多重PCR检测在多种常见肠道致病菌中的效果观察

目的:探讨多重PCR检测在多种常见肠道致病菌中的应用效果。方法:取四种常见的肠道致病菌作为研究对象,包括:大肠杆菌O157、副溶血性孤菌、普通变形杆菌、单核细胞增生李斯特菌等,采用多重PCR法对四种肠道致病菌进行检测,并与临床模拟样品进行验证,分析多重PCR检测在多种常见肠道致病菌中的应用效果。结果:单重PCR结果显示:对于变形杆菌扩增出大小为522bp的特异性片段;单核细胞增生李斯特菌扩增出大小为155bp的特异性片段;大肠杆菌O157扩增出大小为366bp的特异性片段;副溶血性孤菌扩增出大小为199bp的特异性片段。多重PCR结果测定显示:大肠杆菌O157、副溶血性孤菌、普通变形杆菌、单核细胞增生李斯特菌特异性表明只有该四种菌扩增出特异性条带,其他均为阴性;灵敏度结果显示:多重PCR测定菌落计数数量级为103CFU/mL。结论:将多重PCR技术用于多重常见肠道致病菌中效果理想,能快速、准确的筛查致病菌,为临床治疗提供依据。     

PCR快速检测猪链球菌2型方法的建立

目的建立一种快速、特异且敏感的猪链球菌菌型的检测方法。方法从疑似猪链球菌感染患者血液（抗凝血）中提取DNA为模板，并合成引物检测猪链球菌特异性16 Sr RNA基因片段、2型猪链球菌特异性荚膜多糖编码基因片段cps2J、溶菌酶释放相关蛋白编码基因片段mrp、细胞外蛋白因子编码基因片段ef。结果PCR扩增结果证实是猪链球菌2型。结论PCR反应体系是一种检测和鉴定猪链球菌2型的快速、特异且敏感的方法。     

浙江省1989年白喉棒状杆菌的分离和鉴定

1989年我省检出白喉棒状杆菌13株,其中病人5株,带菌者8株,生化分型均属轻型菌株。 1989年1月,开化县下坞中学发生白喉暴发流行,现场对疑似病人和密切接触者采咽拭57份,分离得白喉棒状杆菌11株(病人4株,带菌者7株),检出率19.29％。1989年10月,浦江县发生一例白     

人感染猪链球菌病的病原分离与PCR方法的快速检测

目的研究人感染猪链球菌的生物学特征，并建立一种快速、特异且敏感的检测方法。方法将疑似猪链球菌感染患者的血液进行增菌培养，对所分离的病原菌进行染色形态观察、API 32 Strep生化鉴定；同时从该疑似患者血液（抗凝血）中提取DNA为模板，并合成引物检测猪链球菌特异性16SrRNA基因片段、2型猪链球菌特异性荚膜多糖编码基因片段cps2J、溶菌酶释放相关蛋白编码基因片段mrp、细胞外蛋白因子编码基因片段ef。结果PCR扩增结果证实是猪链球菌2型，而从血液中分离的病原菌，经API 32 Strep生化鉴定，也证实为猪链球菌2型。结论人感染猪链球菌的病原学及PCR检测符合猪链球菌2型，同时该PCR反应体系是一种检测和鉴定猪链球菌2型的快速、特异且敏感的方法。     

巢式PCR快速检测炭疽芽孢杆菌

目的：快速简便地检测炭疽芽孢杆菌。方法：细菌培养物经反复冻融，SDS，蛋白酶K和煮沸处理后，作为PCR模板，根据炭疽芽孢杆菌质粒pX01中水肿因子（EF）基因设计两对引物，采用巢式PCR（nestedPCR)扩增目的基因，结果：从炭疽芽孢杆菌模板中成功扩增出1247bp的特异片段，而未在炭疽芽孢杆菌无毒株，蜡样芽孢杆菌和枯草杆菌模板中扩增出相应条带；第一次扩增能检出的最低细菌量是10^3拷贝；经再次巢式PCR，扩增出208bp的特异片段，最低检出的细菌数为10个拷贝，敏感性提高了100倍。结论：巢式PCR是一种快速，特异，敏感的检测炭疽芽孢杆菌的方法。     

荧光定量PCR方法快速检测人博卡病毒的研究

目的建立特异、快速、灵敏的、用于人博卡病毒核酸检测的荧光定量PCR方法。方法对博卡病毒的ns1基因应用Clustal W软件进行序列同源性比对,在保守区设计特异性引物和TaqMan探针,并对荧光PCR反应条件进行优化,验证方法的特异性,并将该方法与国际上通用的针对人博卡病毒ns1基因和np基因的普通PCR方法进行灵敏度比对;同时将该方法应用于疑似患者临床标本检测。结果该方法针对ns1基因进行扩增,对人博卡病毒核酸检测有高度特异性,与副流感1、2、3型,甲型、乙型流感病毒,呼吸道合胞病毒,腺病毒,冠状病毒229E、OC43,偏肺病毒以及鼻病毒等均无交叉反应。检测的灵敏度均比国际上通用的扩增ns1基因及np基因的PCR方法高10倍。用该方法从144份急性上呼吸道感染患者咽拭标本中检出了2份博卡病毒阳性,从病毒核酸提取至检测完成仅需3 h左右;用普通PCR仅能检出1份阳性标本,且耗时需5 h左右。结论该研究建立的TaqMan荧光定量PCR是一种快速检测人博卡病毒特异、敏感的方法,适用于临床早期诊断。     

2009年华容县80例手足口病患儿病原学及临床特征研究

目的对疑似手足口病的住院患儿结合临床症状应用分子生物学方法进行实验室检测,及早确定治疗方案与预防策略,防止暴发流行。方法对疑似患儿进行流行病学调查,采集肛拭纸、咽拭纸、疱疹液及脑脊液,提取RNA,运用3对特异性引物进行PCR扩增,对阳性病例的性别、年龄和流行月份等指标进行统计学分析。结果 80例疑似手足口病患儿经RT-PCR检测,肠道病毒通用引物阳性的有64例(80%),其中EV71引物阳性的39例(48.75%),COX-A16引物阳性的19例(23.75%),EV71与COXA16引物同时阳性的有6例(7.5%),患儿性别差异无统计学意义(P0.05),全年病例主要分布在5月份(18.75%)。无死亡病例。结论对手足口病疑似患儿进行病原学检测,能为临床治疗及制定预防措施提供科学依据。     

多重逆转录-聚合酶链反应快速检测登革病毒及其临床应用

目的 建立登革1～4型病毒的多重逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)快速检测及分型方法。方法 参照登革1～4型病毒核酸序列设计多重RT-PCR引物，并检索国际基因序列数据库初步验证其特异性，随后对PCR反应条件进行优化，以同属于黄病毒科的黄热病毒、流行性乙型脑炎病毒为对照，验证其特异性。并对2003年30份临床疑似登革患者血清标本进行了检测，阳性片段克隆测序验证扩增片段特异性。结果 采用多重PCR引物对登革1～4型病毒进行扩增，分别获得295、237、118、347bp片段，与设计相符；而黄热病毒及流行性乙型脑炎病毒均无非特异性扩增条带，对引物的相关性实验结果表明引物之间不会因相互干扰而出现假阳性结果，30份疑似患者血标本RT-PCR扩增阳性率为83．3％(25／30)，其核酸序列与登革1型病毒柬埔寨株以及中国1997、1999年流行株GD14／97、G1305／99同源性分别为97％、97％、98％。结论 实验证明，所建立的多重PCR方法能够快速地检测和鉴定登革1～4型病毒，为登革病毒的检测及分型提供了一种方便易行的方法。     

PCR技术在流脑监测中的应用研究

目的建立脑膜炎奈瑟菌种属及群的快速检出方法。方法应用PCR法扩增标准菌株及标本中脑膜炎奈瑟菌种属及各群的特异性DNA片段，通过电泳后对产物进行分析。结果11份标本中检出4份脑膜炎奈瑟菌CrgA基因片段，其中扩增出2份含有NmA群Off-2基因片段，2份含有NmC群siaD（C）片段。结论PCR技术可用于临床标本中脑膜炎奈瑟菌种属及各群的特异性检测。     

多重PCR快速检测空调冷却塔水中军团菌

目的 传统的方法分离培养军团菌，时间长，价格贵，培养较困难，本文建立多重PCR方法，快速检测空调冷却塔水中军团菌属和嗜肺军团菌种。方法 利用军团菌属保守基因片段16SrRNA和嗜肺军团型菌巨噬细胞感染增强因子（mip）基因序列的特异性引物，对空调冷却塔水样中分离的疑似军团菌株进行特异性扩增，并且为了增强敏感性，运用递减温度PCR扩增。结果：PCR扩增的阳性结果与生化培养和血清学鉴定为军团菌的菌株结果—致。结论：与传统的分离培养方法相比，多重PCR方法检测军团菌，快速敏感，成本低，具有较好的特异性。     

广东省一例白喉疑似病例的病原学检测和流行病学调查

目的 对广东省发现的1例疑似白喉病例进行流行病学调查和病原学检测,以明确诊断。方法 2010年7月6日,广东省广州市大学城某医院在1例鼻咽癌患者的鼻腔分泌物中检出白喉棒状杆菌。对患者及其密切接触者进行流行病学调查,采集患者及其密切接触者咽拭子标本（3份）和患者鼻腔分泌物标本（1份）,采用血平板和吕氏斜面进行细菌分离培养,对阳性菌株进行细菌涂片染色鉴定;应用梅里埃API Coryne棒状杆菌生化鉴定卡进行生化鉴定;应用PCR方法测定白喉棒状杆菌β棒状杆菌噬菌体tox基因;应用气相色谱法进行脂肪酸分析;采用白喉棒状杆菌（重型,编号：CMCC 38009）作为阳性对照。结果 患者近1个多月无外出史及来访史,否认疫苗接种史。对患者的家人及5名密切接触者进行调查,未发现有类似症状的病例。从患者鼻腔分泌物中分离到1株白喉棒状杆菌,革兰染色阳性,形态多样化,经吕氏斜面培养后进行革兰染色和奈瑟染色,菌体一端或两端见特征性的异染颗粒,API Coryne生化鉴定提示99.4％是缓和白喉棒状杆菌。用气相色谱法进行脂肪酸分析,结果显示为白喉棒状杆菌。患者及其密切接触者咽拭子均未分离到白喉棒状杆菌。PCR检测白喉棒状杆菌β棒状杆菌噬菌体tox基因,结果为阴性。结论 此次分离到的白喉棒状杆菌菌株不带有毒素生物结构基因,为非毒源菌株,该病例为无毒白喉棒状杆菌健康带菌者。     

细胞壁缺陷对白喉棒状杆菌Tox基因影响

目的探讨细胞壁缺陷对白喉棒状杆菌毒力基因及其表达的影响。方法以非高渗分离培养法诱导并获得产毒性白喉棒状杆菌稳定L型纯培养物，提取白喉棒状杆菌稳定L型的染色体DNA，用Tox基因特异性引物进行PCR扩增，并进行序列测定和分析。分别采用对流免疫电泳（CIEP）和十二烷基磺酸钠-不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测白喉棒状杆菌稳定L型可溶性代谢产物中的白喉毒素蛋白质。结果白喉棒状杆菌在氨苄青霉素作用下可发生细胞壁缺陷而成为L型，该稳定L型的传代培养物可仍然保留同其亲代细菌型一致的Tox基因及其核苷酸序列；但在其可溶性代谢产物中并未检测到白喉毒素蛋白质。结论白喉棒状杆菌稳定L型虽然保留了Tox基因但并不能表达白喉毒素蛋白质，提示细胞壁缺陷可影响Tox基因在宿主菌细胞内的表达。     

半套式PCR检测军团菌方法的建立及应用

目的建立检测军团菌的分子生物学方法。方法采用常规PCR对军团菌属16SrRNA编码区域和嗜肺军团菌巨噬细胞感染增强子(mip)基因编码区域进行扩增,同时采用半套式PCR对常规PCR的扩增结果进行确证。结果采用常规PCR对军团菌属16SrRNA编码区域进行扩增,5种军团菌(包括3种嗜肺军团菌)扩增产物均可见654bp的特异性扩增带,非军团菌菌株PCR结果为阴性,采用半套式PCR对常规PCR扩增产物进行验证,扩增产物均可见430bp扩增带;同时采用常规PCR对嗜肺军团菌mip基因编码区域进行扩增,3种嗜肺军团菌扩增产物均可见649bp扩增带,非嗜肺军团菌菌株均为阴性,采用半套式PCR对常规PCR扩增产物进行验证,3种嗜肺军团菌扩增产物均可见399bp扩增带。敏感性为10CFU/ml.并且应用此方法成功检测环境水样中分离的疑似军团菌菌株。结论半套式PCR经济、简便、快速、敏感、特异,为军团菌的早期检测、环境监测、控制暴发流行提供了有效手段。     

激活蛋白-1与p53基因启动子结合的染色质免疫沉淀技术分析

目的 检测肺腺癌A549细胞内的转录因子激活蛋白-1(AP-1)与p53基因调控区的结合情况.方法 采用染色质免疫沉淀技术,用c-jun特异性抗体沉淀DNA,聚合酶链反应(PCR)技术检测p53基因5'端特异性序列.结果 在c-jun特异性抗体免疫沉淀的DNA片段中扩增出p53 5'端的特异性序列.结论 AP-1在A549细胞内结合于p53基因的调控区,参与该基因的表达调控.     

多重半套式聚合酶链反应在检测脑脊液病原菌中的应用

目的：建立多重半套式聚合酶链反应（PCR）快速检测脑脊液标本中常见的病原菌。方法：通过对病原菌16S rRNA基因保守区和变异区的序列分析，设计通过引物及革兰阴性菌、革兰阳性菌的特异性引物，分别作为外、内侧引物，对脑脊液标本中不同细菌的DNA进行多重半套式PCR扩增；同时与常规细菌培养法作比较，并检测了该方法的敏感性。结果：外侧扩增后革兰阳性菌、革兰阴性菌经扩增后均有长约1032bp的片段产生；内侧扩增两种细菌除1032bp的产物外，革兰阳性菌另有一336bp的特异性产物，革兰阴性菌另有一127bp的特异性产物。该方法最低可检测出8cfu/ml的大肠埃希菌；62份脑脊液标本扩增结果与培养法相比，敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预没值分别为93．8％、5．7％、88．2％、97．8％。结论：多重半套式PCR方法能特异、敏感、快速地检测出脑脊液感染的常见病原菌。     

大肠杆菌O157特异基因的PCR检测方法

目的：建立一种灵敏、特异的检测肠出血性大肠杆菌O157的PCR方法。方法：针对大肠杆菌O157特异性基因rfbO157设计引物，扩增-497bp的O157标识序列。结果：应用该PCR反应体系，对4株O157菌株和14株非O157菌株扩增结果表明，O157菌株均扩增出预期的497bp片段，14株非O157菌株则为阴性。纯菌液检测灵敏度为60cfu／PCR反应，模拟混合菌液检测灵敏度为400cfu／PCR反应。结论：该方法用于肠出血性大肠杆菌O157的检测鉴定简便、快捷，具有很高的特异性和灵敏度，为O157的临床辅助诊断提供了有力手段。     

人感染2型猪链球菌快速多重PCR检测方法的建立

目的：用多重PCR从临床标本中同时检测猪链2型特异性及5个毒力相关基因，建立SS2实验室快速诊断及应急检测的核酸鉴定方法。方法：根据已报告的引物序列设计并合成8对引物（含1对内对照引物），经过PCR反应条件的优化与组合，采用同一PCR反应条件与循环程序，直接从临床标本或培养物中同时一次性扩增属特异性（tuf）、种特异性（16S rRNA）、荚膜多糖（cps2J）、溶菌酶释放蛋白（mrp）、细胞外蛋白因子（ef）、溶血素（sly）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（gapdh）等基因；并对方法的特异性和敏感性进行评估。结果：运用所建立的方法可直接从临床疑似猪链感染患者的脑脊液、血液、双相培养液和血培养物中一次性扩增出上述8对引物的目的基因，并经基因序列分析、细菌分离培养和生化鉴定进一步证实。其敏感性为78cfu（克隆形成单位）。结论：所建立的方法具有敏感、特异、快速、简便的特点，可应用于SS2感染应急检测、流行病学监测和实验室快速诊断。     

SARS冠状病毒M蛋白基因的克隆、鉴定及原核表达载体的构建

目的 通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增SARS冠状病毒M蛋白基因,并构建M蛋白基因的原核表达载体,为进一步研究其功能做准备。方法 提取SARS冠状病毒总RNA,通过RT-PCR对其M蛋白基因进行扩增,并构建M蛋白基因的原核表达载体。结果 获得了SARS冠状病毒M蛋白基因的编码序列并将其克隆入原核表达载体pEq30a。结论 成功构建SARS冠状病毒M蛋白基因的重组表达质粒,为进一步研究打下基础。     

梅毒螺旋体荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立梅毒螺旋体的荧光定量PCR检测方法。方法依据梅毒螺旋体（Treponema pallidum,TV）DNA多聚酶I（polA）基因序列,设计MGB—Taqman探针和PCR引物,对TPPA法检测到的不同国家和人种梅毒螺旋体抗体阳性患者和阴性人员血液样本进行检测,验证该PCR方法的灵敏度和特异性,以及2种检测方法的一致性。结果PCR产物测序证实新建的荧光PCR方法可以扩增到梅毒螺旋体polA基因区200bp长DNA片段。该方法特异性强、灵敏度高,可检出每微升血液中10拷贝梅毒DNA。在31例TPPA法检测结果为阳性的样本中,有21例为PCR阳性。证明其中10例TPPA法阳性为非现行感染,可能不具有传染性。统计分析表明该荧光PCR方法与TPPA方法对不同国家和种族人群检测结果未出现显著差异。结论新建的荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性好,可排除TPPA法阳性梅毒患者中非现行感染的旅行者,是适用于不同地区和种族的旅行者进行梅毒检测的新方法。