微小RNA-219a-5p通过靶向卷曲蛋白4抑制激素性股骨头坏死中骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化

目的观察微小RNA(microRNA,miR)-219a-5p在骨髓间充质干细胞(BMSC)中的表达及其对细胞增殖和成骨分化的影响。方法选取在2019年1月至2020年1月期间于河南省人民医院骨科接受髋关节置换的16例激素性股骨头坏死患者及9例股骨颈骨折不愈合患者分别作为实验组及对照组,提取股骨近端BMSC,利用实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测miR-219a-5p和卷曲蛋白4(FZD4)在细胞中的表达水平。荧光素酶活性检测验证miR-219a-5p和FZD4的相互作用关系。利用细胞转染技术和miR-219a-5p的模拟物、抑制剂、FZD4发卡RNA(shRNA)来调控BMSC中miR-219a-5p和FZD4的表达水平。细胞计数试剂盒(CCK-8)增殖实验检测BMSC的增殖活性,茜素红染色评估BMSC的成骨分化能力。利用统计与制图软件(GraphPad Prism)统计分析实验数据。采用方差分析(ANOVA)和t检验确定计量资料各组间差异的统计学意义,计数资料的组间比较采用方差检验。结果miR-219a-5p在实验组BMSC中的相对表达量为6.03±1.39,而在对照细胞中的相对表达水平仅有1.01±0.21,两组之间差异有统计学意义(t=10.351,P<0.01)。利用数据库TargetScan预测得到miR-219a-5p的下游靶基因FZD4,RT-qPCR结果提示FZD4在实验组细胞中的表达水平为1.09±0.55,在对照组细胞中相对表达量达到4.61±1.08,两组之间差异有统计学意义(t=10.376,P<0.01)。皮尔森(Pearson)线性分析显示miR-219a-5p和FZD4在BMSC中表达水平呈负相关[r=-0.631,95%可信区间(CI):-0.763、-0.498,P<0.01]。下调实验组中miR-219a-5p的表达后,FZD4的水平升高4.34倍(t=8.426,P<0.01),而在对照组细胞中上调miR-219a-5p的表达后,FZD4的表达水平下降4.75倍,差异均有统计学意义(t=8.667,P<0.01)。荧光素酶活性检测证实了miR-219a-5p与FZD4之间的结合关系。CCK-8实验结果显示实验组BMSC培养24、48、72 h后的吸光度值分别为0.27±0.05、0.48±0.05、0.63±0.04显著低于对照组的BMSC的0.46±0.05、0.96±0.08、1.51±0.11,两组之间差异具有统计学意义(t=9.776,P<0.01)。抑制实验组中miR-219a-5p表达后细胞的增殖活性明显提高,而同时敲低FZD4的表达则会逆转上述作用。同样地,将miR-219a-5p模拟物转染对照组细胞,细胞增殖活性明显抑制。茜素红染色显示对照组细胞的阳性染色面积/总面积为0.58±0.05,明显高于实验组的0.22±0.04,差异有统计学意义(t=7.610,P<0.01)。在实验组细胞中转染miR-219a-5p抑制剂可以增强细胞的成骨分化能力,但FZD4 shRNA抵消了miR-219a-5p抑制剂对成骨能力的强化作用,且上调正常BMSC中miR-219a-5p的水平可以阻止其成骨分化过程。结论miR-219a-5p在激素性股骨头坏死BMSC中高表达,FZD4介导了miR-219a-5p对BMSC增殖及成骨分化的抑制作用。     

MicroRNA调控骨髓间充质干细胞成骨分化研究进展

骨质疏松症(osteoporosis,OP)是最常见的骨骼疾病,是一种以骨量低、骨组织微结构损坏,导致骨脆性增加,易发生骨折的全身性骨病[1]。随着人口老龄化,OP已经成为全世界关注的健康问题。有报道称在2006—2007年间全世界有2亿妇女受骨质疏松症影响,每年造成890多万例骨折,每3 s即发生1次骨质疏松性骨折[2]。然而目前对OP的发病机制认识仍然有限。     

Follistatin 表达抑制促进 BMP-2诱导人类骨髓间充质干细胞成骨分化的实验研究

目的探讨Follistatin表达抑制对人类骨髓间充质干细胞（BMSC）细胞活性及骨形态发生蛋白（BMP）‐2诱导人类BMSC成骨分化的影响。方法采用 Follistatin特异性 siRNA 转染人类BMSC ,检测线粒体脱氢酶活性、细胞DNA含量及蛋白含量。采用定量逆转录‐聚合酶链式反应（qRT‐PCR）检测成骨相关基因表达,采用碱性磷酸酶（ALP）染色和茜素红染色检测 Follistatin对BMP‐2诱导人类BMSC成骨分化的影响。结果转染后3、7 d ,人类BMSC代谢、DNA含量显著升高;转染后14 d ,总蛋白含量增加。Follistatin表达抑制后成骨相关基因如ALP、OCN、OSX、OC、OPN、RUNX2等表达升高,且ALP活性及钙沉积量显著增加。结论抑制Follistatin表达可促进人类BMSC细胞活性和BMP‐2诱导人类BMSC成骨分化能力,Follistatin可抑制人类BMSC成骨分化。     

骨质疏松患者外周血差异表达miR-19b调控骨髓间充质干细胞成骨分化的作用机制研究

背景:微小RNA(miRNA)在调节基因表达中起重要作用,与多种代谢疾病有关。当前对循环血miRNA在骨质疏松骨代谢过程中的调控作用尚不明确。目的:筛选外周血中成骨相关miRNA,并探讨其调节成骨的机制。方法:通过RNA测序揭示骨质疏松患者相比于骨量正常受试者外周血中差异表达的miRNA,应用生物信息学方法预测关键miRNA的下游潜在靶点,通过过表达/敲低实验,进一步验证关键miRNA调控骨髓间充质干细胞成骨分化的作用和信号通路。结果:miR-19b在骨质疏松患者中显著下调,且在伴有椎体骨折的骨质疏松患者中尤为显著。进一步生物信息学研究和qPCR实验证实miR-19b可通过抑制PTEN介导AKT/GSK3β通路表达。细胞功能实验发现,过表达miR-19b可使BMSCs成骨分化能力增强,而敲低miR-19b可使BMSCs成骨分化能力减弱。结论:miR-19b可能通过调节PTEN/AKT/GSK3β通路增强BMSCs成骨分化,可能为骨质疏松症的防治提供新的策略。     

LncRNA DANCR调控骨髓间充质干细胞成骨分化在骨质疏松症中的研究进展

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种中老年人易患的骨代谢性疾病，以骨密度减低和骨微结构破坏为特征，可导致骨脆性增加和骨折风险增大。随着OP分子机制研究的深入，针对相关细胞调控通路的治疗靶点被陆续发现，通过这些靶点可研发出新的靶向治疗方案。lncRNA分化拮抗非蛋白编码RNA(differentiation antagonizing non-protein coding RNA，DANCR)能够通过竞争结合、作为转录辅助因子等方式作用于Wnt/β-catenin、MAPK及NF-κB等信号通路调控BMSC成骨分化，影响OP的发生与进展。DANCR具有作为OP临床诊断标志物的潜力，并有希望作为药物干预的靶点参与OP的精准医疗。     

骨髓间充质干细胞成软骨分化研究进展

骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是存在于骨髓基质中的一种多能干细胞，在特定的培养条件下，MSCs可分化成成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞等多种间充质细胞。由于它们可以作为滋养层支持造血干细胞的生长，因此也被称为骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)。本文就骨髓MSCs的分离培养及成软骨分化的研究进展作一综述。     

骨髓间充质干细胞成骨分化的研究与进展

超临界大面积或大段骨缺损仍是临床面临的难题,研究者们致力于研发人工骨材料,但为了解决人工骨材料成骨效应不良的问题,人们越来越关注骨髓间充质干细胞在骨组织工程中的应用。本综述以骨髓间充质干细胞、成骨分化、成骨细胞、临床应用"Bone marrow mesenchymal stem cells,osteogenesis differentiation,osteoblasts cell,clinical application"为检索词,应用计算机搜索CNKI数据库、万方数据库、维普数据库、PUBMED数据库,全面归纳总结骨髓间充质干细胞的分离培养、骨髓间充质干细胞鉴定方法、成骨诱导方法、成骨分化鉴定及其在临床中的应用,为证实其作为种子细胞治疗骨组织疾病提供理论依据。学者们初步研究了骨髓间充质干细胞结合移植、组织工程等技术来治疗骨和软骨缺损、骨关节炎、股骨头坏死等疾病,均取得了较好的临床疗效。但是骨髓间充质干细胞会有一定的优缺点,其临床试验及远期疗效的验证还需进一步深入研究。     

杜仲诱导骨髓间充质干细胞成骨分化防治骨质疏松症相关信号通路研究进展

骨质疏松症（osteoporosis,OP）已成为全世界面临的重大公共卫生健康问题,尤其随着我国人口老龄化进程的加速,对其的防治已刻不容缓。近年来,随着对我国传统中医药的挖掘与探索,多项研究发现补肾中药杜仲对于骨质疏松症的防治效果明显。现代药理学研究表明,杜仲有效成分可以通过调节雌激素水平、骨代谢相关细胞因子及护骨素的表达对成骨细胞、破骨细胞、骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）增殖分化综合作用,有效防治骨质疏松。而BMSCs作为成骨细胞的前体细胞,探索其分化机制对于指导防治骨质疏松症具有重大意义。本文对传统中药杜仲诱导BMSCs向成骨细胞分化的相关信号通路作以综述,以期为OP的诊疗提供新思路。     

人骨髓间充质干细胞的生物学特性及成骨诱导分化的研究

[目的]探讨成人骨髓间充质干细胞分离、纯化、培养及鉴定的方法,观察其成骨分化过程中Runx2基因的动态表达以及生物学特性。[方法]取自人股骨近端骨髓标本,利用联合密度梯度离心和差异贴壁法分离骨髓间充质干细胞,体外扩增和传代培养,流式细胞仪检测细胞表面标记,诱导向成骨细胞分化,并采用RT-PCR和Western blot方法检测Runx2的动态表达。[结果]原代和传代细胞呈纺锤状外观,生长增殖能力良好,骨髓间充质干细胞的生长曲呈成"S"形,细胞表面标记物CD90阳性表达,CD34和CD45阴性表达。经定向诱导分化后,细胞分别呈现成骨细胞的表型特征,随着诱导时间的增加,Runx2的表达也明显增加,与对照组相比有统计学差异(P<0.05)。[结论]该方法能从人骨髓中高效分离和扩增MSCs,生物学性状稳定,具有成骨分化潜能,为骨组织工程提供理想的种子细胞,同时证实Runx2在成骨分化中起到重要的调控作用。     

脂肪间充质干细胞的成骨诱导分化

目的研究脂肪间充质干细胞(MSCs）在特定培养条件下向成骨细胞分化，探讨其作为骨组织工程的种子细胞的可行性。方法取3周龄Lewis大鼠的腹股沟脂肪垫，消化法获得脂肪MSCs，用成骨诱导培养基诱导其向成骨细胞分化，组织化学染色、免疫细胞化学染色和Western blotting检测细胞分化的情况。结果从成体大鼠脂肪组织中培养出脂肪MSCs，能大量稳定增殖传代。在地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠的诱导下，脂肪MSCs的ALP活性增高，Von Kossa染色出现钙结节，OPN、BMP-2免疫细胞化学染色阳性．Western blotting检测到诱导后细胞OPN、BMP-2的表达，且随诱导时间延长表达增强。结论从脂肪组织中可获得具有多分化潜能的MSCs，并能在体外稳定增殖传代，经诱导后可分化为脂肪细胞和成骨细胞，有可能成为骨组织工程较理想的种子细胞之一。     

低频振动对小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化及相关基因表达的影响

目的 观察低频振动对小鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）成骨分化的影响。方法 取3周龄C57BL/6小鼠,分离及培养其BMSCs。将细胞分为两组,对照组及低频振动组,两组均诱导BMSCs进行成骨分化,低频振动组在诱导过程中实施低频振动干预（15 Hz,垂直加速度0.3 g）,对照组不进行干预,分别于第7天、第14天收获细胞,将第7天的细胞进行碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）染色,将第14天的细胞进行茜素红染色;并利用Real-time PCR检测相关基因表达。结果 低频振动组细胞第7天的ALP活性明显高于对照组,且在14 d形成的钙结节多于对照组;所检测基因中,低频振动组细胞Ⅰ型胶原蛋白、骨桥蛋白、骨钙素、骨保护素基因的表达均高于对照组,而破骨细胞分化因子（receptor activator of NF-κB ligand, RANKL）较对照组低。结论 低频振动可以促进BMSCs的成骨分化,并调节成骨细胞分泌的细胞因子,影响破骨细胞的生成。     

体外诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的实验研究

目的：探讨HGF和EGF对骨髓间充质干细胞向肝细胞方向的诱导分化作用，探索出合适的诱导条件，为肝细胞移植、生物人工肝、组织工程构建等提供基础。方法：骨髓来自杂种犬的髂骨，采用全血贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞，流式细胞仪检测细胞CD标记；用含HGF和EGF的α—MEM培养液进行诱导培养，并于诱导后7、14、21d留取细胞；用免疫组化检测AFP、CK18，免疫荧光检测ALB，PAS反应检测糖原；流式细胞仪检测细胞分化率。结果：分离的骨髓间充质干细胞表面CD13、CD34和CD45皆为阴性，CD29为阳性。诱导至7d出现AFP表达．14d表达增高，21d时表达下降。CK18、ALB和糖原14d时出现表达，并随时间延长表达逐渐增加：21d时ALB表达阳性率可达50％以上。结论：HGF和EGF有诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的作用。     

兔骨髓间充质干细胞的分离、扩增及诱导分化

目的探讨兔骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs)体外培养、定向诱导分化为成骨细胞和成脂肪细胞的途径,为进一步的实验研究打下基础。方法抽取兔股骨骨髓,以全骨髓贴壁培养法进行体外培养,贴壁细胞传代,倒置显微镜下观察细胞形态。取第3代细胞向成骨细胞和成脂肪细胞诱导,14d后成骨细胞诱导组检测碱性磷酸酶,成脂肪细胞诱导组进行油红O染色。结果全骨髓贴壁培养法可获得BM-MSCs,原代和传代培养的BM-MSCs具有活跃的增殖能力。成骨细胞诱导组碱性磷酸酶检测表达阳性,成脂肪细胞诱导组油红O染色见胞浆内出现大量红染脂滴。结论全骨髓贴壁培养法可有效地分离和扩增BM-MSCs,分离培养的BM-MSCs生长稳定,增殖力强,可向成骨细胞和成脂肪细胞诱导分化。     

羟基红花黄色素A对激素诱导骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的：观察羟基红花黄色素A（HSYA）对激素诱导兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）内成骨标志物碱性磷酸酶、Cbfαl及Ⅰ型胶原表达的影响,探讨其防治激素性股骨头缺血性坏死的作用机制。方法：健康成年新西兰大白兔15只,体重0.9～1.3 kg,腹腔注射麻醉后,无菌条件下作胫骨和髂前上棘骨髓腔穿刺抽取骨髓血,分离出BMSCs,体外培养并传代,取第3代生长状态良好的BMSCs随机分为空白组,模型组及羟基红花黄色素A低、中、高剂量组。模型组用大剂量地塞米松诱导BMSCs成脂分化,抑制其成骨分化;羟基红花黄色素A低、中、高剂量组加入地塞米松作用的同时给予羟基红花黄色素A干预;空白组无特殊处理。1周后检测各组细胞内成骨标志物碱性磷酸酶活性、Cbfαl及Ⅰ型胶原 mRNA的表达。结果：模型组兔BMSCs内碱性磷酸酶活性较空白组明显下降（P<0.01）,Cbfαl及Ⅰ型胶原 mRNA的表达也明显降低（P<0.01）,而HSYA各组较模型组均有明显升高（P<0.05或P<0.01）.结论：羟基红花黄色素A治疗激素性股骨头缺血坏死的机制可能与对抗激素诱导下的BMSCs成骨分化减少有关。     

诱导hBMSCs成骨分化中微小RNA和靶基因表达水平的变化

目的明确萎缩性骨不连组织中表达上调的数种微小RNA(micro RNA,miRNA)与其相应靶基因mRNA、蛋白在hBMSCs成骨分化过程中的表达变化趋势和生物学功能。方法取自体髂骨植骨手术患者的髂骨骨髓血,采用密度梯度离心法分离培养hBMSCs。取第4代hBMSCs以成骨诱导培养液诱导成骨分化,分别提取0、12 h,1、2、4、7、14 d时的细胞总RNA和蛋白,进行miRNA的实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)、相应靶基因mRNA的qRT-PCR和蛋白Western blot检测。结果诱导hBMSCs成骨分化时,成骨性靶基因碱性磷酸酶(alkalinephosphatase liver/bone/kidney,ALPL)、PDGF-α多肽(PDGF-αpolypeptide,PDGF-A)和BMP-2的mRNA和蛋白表达在多数时间点同对照(0 h)相比增加(BMP-2在12 h和1 d时下降),1～7 d变化最为显著。不同时间点的miRNA、靶基因mRNA和蛋白表达水平存在差异,其中hsa-miRNA-149*和hsa-miRNA-654-5p miRNA含量的变化趋势与各自靶基因ALPL和BMP-2的mRNA及蛋白表达水平总体上成负相关(P<0.05),hsa-miRNA-221与其靶基因PDGF-A的变化趋势无明显负相关关系(P>0.05)。结论诱导hBMSCs成骨分化过程中,hsa-miRNA-149*和hsa-miRNA-654-5p对其相应靶基因ALPL和BMP-2的mRNA及蛋白存在密切调控关系。