低频超声联合微泡影响前列腺癌DU145细胞血管内皮细胞生长因子表达的实验研究

目的探讨低频超声联合微泡对前列腺癌DUl45细胞血管内皮细胞生长因子（VEGF）表达的影响。方法体外培养前列腺癌DUl45细胞,细胞呈对数生长时分为4组进行实验：对照组（细胞悬液1ml）、单纯微泡组（800μl细胞悬液加入200μl微泡剂SonoVue）、单纯低频超声组（1ml细胞悬液以频率80kHz、声强0．45W／cm2超声辐照30S）、低频超声联合微泡组（800μl细胞悬液加入200μl微泡剂SonoVue后立即以频率80kHz、声强0．45W／cm2超声辐照30s）。MTT法检测细胞存活率,流式细胞术检测凋亡率,Western印迹法检测细胞VEGF蛋白的表达。采用单因素方差分析比较对照组、单纯微泡组、单纯低频超声组、低频超声联合微泡组细胞存活率、凋亡率、VEGF蛋白表达量差异,进一步组间两两比较采用SNK-q检验。结果对照组、单纯微泡组、单纯低频超声组、低频超声联合微泡组细胞存活率分别为100％、（96．50±12．49）％、（93．20±5.31）％、（81．30±9．32）％;凋亡率分别为（1．10±0．26）％、（1．78±0．63）％、（5．85±0．45）％、（9．36±0．90）％;VEGF蛋白表达量分别为0．81±0．05、0．79±0．06、0．58±0．04、0．38±0．05。单纯微泡组、单纯低频超声组细胞存活率与对照组比较差异均无统计学意义,低频超声联合微泡组细胞存活率较对照组降低,且差异有统计学意义（q=5．88,P〈0．05）。单纯微泡组细胞凋亡率、VEGF蛋白表达量与对照组比较差异均无统计学意义;单纯低频超声组、低频超声联合微泡组细胞凋亡率均高于对照组,VEGF蛋白表达量均低于对照组,且差异均有统计学意义（q=14．09、24．51、8．06、14．89,P均〈0．05）。低频超声联合微泡组细胞凋亡率高于而VEGF蛋白表达量低于单纯低频超声组,且差异亦均有统计学意义（q=10．42、6．83,P均〈0．05）。结论微泡能增强低频超声抑制前列腺癌DUl45细胞增殖及促进凋亡,其机制可能与其下调前列腺癌DUl45细胞VEGF表达有关。     

正交设计法优化超声联合微泡诱导人前列腺癌细胞凋亡的研究

目的采用正交实验设计,探讨超声联合微泡诱导人前列腺癌细胞的凋亡的最优参数组合。方法选定超声功率、辐照时间、微泡/细胞悬液体积比三个因素,又分别按超声功率15、20、25、30 mW/cm2,辐照时间30、60、90、120 s和微泡/细胞悬液体积比10%、20%、30%、40%,每因素四个水平设定正交设计表,按正交设计表进行超声辐照,辐照后细胞继续培养24 h,用流式细胞仪进行细胞凋亡检测。结果对细胞凋亡的影响因素,超声功率>微泡/细胞悬液体积>辐照时间;各因素水平影响:超声功率:15 mW/cm2>25 mW/cm2>20 mW/cm2>30 mW/cm2,辐照时间:30 s>60 s>120 s>90 s,微泡/细胞悬液体积:20%>10%>30%>40%。结论超声联合微泡诱导人前列腺癌细胞凋亡最佳组合为超声功率15 mW/cm2,辐照时间30 s,微泡/细胞悬液体积比20%。     

正交优化低频低功率超声联合微泡诱导前列腺癌DUl45细胞早期凋亡的实验研究

目的采用正交实验设计法,优化低频（20kHz）低功率超声联合微泡诱导人雄激素非依赖型前列腺癌DUl45细胞早期凋亡的条件。方法以超声功率、微泡／细胞悬液体积比及超声辐照时间为正交优化的3个因素,每个因素设定3个水平,分别为超声功率60、80、100mW,微泡／细胞悬液体积比10％、20％、30％,超声辐照时间30、60、90S,根据三因素三水平设计正交实验表,得到9个实验组,按相应条件采用连续波辐照,辐照后细胞继续培养24h,采用流式细胞术检测细胞早期凋亡。应用正交优化得到的最优组合条件超声辐照实验组DUl45细胞,对照组细胞不予超声辐照,采用流式细胞术、透射电镜检测、观察实验组及对照组细胞早期凋亡。结果3个因素对细胞早期凋亡的影响程度为：超声功率〉微泡／细胞悬液体积比〉超声辐照时间。各个因素不同水平对细胞早期凋亡的影响程度分别为：超声功率：80mW〉60mW〉100mW,微泡／细胞悬液体积比：20％〉30％〉10％,超声辐照时间：60S〉90S〉30S。最优组合条件下,实验组细胞早期凋亡率为10．41％,对照组细胞早期凋亡率为O．94％。透射电镜下可见实验组细胞较对照组细胞的体积变小变圆,空泡增多,可见明显的凋亡小体形成。结论低频超声联合微泡诱导人雄激素非依赖型前列腺癌DUl45细胞早期凋亡的最优组合条件为：超声功率80mW,微泡／细胞悬液体积比20％,超声辐照时间60S。在此条件下实验组早期细胞凋亡率与对照组相比有明显差异。     

低频超声辐照联合微泡抑制裸鼠人前列腺癌移植瘤的实验研究

目的 观察低频超声(20 kHz)辐照联合静脉注射微泡造影剂SonoVue对裸鼠人前列腺癌Du145移植瘤的抑瘤效应,并探讨其可能的抑瘤机制.方法 通过细胞移植和瘤块移植方法建立24只裸鼠人前列腺癌Du145移植瘤模型,随机分为超声微泡组、单纯超声组、单纯微泡组和对照组,每组6只.超声微泡组:尾静脉注射0.2 mL SonoVue的同时对瘤体行20 kHz超声辐照,辐照强度2 W/cm2,辐照2 min;单纯超声组:尾静脉持续缓慢推注生理盐水0.2 mL,同时超声辐照2 min;单纯微泡组:尾静脉持续缓慢推注SonoVue 0.2 mL同时行假照;对照组不做任何处理.各组均隔天治疗1次,共3次.治疗后测量瘤体大小,绘制瘤体生长曲线,计算抑瘤率.首次治疗后14 d剥离瘤体,通过光镜、电镜观察肿瘤组织病理改变.免疫组织化学法观察CD34阳性染色血管,计算肿瘤微血管密度(MVD),比较各组间MVD的差异.结果 24只裸鼠均成功植瘤.治疗后超声微泡组瘤体体积明显小于其他各组(P＜0.05),抑瘤率为62.70%.HE染色观察超声微泡组瘤体组织大部分损伤坏死,电镜下超声微泡组肿瘤内微血管的内皮细胞损伤,线粒体肿大,基底膜断裂.超声微泡组瘤体内CD34阳性染色微血管数减少,其MVD值显著低于其他各组(P＜0.05).结论 20 kHz低频超声辐照联合微泡造影剂SonoVue可有效抑制裸鼠人前列腺癌移植瘤的生长,其抑瘤机制是超声空化效应破坏肿瘤的微血管.     

低频低能量超声联合微泡抑制人前列腺癌细胞PC-3转移的研究

目的探讨低频低能量超声联合微泡抑制人前列腺癌细胞转移及分子机制。方法以频率21 k Hz、声强46 m W/cm2超声,采用连续波辐照人前列腺癌细胞PC-3悬液30 s。分为三组:对照组、单独超声辐照组及超声辐照联合微泡组(加声诺维200μl)。辐照后培养12 h,Transwell小室模型进行细胞体外转移实验,western-blot检测其基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达。结果辐照后12 h,与对照组比较,单独超声辐照组及超声辐照联合微泡组细胞转移数量受到抑制,并且以超声辐照联合微泡组受到抑制最明显(均P0.05);细胞辐照24 h后,与对照组比较,单独超声辐照组及超声辐照联合微泡组MMP-2及MMP-9蛋白表达明显受到抑制,并且以超声辐照联合微泡组最为明显(均P0.05)。结论低频超声联合微泡能够抑制人前列腺癌细胞PC-3的转移,并且可能通过下调MMP-2、MMP-9蛋白表达来实现。     

超声微泡介导血管内皮生长因子反义寡核苷酸抑制裸鼠膀胱肿瘤

目的 探讨利用超声辐照微泡造影剂介导血管内皮生长因子(VEGF)-反义寡核苷酸(ASODN)对人膀胱癌裸鼠移植瘤的抑制效应. 方法 建立人膀胱癌裸鼠皮下移植瘤模型后,将24只成瘤裸鼠随机分为4组:UM+ASODN组每只裸鼠尾静脉注射微泡造影剂与VEGF-ASODN混合物,并对移植瘤体用超声波进行辐照;脂质体+ASODN组每只裸鼠尾静脉注射VEGF-ASODN与脂质体混合物;UM组每只裸鼠尾静脉注射微泡造影剂并以同样的条件进行体外超声辐照;单纯对照组每只裸鼠尾静脉注射生理盐水,各组处理每隔2 d进行一次,共计5次.观察裸鼠移植瘤生长情况,免疫组化SP法测Ki67、CD34、VEGF的表达,计算微血管密度、细胞增殖指数,TUNEL法测细胞凋亡指数. 结果 UM+ASODN组裸鼠皮下肿瘤生长速度较对照组明显减慢,肿瘤组织VEGF的表达及微血管密度较对照组降低(P＜0.05);与对照组相比,UM+ASODN组肿瘤细胞的凋亡增加(P＜0.01),而细胞增殖减少(P＜0.05). 结论 超声微泡介导的VEGF-ASODN转染能有效抑制膀胱癌裸鼠皮下移植瘤.     

微泡增强低频超声空化抑制裸鼠前列腺癌移植瘤

目的观察低频超声（20kHz）辐照联合静脉注射微泡造影剂SonoVue对裸鼠前列腺癌（Dul45）移植瘤的抑瘤效应,并探讨其可能的抑瘤机制。方法通过细胞移植和瘤块移植方法建立24只裸鼠前列腺癌Dul45移植瘤模型,随机分为超声微泡组、单纯超声组、单纯微泡组和对照组,每组各6只。超声微泡组：尾静脉注射0．2mLSonoVue的同时对瘤体行20kHz超声辐照,辐照强度200mW／cm2;单纯超声组：尾静脉注射生理盐水0．2mL,同时超声辐照2min;单纯微泡组：尾静脉注射SonoVue0．2mL同时行假照,各组均隔天1次,共3次,对照组不做任何处理。治疗后测量瘤体大小,绘制瘤体生长曲线,计算抑瘤率。首次治疗后14d剥离瘤体,通过光学显微镜、电子显微镜观察肿瘤组织病理改变。免疫组织化学方法观察CD34阳性染色血管,计算肿瘤微血管密度（microvesseldensity,MVD）,比较各组间MVD的差异。结果24只裸鼠均成功植瘤。治疗后超声微泡组瘤体体积均数明显小于其他3组（P〈O．05）,抑瘤率为62．7％。光学显微镜下超声微泡组瘤体组织大部分损伤坏死,电子显微镜下超声微泡组肿瘤内微血管的内皮细胞损伤,线粒体肿大,基底膜断裂。超声微泡组瘤体内CD34阳性染色微血管数减少,其MVD值显著低于其他各组。结论20kHz低频超声辐照联合微泡造影剂SonoVue可有效抑制裸鼠人前列腺癌移植瘤的生长,其抑瘤机制可能是通过超声空化效应破坏肿瘤的微血管实现的。     

低频超声辐照联合微泡对血管平滑肌细胞凋亡的影响

目的观察低频超声辐照联合微泡对体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞凋亡的影响。方法联合不同浓度的SonoVue(0、0.5×106、1.0×106、1.5×106、2.0×106/mL),使用42.6kHz超声分别辐照大鼠主动脉平滑肌细胞10s、20s、30s,空白对照组不作任何处理。台盼蓝染色分析辐照后即刻细胞存活率,流氏细胞仪观察辐照后24h细胞凋亡率。结果细胞的死亡和凋亡与微泡浓度及辐照时间相关。当超声波在微泡浓度达到或超过0.5×106/mL,联合辐照30s,以及微泡浓度达到2.0×106/mL,联合辐照10s、20s时,细胞大量死亡。在超声辐照10s时,辐照后24h细胞凋亡率随微泡浓度的增加而增加,但在微泡浓度低于1.0×106/mL时,细胞即刻存活率并无显著减少。在超声辐照20s时,细胞即刻存活率随微泡浓度的增加而减少,辐照后24h细胞凋亡率在微泡浓度为0.5×106/mL、1.0×106/mL、1.5×106/mL时差异无统计学意义。结论在一定空化强度范围内,低频超声辐照后24h细胞凋亡率随强度增加而增加,但超过一定程度,则无法增加细胞凋亡率,只会导致细胞死亡。低频超声辐照联合微泡的空化作用可在短时间内诱导体外培养的大鼠血管平滑肌细胞凋亡。     

低频超声联合微泡造影剂诱导人前列腺癌PC3细胞及DU145细胞自噬的实验研究

目的：研究低频超声联合微泡造影剂对人雄激素非依赖性前列腺癌PC3细胞及DU145细胞自噬的影响。方法2种细胞均各分为空白对照组、单纯微泡组、单纯低频超声组和低频超声联合微泡组4组,每组设3个复孔。单纯微泡组加200μl的微泡造影剂混匀,不进行超声辐照;单纯低频超声组以声功率80 mW的20 kHz低频超声,不加造影剂,连续波辐照60 s;低频超声联合微泡组加200μl的微泡造影剂,混匀后以声功率80 mW的20 kHz低频超声,连续波辐照60 s;空白对照组不进行任何处理,辐照后的细胞继续培养24 h,吖啶橙染色荧光显微镜与透射电镜观察细胞自噬泡。结果经吖啶橙染色后,荧光显微镜下,2种细胞低频超声联合微泡组的胞质内可见大量红色荧光的酸性囊泡,明显多于其余3组;单纯低频超声组红色荧光的酸性囊泡量亦多于空白对照组,空白对照组与单纯微泡组红色荧光的酸性囊泡量差异不大。透射电镜下,2种细胞的低频超声联合微泡组细胞细胞核基本正常,但胞质内出现大量由双层膜包裹的自噬泡或自噬体,而空白对照组内的细胞形态基本正常,胞质内未见到明显的自噬泡的形成。结论低频超声联合微泡造影剂能明显诱导人雄激素非依赖型前列腺癌PC3细胞及DU145细胞的自噬。     

拟水平均匀设计法优化超声联合微泡促人骨髓间充质干细胞分泌SDF-1的研究

目的 采用拟水平均匀实验设计,探讨超声联合微泡促人骨髓间充质干细胞分泌SDF-1的最优参数组合。方法 选定超声辐照强度、超声辐照时间、微泡浓度三个因素,又分别按超声辐照强度 0 (对照)、0.2、0.4、0.6、0.8 W/cm2,辐照时间 0 (对照)、20、30、40、60 s,微泡浓度 0 (对照)、102、104、106、108 N/ml,每因素五个水平设计均匀设计表,根据均匀设计表U15(155) 进行超声辐照,辐照后细胞继续培养24 h,然后检测细胞存活率及细胞培养上清液中的SDF-1浓度。以较高的SDF-1浓度和较低的细胞死亡率为目标,应用多元线性回归和逐步回归分析确定最佳参数配比,并对统计分析后的优化参数再进行实验验证。结果 综合考虑各因素间关系及回归分析结果后,确定超声联合微泡促人骨髓间充质干细胞分泌SDF-1的最优参数组合为辐照强度 0.6 W/cm2,辐照时间 30 s,微泡浓度 106/ml,验证实验显示在此条件下超声辐照后 SDF-1分泌量达 551.67±40.88 pg/ml,细胞存活率达 88.51±4.03%。结论 应用拟水平均匀设计可有效优化参数条件,使超声辐照后间充质干细胞的SDF-1分泌量和细胞存活率达到相对匹配的数值。     

低频超声联合微泡造影剂增强脂质体介导pEGFP-N1基因转染体外前列腺癌细胞

目的探讨低频超声联合微泡造影剂增强脂质体介导增强型绿色荧光蛋白质粒(pEGFP-N1)转染前列腺癌细胞的可行性,并对超声微泡浓度参数进行优化。方法将前列腺癌PC-3细胞悬液分为空白对照组、超声组、微泡组、微泡+超声组、脂质体组、脂质体+微泡组、脂质体+超声组、脂质体+微泡+超声组,其中脂质体+微泡+超声组根据微泡体积浓度不同分为(0、10%、20%、30%、40%和50%)6个亚组。经超声辐照,24h后用荧光显微镜观察细胞中基因表达情况,并用流式细胞仪检测转染率。结果脂质体+微泡+超声组基因转染效率最高,与其他组比较差异均有统计学意义(P均<0.05);在脂质体+微泡+超声亚组中,微泡浓度为20%亚组基因转染率最高。结论低频超声联合微泡能有效增强脂质体介导pEGFP-N1基因在体外前列腺癌细胞中的转染率,20%是体外基因转染前列腺癌细胞的最佳微泡浓度。     

惰性气体微泡联合低频低强度超声辐照对人胰腺癌PANC-1细胞抑癌作用的实验研究

目的 探讨惰性气体微气泡联合低频低强度超声波连续辐照对人胰腺癌PANC-1细胞的抑癌作用。方法 取对数生长的浓度为1×106 /ml的人胰腺癌PANC-1单细胞悬液分成4组,具体为：空白对照组加入2 ml人胰腺癌PANC-1单细胞悬液;惰性气体微气泡组加入1600 μl人胰腺癌PANC-1单细胞悬液和400 μl惰性气体微气泡并充分混匀,使惰性气体微气泡浓度为20%;低频低强度超声波组加入2 ml人胰腺癌PANC-1单细胞悬液,再用声强0.60 W/cm2、频率1 MHz的低频低强度超声连续波连续辐照60 s;微气泡+超声波组加入1600 μl人胰腺癌PANC-1单细胞悬液和400 μl的惰性气体微气泡并充分混匀,使惰性气体微气泡浓度为20%,再以声强0.60 W/cm2、频率1 MHz的低频低强度超声连续波连续辐照60 s。采用细胞计数试剂法检测各组细胞增殖活性,应用分析型流式细胞仪测定各组细胞的凋亡情况。结果 空白对照组、惰性气体微气泡组、低频低强度超声波组、微气泡+超声波组人胰腺癌PANC-1细胞增殖活性分别为 0.9356±0.1652、1.1126±0.0738、0.3236±0.0126、0.1566±0.0137,微气泡+超声波组细胞增殖活性均低于其余各组,差异均有统计学意义（均P＜0.05）。空白对照组、惰性气体微气泡组、低频低强度超声波组、微气泡+超声波组细胞凋亡率分别为0.069±0.007、0.033±0.006、0.279±0.016、0.678±0.018,微气泡+超声波组细胞凋亡率均高于其余各组,差异均有统计学意义（均P＜0.05）。结论 惰性气体微气泡联合低频低强度超声波连续辐照能降低体外培养的人胰腺癌PANC-1细胞增殖,诱导癌细胞凋亡,具有明显的抑癌作用,为肿瘤治疗提供新的研究思路。     

低频超声联合微泡增强脂质体介导Racl—shRNA质粒转染前列腺癌细胞及对其生物学行为的影响

目的研究低频超声联合微泡增强脂质体介导的Racl-shRNA质粒转染前列腺癌PC3、DUl45细胞,并探索其对前列腺癌细胞凋亡、侵袭能力的影响。方法基础情况下Westernblot检测RWPE-1细胞、PC3细胞和DUl45细胞的Rac1蛋白表达。根据不同处理方式将细胞分为四组：PC3细胞对照组（A组）、超声加微泡联合脂质体转染PC3细胞组（B组）、DUl45细胞对照组（c组）及超声加微泡联合脂质体转染DUl45细胞组（D组）。通过蛋白质体外结合实验技术检测各组Racl蛋白的活性及表达;流式细胞仪检测各组细胞早期凋亡情况;细胞侵袭实验检测各组细胞侵袭能力。结果基础情况下前列腺癌PC3、DUl45细胞Racl蛋白表达均较正常前列腺细胞RWPE-1增加,差异均有统计学意义（均P〈0．01）;低频超声携微泡介导Rac-1shRNA质粒转染细胞后,B组Racl蛋白表达量较A组表达减少,D组表达量较C组减少,差异均有统计学意义（均P〈0．01）;早期细胞凋亡检测显示,B组高于A组,D组高于C组,差异均有统计学意义（均P〈0．01）;同期细胞侵袭力实验显示,B组穿膜细胞数少于A组,D组的穿膜细胞数少于C组,差异均有统计学意义（均P〈0．01）。结论低频超声联合微泡可促进脂质体介导的Racl-shRNA质粒转染人雄激素非依赖型前列腺癌细胞;通过抑制PC3、DUl45细胞中Racl蛋白表达可以促进癌细胞的早期细胞凋亡,同时可抑制癌细胞的侵袭能力。     

低频超声联合微泡辐照诱导肿瘤细胞凋亡的研究进展

低频超声(low-frequency ultrasound,LFUS)联合微泡(microbubbles,Mbs)辐照诱导肿瘤细胞凋亡是近年来超声医学研究的热点之一,其机制主要是微泡使低频超声空化效应明显增强,该效应从多个方面对肿瘤细胞产生影响而导致其凋亡[1]。本文对低频超声联合微泡辐照诱导肿瘤细胞凋亡的基础、机制和研究进展作一综述。一、肿瘤细胞凋亡凋亡是细胞最基本的生物学现象,在生物体的进化、     

超声辐射与微泡瞬时转染血管内皮细胞及其促血管生成的研究

目的探讨超声辐射微泡技术将血管生成素-1（Ang-1）基因瞬时转染血管内皮细胞系CRL-1730后,Ang-1的表达情况及迁移效应。 方法取对数生长期的血管内皮细胞CRL-1730,接种于6孔板,分为空白对照组、Ang-1组（10 μg/ ml）、微泡组（微泡浓度10％）、超声微泡组（Ang-1 10 μg/ ml,微泡浓度10%,超声辐射30 s）,各组培养6 h换10%胎牛血清培养基,培养至24 h收集细胞。采用RT-PCR法检测各组细胞Ang-1 mRNA表达水平,采用Western blot法检测Ang-1蛋白表达水平,选用Transwell法检测细胞迁移能力。 结果空白对照组、Ang-1组、微泡组Ang-1mRNA及蛋白表达比较,差异均无统计学意义（P&rt;0.05）,超声微泡组Ang-1mRNA及蛋白表达均明显高于其余各组（P<0.05）,且超声微泡组细胞迁移能力较其余组有明显提高（P<0.05）。 结论超声辐射微泡技术可将Ang-1基因瞬时转染入血管内皮细胞系CRL-1730,使表达Ang-1的血管内皮细胞具有更强的迁移能力。     

超声联合SonoVue微泡介导NET-1siRNA转染人肝癌细胞

目的探讨超声联合微泡造影剂介导NET-1siRNA在人肝癌细胞中的转染效果。方法将培养的HepG2细胞分为5组:A组为空白对照;B组培养瓶中仅加入NET-1siRNA;C组为加入脂质体及NET-1siRNA;D组为加入造影剂及NET-1siRNA并给予超声辐照;E组为加入脂质体、造影剂、NET-1siRNA,并给予超声辐照。之后以荧光显微镜检测NET-1siRNA转染率,RT-PCR法检测各组细胞NET-1 mRNA的基因表达,Western-Blotting法检测各组细胞NET-1表达情况,MTT检测HepG2细胞生长情况。结果与C组、D组相比,E组NET-1siRNA转染率明显提高(P<0.05);D组和E组细胞内NET-1mRNA及NET-1蛋白的表达抑制率均高于其他各组(P均<0.01),而转染后24～72hHepG2细胞增殖受到明显抑制。结论超声联合微泡造影剂能有效促进NET-1siRNA在肝癌细胞中的表达,并抑制肝癌细胞的增殖。