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目的观察微小RNA(microRNA,miR)-219a-5p在骨髓间充质干细胞(BMSC)中的表达及其对细胞增殖和成骨分化的影响。方法选取在2019年1月至2020年1月期间于河南省人民医院骨科接受髋关节置换的16例激素性股骨头坏死患者及9例股骨颈骨折不愈合患者分别作为实验组及对照组,提取股骨近端BMSC,利用实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测miR-219a-5p和卷曲蛋白4(FZD4)在细胞中的表达水平。荧光素酶活性检测验证miR-219a-5p和FZD4的相互作用关系。利用细胞转染技术和miR-219a-5p的模拟物、抑制剂、FZD4发卡RNA(shRNA)来调控BMSC中miR-219a-5p和FZD4的表达水平。细胞计数试剂盒(CCK-8)增殖实验检测BMSC的增殖活性,茜素红染色评估BMSC的成骨分化能力。利用统计与制图软件(GraphPad Prism)统计分析实验数据。采用方差分析(ANOVA)和t检验确定计量资料各组间差异的统计学意义,计数资料的组间比较采用方差检验。结果miR-219a-5p在实验组BMSC中的相对表达量为6.03±1.39,而在对照细胞中的相对表达水平仅有1.01±0.21,两组之间差异有统计学意义(t=10.351,P<0.01)。利用数据库TargetScan预测得到miR-219a-5p的下游靶基因FZD4,RT-qPCR结果提示FZD4在实验组细胞中的表达水平为1.09±0.55,在对照组细胞中相对表达量达到4.61±1.08,两组之间差异有统计学意义(t=10.376,P<0.01)。皮尔森(Pearson)线性分析显示miR-219a-5p和FZD4在BMSC中表达水平呈负相关[r=-0.631,95%可信区间(CI):-0.763、-0.498,P<0.01]。下调实验组中miR-219a-5p的表达后,FZD4的水平升高4.34倍(t=8.426,P<0.01),而在对照组细胞中上调miR-219a-5p的表达后,FZD4的表达水平下降4.75倍,差异均有统计学意义(t=8.667,P<0.01)。荧光素酶活性检测证实了miR-219a-5p与FZD4之间的结合关系。CCK-8实验结果显示实验组BMSC培养24、48、72 h后的吸光度值分别为0.27±0.05、0.48±0.05、0.63±0.04显著低于对照组的BMSC的0.46±0.05、0.96±0.08、1.51±0.11,两组之间差异具有统计学意义(t=9.776,P<0.01)。抑制实验组中miR-219a-5p表达后细胞的增殖活性明显提高,而同时敲低FZD4的表达则会逆转上述作用。同样地,将miR-219a-5p模拟物转染对照组细胞,细胞增殖活性明显抑制。茜素红染色显示对照组细胞的阳性染色面积/总面积为0.58±0.05,明显高于实验组的0.22±0.04,差异有统计学意义(t=7.610,P<0.01)。在实验组细胞中转染miR-219a-5p抑制剂可以增强细胞的成骨分化能力,但FZD4 shRNA抵消了miR-219a-5p抑制剂对成骨能力的强化作用,且上调正常BMSC中miR-219a-5p的水平可以阻止其成骨分化过程。结论miR-219a-5p在激素性股骨头坏死BMSC中高表达,FZD4介导了miR-219a-5p对BMSC增殖及成骨分化的抑制作用。 相似文献
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目的探讨Follistatin表达抑制对人类骨髓间充质干细胞(BMSC)细胞活性及骨形态发生蛋白(BMP)‐2诱导人类BMSC成骨分化的影响。方法采用 Follistatin特异性 siRNA 转染人类BMSC ,检测线粒体脱氢酶活性、细胞DNA含量及蛋白含量。采用定量逆转录‐聚合酶链式反应(qRT‐PCR)检测成骨相关基因表达,采用碱性磷酸酶(ALP)染色和茜素红染色检测 Follistatin对BMP‐2诱导人类BMSC成骨分化的影响。结果转染后3、7 d ,人类BMSC代谢、DNA含量显著升高;转染后14 d ,总蛋白含量增加。Follistatin表达抑制后成骨相关基因如ALP、OCN、OSX、OC、OPN、RUNX2等表达升高,且ALP活性及钙沉积量显著增加。结论抑制Follistatin表达可促进人类BMSC细胞活性和BMP‐2诱导人类BMSC成骨分化能力,Follistatin可抑制人类BMSC成骨分化。 相似文献
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彭松林王尚陈高扬 《中华骨与关节外科杂志》2020,(10):853-858
背景:微小RNA(miRNA)在调节基因表达中起重要作用,与多种代谢疾病有关。当前对循环血miRNA在骨质疏松骨代谢过程中的调控作用尚不明确。目的:筛选外周血中成骨相关miRNA,并探讨其调节成骨的机制。方法:通过RNA测序揭示骨质疏松患者相比于骨量正常受试者外周血中差异表达的miRNA,应用生物信息学方法预测关键miRNA的下游潜在靶点,通过过表达/敲低实验,进一步验证关键miRNA调控骨髓间充质干细胞成骨分化的作用和信号通路。结果:miR-19b在骨质疏松患者中显著下调,且在伴有椎体骨折的骨质疏松患者中尤为显著。进一步生物信息学研究和qPCR实验证实miR-19b可通过抑制PTEN介导AKT/GSK3β通路表达。细胞功能实验发现,过表达miR-19b可使BMSCs成骨分化能力增强,而敲低miR-19b可使BMSCs成骨分化能力减弱。结论:miR-19b可能通过调节PTEN/AKT/GSK3β通路增强BMSCs成骨分化,可能为骨质疏松症的防治提供新的策略。 相似文献
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骨质疏松症(osteoporosis,OP)是一种中老年人易患的骨代谢性疾病,以骨密度减低和骨微结构破坏为特征,可导致骨脆性增加和骨折风险增大。随着OP分子机制研究的深入,针对相关细胞调控通路的治疗靶点被陆续发现,通过这些靶点可研发出新的靶向治疗方案。lncRNA分化拮抗非蛋白编码RNA(differentiation antagonizing non-protein coding RNA,DANCR)能够通过竞争结合、作为转录辅助因子等方式作用于Wnt/β-catenin、MAPK及NF-κB等信号通路调控BMSC成骨分化,影响OP的发生与进展。DANCR具有作为OP临床诊断标志物的潜力,并有希望作为药物干预的靶点参与OP的精准医疗。 相似文献
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超临界大面积或大段骨缺损仍是临床面临的难题,研究者们致力于研发人工骨材料,但为了解决人工骨材料成骨效应不良的问题,人们越来越关注骨髓间充质干细胞在骨组织工程中的应用。本综述以骨髓间充质干细胞、成骨分化、成骨细胞、临床应用"Bone marrow mesenchymal stem cells,osteogenesis differentiation,osteoblasts cell,clinical application"为检索词,应用计算机搜索CNKI数据库、万方数据库、维普数据库、PUBMED数据库,全面归纳总结骨髓间充质干细胞的分离培养、骨髓间充质干细胞鉴定方法、成骨诱导方法、成骨分化鉴定及其在临床中的应用,为证实其作为种子细胞治疗骨组织疾病提供理论依据。学者们初步研究了骨髓间充质干细胞结合移植、组织工程等技术来治疗骨和软骨缺损、骨关节炎、股骨头坏死等疾病,均取得了较好的临床疗效。但是骨髓间充质干细胞会有一定的优缺点,其临床试验及远期疗效的验证还需进一步深入研究。 相似文献
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骨质疏松症(osteoporosis,OP)已成为全世界面临的重大公共卫生健康问题,尤其随着我国人口老龄化进程的加速,对其的防治已刻不容缓。近年来,随着对我国传统中医药的挖掘与探索,多项研究发现补肾中药杜仲对于骨质疏松症的防治效果明显。现代药理学研究表明,杜仲有效成分可以通过调节雌激素水平、骨代谢相关细胞因子及护骨素的表达对成骨细胞、破骨细胞、骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)增殖分化综合作用,有效防治骨质疏松。而BMSCs作为成骨细胞的前体细胞,探索其分化机制对于指导防治骨质疏松症具有重大意义。本文对传统中药杜仲诱导BMSCs向成骨细胞分化的相关信号通路作以综述,以期为OP的诊疗提供新思路。 相似文献
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《中国矫形外科杂志》2014,(15):1402-1407
[目的]探讨成人骨髓间充质干细胞分离、纯化、培养及鉴定的方法,观察其成骨分化过程中Runx2基因的动态表达以及生物学特性。[方法]取自人股骨近端骨髓标本,利用联合密度梯度离心和差异贴壁法分离骨髓间充质干细胞,体外扩增和传代培养,流式细胞仪检测细胞表面标记,诱导向成骨细胞分化,并采用RT-PCR和Western blot方法检测Runx2的动态表达。[结果]原代和传代细胞呈纺锤状外观,生长增殖能力良好,骨髓间充质干细胞的生长曲呈成"S"形,细胞表面标记物CD90阳性表达,CD34和CD45阴性表达。经定向诱导分化后,细胞分别呈现成骨细胞的表型特征,随着诱导时间的增加,Runx2的表达也明显增加,与对照组相比有统计学差异(P<0.05)。[结论]该方法能从人骨髓中高效分离和扩增MSCs,生物学性状稳定,具有成骨分化潜能,为骨组织工程提供理想的种子细胞,同时证实Runx2在成骨分化中起到重要的调控作用。 相似文献
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脂肪间充质干细胞的成骨诱导分化 总被引:5,自引:0,他引:5
目的研究脂肪间充质干细胞(MSCs)在特定培养条件下向成骨细胞分化,探讨其作为骨组织工程的种子细胞的可行性。方法取3周龄Lewis大鼠的腹股沟脂肪垫,消化法获得脂肪MSCs,用成骨诱导培养基诱导其向成骨细胞分化,组织化学染色、免疫细胞化学染色和Western blotting检测细胞分化的情况。结果从成体大鼠脂肪组织中培养出脂肪MSCs,能大量稳定增殖传代。在地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠的诱导下,脂肪MSCs的ALP活性增高,Von Kossa染色出现钙结节,OPN、BMP-2免疫细胞化学染色阳性.Western blotting检测到诱导后细胞OPN、BMP-2的表达,且随诱导时间延长表达增强。结论从脂肪组织中可获得具有多分化潜能的MSCs,并能在体外稳定增殖传代,经诱导后可分化为脂肪细胞和成骨细胞,有可能成为骨组织工程较理想的种子细胞之一。 相似文献
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目的 观察低频振动对小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)成骨分化的影响。方法 取3周龄C57BL/6小鼠,分离及培养其BMSCs。将细胞分为两组,对照组及低频振动组,两组均诱导BMSCs进行成骨分化,低频振动组在诱导过程中实施低频振动干预(15 Hz,垂直加速度0.3 g),对照组不进行干预,分别于第7天、第14天收获细胞,将第7天的细胞进行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)染色,将第14天的细胞进行茜素红染色;并利用Real-time PCR检测相关基因表达。结果 低频振动组细胞第7天的ALP活性明显高于对照组,且在14 d形成的钙结节多于对照组;所检测基因中,低频振动组细胞Ⅰ型胶原蛋白、骨桥蛋白、骨钙素、骨保护素基因的表达均高于对照组,而破骨细胞分化因子(receptor activator of NF-κB ligand, RANKL)较对照组低。结论 低频振动可以促进BMSCs的成骨分化,并调节成骨细胞分泌的细胞因子,影响破骨细胞的生成。 相似文献
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体外诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的实验研究 总被引:2,自引:0,他引:2
目的:探讨HGF和EGF对骨髓间充质干细胞向肝细胞方向的诱导分化作用,探索出合适的诱导条件,为肝细胞移植、生物人工肝、组织工程构建等提供基础。方法:骨髓来自杂种犬的髂骨,采用全血贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞CD标记;用含HGF和EGF的α—MEM培养液进行诱导培养,并于诱导后7、14、21d留取细胞;用免疫组化检测AFP、CK18,免疫荧光检测ALB,PAS反应检测糖原;流式细胞仪检测细胞分化率。结果:分离的骨髓间充质干细胞表面CD13、CD34和CD45皆为阴性,CD29为阳性。诱导至7d出现AFP表达.14d表达增高,21d时表达下降。CK18、ALB和糖原14d时出现表达,并随时间延长表达逐渐增加:21d时ALB表达阳性率可达50%以上。结论:HGF和EGF有诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的作用。 相似文献
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目的探讨兔骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs)体外培养、定向诱导分化为成骨细胞和成脂肪细胞的途径,为进一步的实验研究打下基础。方法抽取兔股骨骨髓,以全骨髓贴壁培养法进行体外培养,贴壁细胞传代,倒置显微镜下观察细胞形态。取第3代细胞向成骨细胞和成脂肪细胞诱导,14d后成骨细胞诱导组检测碱性磷酸酶,成脂肪细胞诱导组进行油红O染色。结果全骨髓贴壁培养法可获得BM-MSCs,原代和传代培养的BM-MSCs具有活跃的增殖能力。成骨细胞诱导组碱性磷酸酶检测表达阳性,成脂肪细胞诱导组油红O染色见胞浆内出现大量红染脂滴。结论全骨髓贴壁培养法可有效地分离和扩增BM-MSCs,分离培养的BM-MSCs生长稳定,增殖力强,可向成骨细胞和成脂肪细胞诱导分化。 相似文献
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羟基红花黄色素A对激素诱导骨髓间充质干细胞成骨分化的影响 总被引:2,自引:2,他引:0
目的:观察羟基红花黄色素A(HSYA)对激素诱导兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)内成骨标志物碱性磷酸酶、Cbfαl及Ⅰ型胶原表达的影响,探讨其防治激素性股骨头缺血性坏死的作用机制。方法:健康成年新西兰大白兔15只,体重0.9~1.3 kg,腹腔注射麻醉后,无菌条件下作胫骨和髂前上棘骨髓腔穿刺抽取骨髓血,分离出BMSCs,体外培养并传代,取第3代生长状态良好的BMSCs随机分为空白组,模型组及羟基红花黄色素A低、中、高剂量组。模型组用大剂量地塞米松诱导BMSCs成脂分化,抑制其成骨分化;羟基红花黄色素A低、中、高剂量组加入地塞米松作用的同时给予羟基红花黄色素A干预;空白组无特殊处理。1周后检测各组细胞内成骨标志物碱性磷酸酶活性、Cbfαl及Ⅰ型胶原 mRNA的表达。结果:模型组兔BMSCs内碱性磷酸酶活性较空白组明显下降(P<0.01),Cbfαl及Ⅰ型胶原 mRNA的表达也明显降低(P<0.01),而HSYA各组较模型组均有明显升高(P<0.05或P<0.01).结论:羟基红花黄色素A治疗激素性股骨头缺血坏死的机制可能与对抗激素诱导下的BMSCs成骨分化减少有关。 相似文献
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目的明确萎缩性骨不连组织中表达上调的数种微小RNA(micro RNA,miRNA)与其相应靶基因mRNA、蛋白在hBMSCs成骨分化过程中的表达变化趋势和生物学功能。方法取自体髂骨植骨手术患者的髂骨骨髓血,采用密度梯度离心法分离培养hBMSCs。取第4代hBMSCs以成骨诱导培养液诱导成骨分化,分别提取0、12 h,1、2、4、7、14 d时的细胞总RNA和蛋白,进行miRNA的实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)、相应靶基因mRNA的qRT-PCR和蛋白Western blot检测。结果诱导hBMSCs成骨分化时,成骨性靶基因碱性磷酸酶(alkalinephosphatase liver/bone/kidney,ALPL)、PDGF-α多肽(PDGF-αpolypeptide,PDGF-A)和BMP-2的mRNA和蛋白表达在多数时间点同对照(0 h)相比增加(BMP-2在12 h和1 d时下降),1~7 d变化最为显著。不同时间点的miRNA、靶基因mRNA和蛋白表达水平存在差异,其中hsa-miRNA-149*和hsa-miRNA-654-5p miRNA含量的变化趋势与各自靶基因ALPL和BMP-2的mRNA及蛋白表达水平总体上成负相关(P<0.05),hsa-miRNA-221与其靶基因PDGF-A的变化趋势无明显负相关关系(P>0.05)。结论诱导hBMSCs成骨分化过程中,hsa-miRNA-149*和hsa-miRNA-654-5p对其相应靶基因ALPL和BMP-2的mRNA及蛋白存在密切调控关系。 相似文献