying the t(3;21) and the t(9;22), but not those of K562 cells. These results indicate that the AML1/EVI-1 fusion protein could contribute to proliferation of the t(3;21)-carrying leukaemic cells after entering the blastic crisis phase of CML.     

存活素反义寡核苷酸对甲状腺癌细胞生长的抑制作用

目的 探讨利用凋亡抑制基因存活素反义寡核苷酸（ASODN）诱导甲状腺癌细胞凋亡的效应。方法 设计合成特异性靶向存活素的ASODN，以不同浓度和时间对人甲状腺髓样癌细胞进行转染，并设空白、正义（SODN）对照组进行比较。采用RT-PCR、Western印迹、免疫细胞化学技术检测各组细胞中存活素mRNA、蛋白表达水平，DNA裂解分析、吖啶橙／溴化乙锭（AO／EB）染色法、流式细胞仪检测细胞凋亡水平和形态变化，MTT法检测细胞生长抑制情况。结果 转染ASODN各组细胞存活素mRNA和蛋白表达均较空白对照组、SODN组明显减弱；细胞凋亡率显著增加，细胞生长相应受抑，上述效应在ASODN转染24h最为明显，并呈浓度依赖性；而各时段SODN组与空白对照组间各项指标差异均无统计学意义。结论 ASODN能够特异性地下调甲状腺癌细胞中存活素基因表达，进而诱导肿瘤细胞凋亡，并抑制其增殖。