2318株结核分枝杆菌耐多药性分析

目的 探讨贵阳市肺科医院住院结核病患者中的耐药情况,为临床诊断和治疗耐多药结核病提供可靠的科学依据.方法 对2004年1月至2009年8月住院患者的临床分离株进行菌型鉴定后,进行药物敏感性试验,分析不同类型结核病患者的耐药情况.结果 2318株结核分枝杆菌耐多药率为23.8%,初始耐多药率为12.1%,获得性耐多药率为63.8%.结论 目前结核病患者耐药率较高,应尽快加强耐药结核病患者的防治工作,减少和避免耐多药结核病患者的产生.     

耐利福平结核分枝杆菌 rpoA、rpoB、rpoC和rpoZ突变的研究

目的：了解结核分枝杆菌rpoA、rpoB、rpoC和rpoZ突变特征及其与利福平耐药的关系。方法对140株临床分离结核分枝杆菌进行利福平敏感性试验,并对耐利福平株分别进行rpoB耐药决定区及rpoA、rpoB、rpoC及rpoZ全基因测序。结果140株结核分枝杆菌中57株对利福平耐药。57株耐利福平结核分枝杆菌中,52株（91.2%）存在突变,其中50株为rpoB基因突变,2株为rpoC突变。在rpoB 765、1001、1156位及rpoC 51位发现新的突变位点。结论结核分枝杆菌对利福平耐药主要与rpoB和rpoC基因突变有关。     

174株耐多药结核分枝杆菌对二线抗结核药耐药情况分析

目的：分析该院耐多药结核分枝杆菌对二线抗结核药的耐药情况,为耐多药结核病的治疗提供参考。方法采用回顾性分析法分析2011年5月至2013年5月结核病患者痰标本培养及药敏结果资料,对比分析耐多药分枝结核杆菌对5种二线药物耐药比率。结果初治耐多药结核分枝杆菌对二线耐药情况如下：耐药顺次由高到低依次为左氧氟沙星、对氨基水杨酸、丙硫异烟胺、阿米卡星及卷曲霉素的耐药比率分别为17．7％、14．5％、12．9％、8．1％及3．2％,耐两种的比率为4．8％,耐3种及3种以上的比率均为3．2％;复治情况的耐药顺次同初治顺次,但耐药比率不同,分别为50．0％、33．9％、25．9％、21．4％和16．1％,耐2种的比率为16．1％,耐3种为13．4％,耐3种以上的为12．5％。初治与复治的各种情形耐药比率比较,差异均有统计学意义（P＜0．05）。结论该院耐多药结核杆菌耐药比率低于国内平均水平,复治病例耐药比率高于初治。     

耐吡嗪酰胺结核分枝杆菌基因突变研究

目的 研究吡嗪酰胺酶编码基因pncA突变与结核分枝杆菌吡嗪酰胺(pyrazinamide,PZA)耐药的关系.方法 将临床分离的36株结核分枝杆菌进行常规PZA药敏试验和pncA基因序列分析.采用绝对浓度法进行PZA药敏试验;PCR扩增pncA基因及其上游、下游碱基序列,纯化回收PCR产物克隆到T载体并进行全自动测序.结果 36株临床分离株中25株PZA耐药,11株PZA敏感.5株高耐PZA(PZA浓度为250 μg/ml)临床分离株4株pncA基因突变;20株低耐PZA(PZA浓度为50 μg/ml)6株pncA基因突变;25株耐PZA结核分枝杆菌pncA基因突变率为40.0%.3株PZA敏感临床分离株pncA基因出现突变、其中2株为同义突变.11株耐PZA结核分枝杆菌pncA基因上游调控序列突变,其中5株同时有pncA基因突变;2株PZA敏感结核分枝杆菌pncA基因上游序列突变.结论 pncA基因突变可引起结核分枝杆菌对PZA耐药,但pncA基因突变只是结核分枝杆菌耐PZA的一种机制,可能还存在PZA的其他耐药机制.     

依赖利福平结核分枝杆菌的分子生物学研究

目的　从分子生物学的角度研究依赖利福平结核分枝杆菌 (依R菌 )。方法　采用DNA自动测序仪 ,对菌株rpoB基因片段 ( 319bp)的序列进行分析 ;采用随机扩增DNA聚丙酰胺凝胶电泳 (RAPD PAG)指纹分型法 ,对菌株的DNA指纹进行分型 ;采用SDS聚丙酰胺凝胶蛋白电泳法 ,对菌株的菌体蛋白进行分析。结果　 30株依R菌rpoB基因的突变率为 96 7% ( 2 9/ 30 ) ,37株耐利福平结核分枝杆菌 (耐R菌 )为 81 1% ( 30 / 37) (P <0 0 1) ,依R菌和耐R菌的突变高发位点均为 5 31位( 37/ 5 9,6 3 2 % ;)密码子、突变 ,其次为 5 16位 ( 13/ 5 9,2 2 8% )和 5 2 6位 ( 7/ 5 9,12 3% ) ;依R菌和耐R菌两组菌株的DNA指纹结果可分为 5种类型 ,其中以Ⅱ型 ( 31/ 6 7,46 2 % )、Ⅰ型 ( 2 0 / 6 7,2 9 9% )和Ⅲ型 ( 13/ 6 7,19 4% )为主 ;3种主要类型的指纹在两组菌株中的分布无明显特殊性 ;依R菌在含R管和对照管中的菌体蛋白电泳图谱有 76 7% ( 2 3/ 30 )的不同 ,其在含R管中菌体蛋白表达丰富 ,且在分子量 310 0 0～ 43 0 0 0间有一宽带 ;37株耐R菌其两管的菌体蛋白电泳图谱各自均相同。结论　依R菌和耐R菌的基因型密切相关 ;依R菌的蛋白表达可依赖于R。     

结核分枝杆菌耐利福平和异烟肼相关基因快速检测的应用研究

目的 利用DNA芯片检测技术直接检测痰标本中结核分枝杆菌耐利福平(RFP)、异烟肼(INH)相关的耐药基因(rpoB、katG/inhA),评价DNA芯片检测技术临床应用的可行性.方法 对586份涂阳痰标本使用L-J培养并用终点法确定其耐药性,同时利用DNA芯片检测技术检测痰标觋本中结核分枝杆菌的rpoB、katG/inhA常见基因突变位点的突变情况,比对两种方法的检测结果,对不符合的菌株测定其相应DNA序列,评估上述试验的准确性.结果 (1)586份涂阳痰标本,其中3(+)163份、2(+)204份、1(+)217份,培养阳性584份.耐药结果显示,对INH、RFP敏感的菌株分别为361株和327株,耐药菌株分别为223株和247株,其中低浓度耐药、高浓度敏感菌株分别为93株和59株,低浓度、高浓度均耐药菌株分别为130株和188株.(2)耐药基因特异性片段扩增阳性标本367份(62.8%)、阴性217份(37.2%).对INH耐药相关基因(katG/inhA)突变检出率是28.4%,突发发生位点集中在katG315位密码子(89.8%);对RFP耐药相关基因(rpoB)突变检出率是55.9%(137/247),突变发生位点主要在rpoB 531和rpoB 526位密码子,发生率分别是68.6%和16.1%.(3)对L-J药敏结果与DNA芯片检测结果不符的菌株进行DNA序列分析,发现有漏检现象.结论 DNA芯片技术直接检测样本中结核分枝杆菌的相关耐药基因存在可行性,如直接应用于临床样本检测,关键要解决样本中DNA的提取效率、PCR的扩增效率和试验的质量控制.     

耐药结核分枝杆菌基因变异研究

目的 研究多药结核分枝杆菌ｋａｉＧ、ｉｎｈＡ基因的变异机理。方法 用ｋａｔＧ、ｉｎｈＡ基因片引物,聚合酶链反应扩增产物,克隆后制质粒、直接测定ＤＮＡ序列。结果 １５株耐异烟肼菌株均有ｋａｔＧ基因突变,主要为点突变,其中１４株有４６３位和３１５位ＡＡＰ２密码改变,在１８个耐异烟肼菌株中,全部出现基因ｉｎｈＡ 基因变异,主要为点突和人,以单个点变异主,各菌株变异不同,ｋａｔＧ、ｉｎｈＡ基因同时出现变异     

非结核分枝杆菌170株耐药情况分析

目的观察非结核分枝杆菌(NTM)的耐药情况,为NTM病的临床治疗提供依据。方法收集2008年1月至2009年8月上海市肺科医院痰标本经Bactec-MGIT 960系统培养为NTM的药敏结果进行分析。结果分枝杆菌培养阳性的1583株中NTM170株,占10.73%。耐药株167株,总体耐药率98.34%。耐药依次为异烟肼(H)、链霉素(S)、卷曲霉素(Cm)、氧氟沙星(Ofx)、阿米卡星(Am)、利福平(R)、乙胺丁醇(E)。对上述7药全耐药共143株(78.82%),耐6药以下菌株仅10株(5.88%)。R耐药株和E耐药株较其他各药耐药少,差异有统计学意义(P均<0.05)。结论 NTM耐药情况十分严重;应对可疑NTM肺病及早行菌型鉴定及药物敏感性测定;经验性治疗推荐在E和R的基础上选药组成方案。研究抗NTM新药是当前的迫切需要。     

结核分枝杆菌快速药敏实验的研究进展

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的结核病是常见的人类传染病之一。约三分之一的世界人口曾经感染MTB,亚洲地区感染者占全世界的三分之二。中国是全球22个结核病高发国之一,发病人数居世界第2位,仅次于印度[1]。全国第4次结     

基因芯片与罗氏绝对浓度法对结核分枝杆菌耐药检测的效果比较

目的探讨基因芯片与罗氏绝对浓度法检测结核分枝杆菌耐药性的效果。方法对2012~2013年收集的180例标本进行痰液结核分枝杆菌培养,采用基因芯片检测抗结核药利福平和异烟肼的耐药性,同时采用罗氏绝对浓度法药敏检测进行对照,评价其灵敏度、特异度和符合率。结果以罗氏绝对浓度法作为金标准,基因检测结果显示,利福平耐药性的灵敏度为92.3%、特异度为97.1%、准确度为95.0%;而异烟肼的灵敏度为85.4%、特异度为93.9%、准确度为90.0%。基因检测结果显示,利福平存在rpoB基因突变,异烟肼可能存在inhA、katG和ahpC基因突变。结论基因芯片法和罗氏绝对浓度法对利福平和异烟肼耐药性检测具有较好的一致性,但基因芯片更具快速、准确的特点,值得临床推广应用。     

银染单链构象多态性技术检测结核杆菌rpoB基因突变

目的探讨分子生物学方法在临床标本结核分枝杆菌利福平（ＲＦＰ）耐药性评估中的应用价值。方法设计针对ｒｐｏＢ基因１８３ｂｐ扩增引物,运用聚合酶链反应单链构象多态性分析（ＰＣＲＳＳＣＰ）银染色方法,检测了４５株结核杆菌临床分离株,并对其中部分菌株进一步做了ＤＮＡ序列分析。结果以药敏试验结果为对照,有１６株ＲＦＰ敏感株及２６株ＲＦＰ耐药株经ＳＣＰ方法得到检测,阳性占９３．３％,特异性１００％。对部分菌株１８３ｂｐ片断测序结果显示,ＲＦＰ敏感株无ｒｐｏＢ基因突变,耐药株均发生碱基突变,分别导致编码５３１及５２６位点的氨基酸改变。结论银染ＰＣＲＳＣＰ方法具有简便,快速,准确的特点,提高敏感性,可以对临床标本结核杆菌利福平耐药突变进行鉴定。序列分析证明结核分枝杆菌利福平耐药菌株有ｒｐｏＢ基因突变。     

微量MIC检测判断结核分枝杆菌药敏的方法学研究

目的 建立用微量MIC值判断结核分枝杆菌药物敏感性的方法 ,并进行初步临床应用评价.方法 采用液体培养基MIC测定技术,在96孔U型板中进行检测,以60株已知药敏结果 的本院菌株库保存菌株作为试验菌株, 根据Bactec MGIT结果采用ROC曲线分析建立微量MIC药敏判断界值,最后用80株连续时间段内收集的结核分枝杆菌临床分离株对微量MIC药敏判断界值进行验证和修正.结果 微量MIC药敏法的最佳接种菌量为10~(-3)mg/ml数量级,7～10 d即可报告结果 ,链霉素、异烟肼、利福平、乙胺丁醇、氧氟沙星、阿米卡星和卷曲霉素的最佳判断界值分别为2、0.25、1、2、1、4和4 μg/ml,其敏感度分别为93.5%、97.7%、93.5%、84.4%、95.8%、91.7%和88.9%, 特异度分别为95.6%、94.6%、100.0%、93.8%、92.9%、95.6%和91.5%.其准确性分别达95.0%、96.3%、97.5%、90.0%、93.8%、95.0%和91.3%. 结论 微量MIC药敏检测方法 具有快速、准确、低成本和操作简单的优点,具有良好的推广应用前景,适合在我国各级结核病专业收治机构使用.     

核酸薄膜导流杂交技术快速检测结核分支杆菌rpoB基因片段及突变

摘要：目的：探讨用低密度核苷酸薄膜导流杂交技术快速检测结核分支杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）的可行性。 方法：根据MTB rpoB基因设计12个野生型及常见突变型寡核苷酸特异探针,制作低密度核苷酸薄膜微阵列,通过导流杂交技术与薄膜杂交鉴定,并与DNA测序法对比。 结果：81株MTB的耐药性试验及DNA测序结果显示,27株耐利福平MTB株中20株（74.1%）存在突变。以DNA测序结果为标准,31株标本（20株耐利福平MTB突变株,11株利福平敏感MTB野生株）低密度核苷酸薄膜导流杂交的敏感性为85%（17/20）,特异性为100%（11/11）,阳性预测值为100%(17/17),阴性预测值为78.6%(11/14);与DNA测序法的符合率为90.3%(28/31)。 结论：用低密度核苷酸薄膜导流杂交能快速、简便检测MTB,并可提示其是否对利福平耐药,指导临床合理用药。     

膜芯片技术对结核分枝杆菌耐药性检测的研究

目的 验证膜芯片技术在结核分枝杆菌对利福平（RFP）、异烟肼（INH）、链霉素（SM）和乙胺丁醇（EMB）耐药性检测中的应用价值.方法 收集393例临床标本（包括痰液、尿液、胸腔积液、腹水标本）,根据结核分枝杆菌耐药位点的DNA序列,设计用于检测rpoB、katG、inhA、rpsL和embB基因常见突变类型的膜芯片,对上述临床标本进行检测,并将其与传统微生物敏感性试验结果进行比较,对不相符结果用聚合酶链反应产物直接测序（PCR-DS）进行验证.结果 以常规培养法为金标准,膜芯片法扩增结核分枝杆菌的敏感性、特异性、准确性分别为90.4%、98.8%和95.7%,其对结核分枝杆菌RFP、INH、SM和EMB耐药性检测的敏感性分别为92.3%、83.3%、68.8%和83.3%;准确性分别为98.6%、97.3%、96.6%、和98.5%;特异性均达到100.0%.结论 膜芯片法检测结核分枝杆菌耐药性具有较高的敏感性、特异性和准确性,可作为常规微生物敏感性试验的补充.     

焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌四种药物耐药性

目的 利用焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌对利福平、异烟肼、氧氟沙星、阿米卡星的耐药性,并对其临床应用进行评价.方法 收集上海市肺科医院2008-2009年临床确诊的肺结核患者的痰标本培养阳性结核分枝杆菌89株.所有菌株按<结核病诊断实验室检验规程>进行分枝杆菌培养、菌种鉴定.另外10株已知药敏结果的结核分枝杆菌来自上海市肺科医院菌株库.利用焦磷酸测序技术,以10株已知药敏结果和经直接测序已知耐药基因突变情况的结核分枝杆菌为试验菌株,探索焦磷酸测序检测结核分枝杆菌rpoB、katG、gyrA、rrs耐药基因的最佳模式,并用该条件检测89株结核分枝杆菌临床分离株,检测结果与Bactec 960药敏法进行比较.结果 rpoB、gyrA基因检测宜采用焦磷酸测序序列分析模式,katG、rrs基因检测宜采用焦磷酸测序单核苷酸多态性模式.以Bactec 960药敏法测定结果为判断标准,则焦磷酸测序法检测89株结核分枝杆菌临床分离株对利福平、异烟肼、氧氟沙星、阿米卡星耐药性的敏感度分别为98.0%、64.1%、79.5%、78.3%,特异度分别为97.5%、100.0%、90.0%、100.0%,准确性分别为97.8%、77.5%、85.4%、94.4%,该法检测利福平、氧氟沙星、阿米卡星的检测结果与Bactec 960药敏检测结果一致性较好,Kappa值均≥0.7.结论 焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌对利福平、异烟肼、氧氟沙星、阿米卡星耐药性具有快速、准确、高通量的优点,是一种可对结核分枝杆菌多种药物耐药性进行快速检测的方法.

Abstract：

Objective To develop an assay to determine Mycobacterium tuberculosis resistance to rifampin, isoniazid, ofloxacin and amikacin by pyrosequencing and evaluate the value of this method in clinical application. Methods Eighty-nine clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis from tuberculosis patients were collected from Shanghai Pulmonary Hospital during 2008 to 2009. All strains were isolated from decontaminated sputum, cultured on Lowenstein-Jensen media and identified by traditional biochemical tests with standard methods. Ten Mycobacterium tuberculosis were selected from the strain bank of Shanghai Pulmonary Hospital. The optimal conditions of detection of rpoB, katG, gyrA and rrs gene by pyroseuencing were determined, using the 10 Mycobacterium tuberculosis strains whose drug susceptibility of Bactec 960 and sequence of rpoB, katG, gyrA, rrs gene were known. Then the drug susceptibility of 89 Mycobacterium tuberculosis clinical isolate strains were detected by pyrosequencing using this conditions and the results were compared with that of the Bactec 960 methods. Results The pyrosequencing program of sequence analysis was suitable for the detection of the mutations of rpoB and gyrA genes, and the program of single nucleotide polymorphism was suitable for katG and rrs genes. Among the 89 Mycobacterium tuberculosis clinical isolates,when using the drug susceptibility of Bactec 960 as the standard, the sensitivity of rifampin, isoniazid,ofloxacin and amikacin is 98.0%, 64. 1%, 79.5%, 78. 3% respectively, the specificity is 97.5%,100. 0%, 90. 0%, 100. 0% respectively, the accuracy is 97.8%, 77. 5%, 85.4%, 94. 4% respectively,tested by pyrosequencing. The results of the detection of resistance to rifampin, isoniazid, ofloxacin and amikacin in Mycobacterium tuberculosis using pyrosequencing technique were almost the same with that of Bactec 960, and Kappa ≥0. 7 in each detection. Conclusion Pyrosequencing is thus a rapid, accurate and high throughput method for detecting Mycobacterium tuberculosis resistance to these four drugs.     

结核分枝杆菌利福平耐药基因的检测

以药物敏感试验为标准，应用聚合酶链反应－单链构象多态性分析方法对６８例利福平耐药菌株和２０例利福平敏感菌株进行测定，结果８８例结核分枝杆菌均扩增出目标ＤＮＡ条带，１０例非结核分枝杆菌和８例非分枝杆菌未出现目标ＤＮＡ条带，所用引物扩增ｒｐｏＢ基因２１５ｂｐ片段为结核分枝杆菌复合群异性的。     

基因检测及MODS技术快速诊断结核分枝杆菌对左氧氟沙星的敏感性研究

目的 探讨基因检测技术和显微镜观察药物敏感度检测技术(MODS)对结核分枝杆菌(MTB)耐左氧氟沙星(LFX)快速诊断价值.方法 选取MTB标准株(H37Rv)和32株耐LFX临床分离株,行gyrA基因喹诺酮类药物耐药决定区(QRDR)序列测定,同时,用24孔细胞培养板进行MTB液体药敏检测.结果 基因检测结果显示,H37Rv未发生gyrA基因突变;与H37Rv株序列的差异比较显示,29株耐LFX临床株发生了有义突变,突变率90.6%.MODS与罗氏绝对浓度法药敏(L-J)比较,H37Rv完全相符;32株耐LFX临床分离株,相符31株,不符1株,符合率为96.9%.结论 gyrA基因突变检测可作为快速诊断结核分枝杆菌对LFX敏感性的一种方法,但不能完全区别低耐药和高耐药而使用受到限制.MODS技术检测LFX耐药性具有快速、操作简便、灵敏度和特异性高等优点,可作为结核分枝杆菌对LFX敏感性的快速检测新方法.     

耐多药结核分枝杆菌耐药相关基因突变特征分析

目的了解中国耐多药结核分枝杆菌耐药相关基因的分子特征。方法对138株耐多药结核分枝杆菌和45株敏感菌的耐药相关基因inhA、katG和oxyR-ahpC间隔区(异烟肼)、rpob(利福平)、gyrA(氧氟沙星)和rrs(卡那霉素)进行序列测定,分析其基因突变特点。结果 138株耐多药结核分枝杆菌中,14.4%的菌株inhA基因发生突变,72.5%菌株的katG基因发生突变,15.9%菌株的oxyR-ahpC基因发生突变,同时考虑这3种基因,异烟肼耐药相关基因突变检出率可达90.6%;94.2%菌株的rpoB基因发生突变,74.5%菌株的gyrA基因发生突变,61.1%菌株的rrs基因发生突变,主要的突变位点为katG315(66.7%),inhA-15(9.4%),oxyR-ahpC-10(5.1%),rpoB516(13.8%),526(26.1%)和531(49.3%),gyrA90(21.6%)和94(51%),rrs1401(61.1%)。结论我国耐多药结核菌异烟肼、利福平、氧氟沙星和卡那霉素耐药相关基因最常见突变为katG315、inhA-15,rpoB531、526和516,gyrA94和90,rrs1401。     

RIFO杂交和限制性片段长度多态性检测耐利福平和异烟肼的结核分枝杆菌

目的评价利福平寡核苷酸探针杂交技术（RIFO杂交）和PCR-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）在结核分枝杆菌（MTB）耐利福平（RIF）和异烟肼（INH）快速检测中的应用价值。方法选取121株北京地区MTB菌株，分别采用RIFO杂交技术和PCR—RFLP检测RIF耐药相关基因rpoB核心区和INH耐药相关基因katG315位点突变，并对所有菌株的rpoB基因核心区进行测序验证。结果RIFO杂交检测发现，91，5％（65／71）的RIF耐药株和92．9％（52／56）的耐多药菌株（至少对RIF和INH耐药）存在rpoB基因核心区突变，而RIF敏感株中未发现突变；RIFO杂交与测序结果完全一致，测序结果中有突变的位点在RIFO杂交中均有相应的野生型杂交信号缺失；PCR-RFLP结果显示，INH耐药株中katG315突变率为60.6％（40／66）。结论rpoB基因核心区可作为RIF耐药检测的分子标志及耐多药的筛选指标；RIFO杂交技术是检测MTB耐RIF的快速、准确的实验方法，具有推广及潜在的临床应用价值；PCR—RFLP可检测出大部分INH耐药株，可作为临床INH耐药性检测的辅助手段。