Recombinant human-mouse chimeric monoclonal antibody specific for human adenocarcinoma associated antigen

We have recently described a class-switched (IgM to IgG1) human-mouse chimeric antibody. In the present study, a human-mouse chimeric antibody specific for human adenocarcinoma-associated antigen YH206 antigen was constructed by fusing murine variable region genes (V kappa and VH) to human constant region genes (gamma 1, kappa). The murine variable domain genes were isolated from a functional murine hybridoma cell line, YH206, which secreted IgM monoclonal antibody specific for YH206 antigen. The fusion genes of heavy and light chains were introduced into the immunoglobulin non-producing mouse myeloma cell line X63-Ag8.653 by electroporation. We obtained transformants which secreted class-switched human-mouse chimeric antibodies specific for YH206 antigen. A dot immunobinding assay demonstrated that the class-switched chimeric antibody retained the ability to bind to the YH206 antigen.     

抗人CD40人-鼠嵌合抗体的构建及其表达

目的:通过基因工程抗体改造技术构建并表达抗人CD40人-鼠嵌合抗体。方法:从分泌鼠抗人CD40单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株(5C11)中提取总RNA,用一对特异性引物通过RT-PCR扩增mAbVH和VL的DNA编码区基因。根据序列分析的结果,设计引物扩增VH和VL基因相应的信号肽序列。利用基因重组技术,将mAb5C11的VH、VL基因及其相应信号肽序列与人IgG1的CH基因、Cκ链基因进行拼接,构建人-鼠嵌合抗体基因的表达质粒pIRES/h5C11。用脂质体法将其导入293T细胞株中进行瞬时表达。利用流式细胞术对表达产物进行鉴定。结果:NCBI基因数据库Blast的结果显示,克隆的基因序列符合小鼠VH、VL基因及其信号肽序列的特征。表达质粒pIRES/h5C11的构建正确,并在293T细胞株中获得瞬时表达。表达的抗人CD40的人-鼠嵌合抗体和mAb5C11具有相同的抗原结合位点。结论:成功地克隆了鼠抗人CD40mAbV区编码基因,并实现了可溶性抗人CD40的人-鼠嵌合抗体在293T细胞中的瞬时表达。     

抗人肺癌mAbLC-1的人-鼠嵌合Fab片段基因表达质粒的构建与表达

目的表达抗人肺癌单克隆抗体(mAb)LC 1的人 鼠嵌合基因工程抗体。方法将mAbLC 1的VL 和VH 基因插入质粒 pWS1 中 ,构建成表达mAbLC 1人 鼠嵌合Fab片段基因的质粒pLC 1 ,转化大肠杆菌TG 1并在其中表达。结果酶切鉴定表明 ,mAbLC 1的VL 和VH 基因插入方向正确 ,该载体能在大肠杆菌TG1中表达预期相对分子质量的蛋白 ,表达产物对mAb具有较强的竞争结合抗原的活性。结论成功地表达了具有较高亲和活性的人 鼠嵌合抗人肺癌的基因工程抗体。     

抗人小细胞肺癌单抗2F7人-鼠嵌合Fab片段基因的构建和表达

目的：通过基因工程抗体改造获得具有与人小细胞肺癌有特异性反应的人－鼠嵌合抗体2F7 Fab片段，方法：采用RT－PCR技术从抗人小细胞肺癌单克隆抗体2F7杂交瘤中克隆该抗体的重，轻链可变区基因，将2F7单抗的重，轻链可变区基因装入带有人恒定区基因的表达载体pSW1-Fab中，构建得到pSW1-2F7 Fab，转化受体菌E.coil XL1-Blue,IPTG诱导表达，经Western blot和ELISA鉴定表达蛋白的活性。结果：从抗人小细胞肺癌单克隆抗体2F7杂交瘤中克隆获得了抗体重、轻链可变区基因，测序证实2F7单抗的重链（VH）可变区基因全长362bp，编码120个氨基酸，轻链（VL）可变区基因全长319bp，编码105个氨基酸，构建的2F7人－鼠嵌合Fab表达载体诱导后获得了目的蛋白的表达，主要分泌在菌液的上清中，表达量较高且稳定，具有与NCI－H128细胞特异性结合的活性。结论：构建和表达了抗人小细胞肺癌单抗2F7人－鼠嵌合Fab片段，表达产物具有与抗原结合的特异性，为进一步研究和应用打下了基础。     

人-鼠嵌合抗体表达载体的构建和抗人HER2抗体的表达

目的 :构建表达人 鼠嵌合抗体的通用真核表达载体 ,用于以嵌合抗体的形式表达PCR获取的小鼠抗体可变区基因 ,以便将人 鼠嵌合抗体应用于临床治疗。方法 :用人Tac抗原信号肽以及人IgCκ基因和γ1CH基因 ,构建人 鼠嵌合抗体的表达载体 ,并转染真核细胞 2 93T进行表达。用RT PCR、FACS和ELISA进行抗体表达的鉴定。结果 :利用人Tac抗原信号肽以及人IgCκ基因和γ1CH基因 ,构建了用于表达人 鼠嵌合抗体的通用真核表达载体。用本研究设计的引物 ,扩增小鼠抗人HER2抗体的V区基因片段 ,酶切后先后插入所构建的载体的相应克隆位点 ,转染 2 93T细胞可将PCR获得的小鼠抗体V区基因片段表达为人 鼠嵌合抗体。用RT PCR、FACS和ELISA证实 ,本系统可表达嵌合抗体。结论 :构建了人 鼠嵌合抗体的真核表达载体 ,并证实了其可在 2 93T细胞中表达。     

抗人肝癌基因工程嵌合Fab抗体的原核表达及复性

目的　分别在大肠杆菌中高效表达嵌合Fd及嵌合轻链 ,并进行嵌合Fab复性的研究。方法　分别将嵌合Fd及嵌合轻链基因插入到原核表达载体pET32a中 ,构建成重组载体pET32a/cFd和pET32a/cL。转化大肠杆菌后诱导其表达。大量制备表达的嵌合Fd及嵌合轻链后 ,按二者绝对量等摩尔比混合后进行透析复性。然后 ,分别利用SDS PAGE、Westernblot和ELISA进行分析和鉴定。结果　成功获得了嵌合Fd及嵌合轻链的原核非融合高效表达 ,表达蛋白相对分子质量 (Mr)均在 2 4×10 3 左右。表达量分别约占菌体总蛋白的 2 8.3%和 32 .3% ,2种目的蛋白均主要以不溶性的包涵体形式存在。另外 ,嵌合Fd与嵌合轻链在缓慢透析的条件下成功地复性为嵌合Fab抗体 ,Mr 约为 4 2×10 3 ,具有特异性抗原结合活性和良好的亲和力。在起始总蛋白浓度为 10 0 μg/ml时 ,复性效率约为4 9 %。结论　成功实现了嵌合Fab抗体的高效表达及高效复性 ,为进一步探讨其在肝癌治疗中的应用奠定了基础     

抗人CD25嵌合抗体基因的构建及其瞬时表达研究

目的:构建抗人CD25嵌合抗体基因并在哺乳动物细胞中进行瞬时表达和初步鉴定。方法:采用RLM-RACE法克隆WuTac抗体可变区和信号肽序列,并利用基因拼接法构建嵌合抗体基因。用脂质体法瞬时转染三种哺乳动物细胞,并使用ELISA、FCM、WB、Dot blot和免疫荧光法进行检测。结果:成功克隆WuTac抗体可变区和信号肽序列,并构建了抗人CD25嵌合抗体表达质粒。瞬时转染结果表明所表达的嵌合抗体保留了亲本抗体WuTac的抗原结合力。结论:成功构建了抗人CD25嵌合抗体基因,为其进一步研究打下基础。     

基孔肯亚病毒人鼠嵌合抗体在CHO细胞中的表达和活性研究

目的　在CHO细胞中表达基孔肯亚病毒人 鼠嵌合抗体 ,并对其活性进行分析。方法以质粒pcDNA5 /FRT为骨架 ,应用pCI dhfr1(本室构建并保存 )的dhfr基因和hCMV启动子及SV4 0polyA ,构建了含有共扩增基因的哺乳动物双启动子表达载体 ,RT PCR克隆具有中和活性鼠源单克隆抗体的轻重链可变区基因 ,与人IgG1轻重链恒定区基因融合后亚克隆到表达载体pA的多克隆位点 ,构建了表达质粒pA HL ,脂质体转染CHO(dhfr )细胞 ,撤掉胸腺嘧啶和次黄嘌呤并不断提高MTX的浓度 ,筛选表达量高的克隆 ,扩大培养、收集上清 ,并纯化 ,纯化的嵌合抗体进行SDS PAGE、Western印迹、抗原结合活性和微量细胞中和实验。结果　在MTX的浓度为 2× 10 -7mol/L时 ,获得稳定表达细胞株 ,表达量为 5mg/L。结论　成功地在CHO(dhfr )细胞表达了具有中和活性的基孔肯亚病毒人 鼠嵌合抗体 ,为制备抗基孔肯亚病的被动免疫制剂奠定了良好的基础。     

抗人肝癌单克隆抗体嵌合Fab在巴氏毕赤酵母中的高效分泌表达

目的:通过分步整合,用巴氏毕赤酵母表达抗人肝癌单克隆抗体(mAb)HAb18的嵌合Fab(cFab)片段。方法:将抗人肝癌mAbcFab/HAb18基因的原核表达载体pET32a/cFab中的CL和Fd段基因,分别亚克隆到酵母表达载体pPIC9K和pPICZαA中,构建重组质粒pPIC9K/CL和pPICZαA/Fd并测序鉴定。将重组质粒pPIC9K/CL和pPICZαA/Fd分步整合到酵母菌GS115的染色体上,经G418和Zeocin筛选高拷贝的转化子及鉴定Mut表型后,用含5mL/L甲醇的培养基诱导表达。结果:成功地表达抗人肝癌mAbHAb18的cFab,表达水平为26mg/L。Westernblot鉴定证实,表达产物具有良好的与HAb18结合的活性和特异性。结论:cFab/HAb18在巴氏毕赤酵母获得表达,为对其进一步大规模的生产和临床应用奠定了基础。     

抗炭疽保护性抗原人-鼠嵌合抗体在CHO细胞中的表达和活性研究

目的 在CHO细胞中表达抗炭疽芽孢杆菌保护性抗原(rPA)人-鼠嵌合抗体,并对其活性进行分析.方法 RT-PCR克隆具有中和活性鼠源单克隆抗体的轻、重链可变区基因,分别与人Kappa型轻链恒定区、IgG1重链恒定区基因融合后构建了轻重链嵌合抗体基因.将轻重链嵌合抗体基因克隆表达载体上,构建了嵌合抗体的双启动子表达载体pSeeTag-5E1.将pSecTag-5E1转染CHO-dhfr(DG44)细胞,撤掉胸腺嘧啶和次黄嘌呤并不断提高氨甲蝶呤(MTX)的浓度,筛选表达量高的克隆,扩大培养,收集上清,并纯化,用纯化的嵌合抗体进行SDS-PAGE、Western blot、抗原结合活性、体外细胞保护试验和动物试验.结果 在MTX的浓度为5×10~(-8)mol/L时,获得稳定表达细胞株,表达量为18 mg/L.结论 成功在CHO-dhfr(DG44)细胞中表达了具有中和活性的抗rPA人-鼠嵌合抗体,为制备抗炭疽的被动免疫制剂奠定了良好的基础.     

嵌合抗CD20抗体Fab片段在大肠杆菌中表达及活性鉴定

目的 :构建抗CD2 0 嵌合抗体Fab片段表达载体 ,并在大肠杆菌中进行高效可溶性分泌表达。方法 :利用PCR方法从抗CD2 0 单链抗体 (ScFv)表达载体上扩增抗CD2 0 抗体轻链可变区基因 (VL)、重链可变区基因 (VH) ,然后将VH、VL 基因重组到Fab表达载体pYZF中 ,构建抗CD2 0 Fab表达载体pYZF1cd2 0 ,并在 2 7C7菌中高效表这。结果 :经Fab表达载体转化的 2 7C7菌株 ,进行表达培养 ,经分离纯化获得具有CD2 0 特异结合活性的Fab片段 ,竞争性免疫荧光抑制实验表明 ,表达产物Fab片段能竞争性抑制鼠源性抗CD2 0 抗体HI47和CD2 0 表达细胞Raji细胞结合。结论 :在大肠杆菌中高效可溶性分泌表达有活性的抗CD2 0 嵌合抗体Fab片段。     

用定点整合系统表达抗基孔肯亚病毒人-鼠嵌合抗体的研究

目的:构建含有FRT序列的CHO/dhfr-工程细胞株,并在此细胞株中用定点整合系统表达抗基孔肯亚病毒人鼠嵌合抗体。方法:首先克隆FRT序列与HBsAg的融合基因FRT-HBsAg,然后将FRT-HBsAg亚克隆到pCI neo的MCS中,构建表达载体pCI FRT-HBsAg。以此载体转染CHO/dhfr-细胞,用1g/L的G418筛选抗性克隆。检测抗性克隆HBsAg的表达,筛选表达量高的克隆作为宿主细胞株,命名为CHO/dhfr-FRT+。将表达质粒pA FRTHFLF和pOG44以1∶9的质量比混合,取2μg转染CHO/dhfr-FRT+。转染48h后,换选择培养基(撤掉H、T)用96孔板进行克隆化,2wk后对长成的单克隆进行检测。筛选正确整合到CHO/dhfr-FRT+细胞中FRT位点的克隆,并不断提高MTX的浓度,进一步筛选表达量更高的克隆。在MTX的浓度为2×10-7mol/L时,获得稳定表达细胞株,其最后的表达量为5mg/L。对此细胞株扩大培养后,收集上清并纯化,以纯化的嵌合抗体进行SDS-PAGE及Westernblot和抗原结合活性的检测。结果:构建了高转录活性位点整合FRT序列的CHO/dhfr-细胞株,并在此细胞株中表达抗基孔肯亚病毒人鼠嵌合抗体,表达量为5mg/L。结论:构建了含有FRT序列的CHO/dhfr-工程细胞株,并在此细胞株中用定点整合系统表达抗基孔肯亚病毒人鼠嵌合抗体,为用此系统表达抗体分子和其他蛋白分子奠定了基础     

Induction of specific immunity to human colon carcinoma by anti-idiotypic antibodies to monoclonal antibody CO17-1A

Anti-idiotypic antibodies (Ab2) to murine monoclonal antibody (mAb) CO17-1A (Ab1), which defines an antigen associated with human colon carcinoma, were produced in goats. The Ab2 inhibited binding of Ab1 to colon carcinoma cells, and purified tumor antigen inhibited binding of Ab1 to Ab2. The Ab2 elicited in rabbits anti-anti-idiotypic antibodies (Ab3) that bound to cultured human cells of various tissue origins with a binding pattern identical to that of Ab1. Moreover, both Ab1 and Ab3 bound to the isolated tumor antigen, and the Ab3 lysed human colon carcinoma cells in culture in the presence of rabbit complement. Thus, Ab2 raised to mAb CO17-1A are candidates for use in immunotherapy trials in cancer patients.     

Generation of a neutralizing human monoclonal antibody Fab fragment to surface antigen 1 of Toxoplasma gondii tachyzoites

A combinatorial immunoglobulin gene library was constructed from lymphocytes in peripheral blood of a patient with toxoplasmosis and screened for production of human monoclonal antibody Fab fragments to recombinant surface antigen 1 (SAG1) of Toxoplasma gondii. Two Fab clones, Tox203 and Tox1403, which consisted of a common heavy chain and different light chains, showed positive staining on the entire surface of tachyzoites in confocal microscopy. Sequence analysis of the heavy-chain gene revealed that the closest germ line V segments were VH3-23. The germ line D segment was D1-7, and the closest germ line J segment was JH4. In the light-chain genes, the closest germ line V segment was Vκ1-17 with the Jκ1 or Jκ4 segments. The dissociation constants of these Fab fragments with recombinant SAG1 were 3.09 × 10(-9) M for Tox203 and 2.01 × 10(-8) M for Tox1403, indicating that the affinity of Tox203 was 7 times higher than that of Tox1403. Preincubation of T. gondii tachyzoites with Tox203 significantly inhibited their attachment to cultured MDBK cells. Passive immunization of mice with Tox203 also significantly reduced mortality after challenge with T. gondii tachyzoites. This is the first report of bacterial expression of human monoclonal antibody Fab fragments to SAG1 of T. gondii. These results also demonstrate that human Fab fragments to SAG1 might be applicable for immunoprophylaxis of toxoplasmosis.     

Modification of a human monoclonal antibody Fab fragment specific for Plasmodium falciparum 19-kDa C-terminal merozoite surface protein 1 by site-directed mutagenesis

We recently produced human monoclonal antibody Fab fragments specific for the 19-kDa C-terminal merozoite surface protein 1 of Plasmodium falciparum in a bacterial expression system. The effect of single amino acid modifications in the third complementarity-determining regions of the heavy and light chains on affinity was examined in one of the Fab fragments, Pf25. Recombination polymerase chain reaction was used to modify Tyr(92) or Ile(97) in the light chain and Val(101) or Trp(107) in the heavy chain. No effective replacements for Tyr(92) and Val(101) were found, but possible substitutions of Ile(97) with Gly, Leu, Glu, Ala and Ser, and of Trp(107) with Arg and Ser were demonstrated. Of these modified Fab fragments, the affinities of Fabs with Ile(97)-Leu and Trp(107)-Ser mutations were slightly higher than that of the original Fab. The effects of these modifications on the antigen-antibody interaction are discussed.     

Molecular profile of a human monoclonal antibody Fab fragment specific for Epstein-Barr virus gp350/220 antigen

Experimental evidence indicates Epstein Barr virus (EBV) envelope glycoprotein gp350/220 elicits a potent virus neutralizing response in the infected human host that may play an important role in restricting viral pathogenesis. In this study, we report the molecular cloning in combinatorial phage display vectors, of the IgG1 repertoire of an individual naturally infected with EBV, and describe the recovery and characterization of a monoclonal antibody recognizing gp350/220. A detailed understanding of the human antibody response in EBV infection will identify antibodies of potential use in anti-viral prophylaxis and will advance the production of more effective vaccine candidates.     

嵌合抗CD20抗体Fab片段在大肠杆菌中的表达及活性鉴定

目的：构建抗ＣＤ２０嵌合抗体Ｆａｂ片段表达载体,并在大肠杆菌中进行高效可溶性分泌表达。结果：利用ＰＣＲ方法从抗ＣＤ２０单链抗体（ＳｃＦｖ）表达载体上扩增抗ＣＤ２０抗体轻链可变区基因（ＶＬ）、重链可变区基因（ＶＨ）,然后将ＶＨ、ＶＬ基因重组到Ｆａｂ表达载体ｐＹＺＦ中,构建抗ＣＤ２０Ｆａｂ表达载体ｐＹＺＦ１ｃｄ２０,并在２７Ｃ７菌中高效表达。结果：经Ｆａｂ表达载体转化的２７Ｃ７菌株,进行表达培养,经分