逆转录-聚合酶链式反应用于麻疹实验室诊断初探

为了探索对麻疹病例更好的实验室确诊方法,采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),对76例已确诊或疑似麻疹病例的咽拭子检测了麻疹病毒核酸,结果61例麻疹病例咽拭子中有32例检出阳性,检出率52.5%;8例风疹病例的咽拭子无阳性检出;麻疹、风疹IgM抗体均阴性的7例疑似病例咽拭子中,有1例检出阳性,并进一步分离到麻疹病毒.在麻疹病例中,RT-PCR阳性检出率随病例出疹天数的延长逐渐降低.检测结果提示RT-PCR方法特异,可提早发现并诊断麻疹,进而可以作为网络实验室诊断麻疹的补充手段.     

逆转录-聚合酶链反应检测风疹病毒基因

针对风疹患者发病早期血清中特异性风疹IgM抗体阳性率低的特点 ,以及对胎儿风疹病毒感染检测的需要 ,采用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)直接从风疹减毒活疫苗BRDⅡ株、风疹GOS株、临床风疹患者的含漱液和咽拭子中检测出 411bp特异性片段 ;而麻疹、流行性腮腺炎、流行性感冒病毒均未检测出相应片段。通过对RT PCR一次产物的再次扩增 ,可以使检测的灵敏度达到 0 1TCID50 。该技术可作为风疹酶联免疫吸附试验 (ELISA)的一种补充 ,同时对控制先天性风疹综合征与优生优育工作具有积极的作用。     

基于聚合酶链式反应的肠道病原菌检测技术

正肠道感染性疾病重要病原菌,如志贺菌和沙门菌等感染发病率高、传播速度快、耐药发生率也高~([1-2])。据文献报道,肝硬化~([3])、HIV感染~([4])、炎症性肠道病~([5])以及血糖调节~([6])等均与肠道菌群失调有关。此外,引起胃肠道感染的食源性致病菌是食品安全的严重隐患~([7]),可引起胃肠炎、败血症等疾病。因此,快速检测威胁人类健康的病原菌刻不容     

用逆转录聚合酶链反应方法检测SARS冠状病毒

目的 应用双位点逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和改良巢式实时RT-PCR方法检测临床标本中SAILS冠状病毒(SAILS-CoV)核酸,以提高检测的可靠性和灵敏度。方法 对2003年杭州市3例严重急性呼吸综合征(SARS)临床确诊患者、4例疑似和27名医学观察者的咽拭子标本用巢式实时RT-PCR检测SAILS-CoV核酸,对阳性扩增产物进行核酸序列测定,同时对3例患者的标本应用半巢式RT-PCR检测另一位点SARS-CoV核酸片段,并应用常规实时RT-PCR技术及改良实时RT-PCR技术进行检测。结果 3例患者的巢式RT-PCR检测结果2例阳性,4例疑似和27名医学观察者均为阴性;阳性扩增产物的核酸序列与SAILS-CoV基因组相应部分序列完全一致。3例患者标本的另一位点的半巢式RT-PCR及实时RT-PCR结果均相同。在检测低拷贝数标本时,常规实时RT-PCR技术在约35个循环后出现弱阳性信号,但改良的巢式实时RT-PCR技术可使强阳性信号在10个扩增循环后出现。结论 双位点RT-PCR方法是提高检测准确性的有效方法,改良巢式实时RT-PCR技术较常规实时RT-PCR技术具有更高的灵敏度。     

染矽尘小鼠肺组织中转化生长因子β1表达的逆转录聚合酶链反应检测

目的　探讨染矽尘小鼠肺组织转化生长因子 β1(TGF β1)基因的表达在矽肺发病中的意义。方法　采用暴露式气管内注入法给小鼠一次性染矽尘 (0 .2g/kg体重 ) ,染尘后第 1、3、5、7、14、2 8天 ,每组各处死 8只小鼠 ,取肺组织 ,用逆转录聚合酶链式反应 (RT PCR)方法测定小鼠肺组织TGF β1基因的表达。结果　染尘后第 3天 ,小鼠肺组织中TGF β1基因表达开始升高 (1.2 0± 0 .15 ) ;第 7天达高峰 (1.74± 0 .19) ,与对照组 (1.0 1± 0 .16 )和染尘第 5天 (1.35± 0 .15 )比较 ,差异均有显著性 (P <0 .0 5 ) ;第 14天开始下降 ,但直到第 2 8天仍高于对照组。染矽尘小鼠肺组织羟脯氨酸含量随染毒后时间的延长 (1～ 2 8d)呈现持续上升的趋势。结论　TGF β1在矽肺早期的发生、发展过程中可能有重要作用。     

聚合酶链式反应对食物中肉毒的检测

目的用PCR方法鉴定肉毒食物中毒的病原菌。方法用1对人工合成的寡核苷酸引物护增A、B、E、F和G型肉毒神经毒素基因的一段264bp的DNA片段，并对2个食物中毒样品的增菌产毒培养液及分离的菌株进行检测。结果从食物中毒样品中检测出肉毒梭菌。结论PCR方法能快速、准确的鉴定肉毒食物中毒样品中的病原菌。     

聚合酶链式反应鉴定转基因大豆和玉米

随着转基因作物品种日益增多和全球种植面积不断扩大。转基因食品已成为全球食品消费市场的重要组成部分。转基因食品的安全性尤其是食用安全性，也日益引起人们的关切。因此，欧盟、日本、中国等国家和地区先后制订了转基因食品标识管理政策，要求标识食品中转基因成分的性质及含量，以保障消费者的知情权和选择权。转基因大豆和玉米在目前商品化生产的转基因食品中占据主导地位，其中主要为转基因抗除草剂大豆和抗虫玉米.     

多重逆转录聚合酶链反应检测流感病毒

目的：建立特异敏感的热速检测流感病毒的分子生物学方法。方法：用多重逆转录聚合酶链反应连接多重聚合酶链反应扩增甲1、甲3和乙型流感病毒的HA基因的HA1片段。根据扩增产物的大小检测流感病毒。结果：以流感病毒的HA基因为模板设计的三对引物能特异性地扩增出942bp、1117bp和751bp的核酸片段，它们分别和甲1、甲3和乙型流感病毒有稳定对应关系。根据扩增产物的大小可以检测流感病毒。用这个方法能检测病毒浓度为0．1TCID50的样品。还可以直接从疑似流感病人的含漱液中检测到乙型流感病毒。结论：多重逆转录聚合酶链反应连接多重聚合酶链反应是检测流感病毒的特异敏感的方法，此法还能直接从疑似流感病人的含漱液中检测到乙型流感病毒。     

多重聚合酶链式反应在脓毒血症病原体检测中的应用

目的探讨多重聚合酶链式反应(PCR)在脓毒血症病原体检测中的灵敏度、特异性及检测时间,为多重PCR在脓毒血症病原体检测中的应用提供理论依据。方法采用多重PCR和血培养检测医院40例脓毒血症患者血液中的病原体,并比较两种检测方法的灵敏度、特异性、检测速度、检测菌种的差异,并以同期40名健康体检者血标本作为对照;采用SPSS 15.0软件进行数据处理,检测阳性结果以率的形式表示,并进行χ2检验。结果对照组中两种方法的阳性率差异无统计学意义,脓毒血症组多重PCR检测的阳性率为55.0%,血培养为82.5%,两者比较差异有统计学意义(P<0.05),且血培养检测出18例脓血症患者中共有11例PCR检测为阳性,占61.1%;多重PCR特异性为80.7%,灵敏度为95.7%;脓毒血症组多重PCR的平均检测时间为(6±0.56)h,血培养法为(30.78±1.45)h,差异有统计学意义(P<0.05);从22份阳性血培养中共分离出4种病原菌,分别为金黄色葡萄球菌10株、铜绿假单胞菌7株、鲍氏不动杆菌3株、表皮葡萄球菌2株,多重PCR均能检测上述病原菌的DNA。结论在脓毒血症病原学的检测中,多重PCR较血培养具有更高的敏感性和特异性,检测时间也较血培养明显缩短,有利于脓毒血症病原体的快速检测,指导临床用药。     

用RT—PCR法鉴定人冠状病毒SARS、229E和0C43

目的：建立两种简单、快速和特异性的RT—PCR法鉴定SAILS—HCoV、HCoV-229E和HCoV-0C43。方法：用DNAStar和Premier5．0软件设计SAILS—HCoV、HCoV-229E和HCoV-0C43及其它冠状病毒针对保守区Pollb基因的一对通用引物和分别针对M基因的3对引物，然后通过对扩增片断测序、限制性酶切方法和根据扩增片断的长度进行鉴定。结果：两种方法均能扩增到与预期目标一致的片断，特异性和灵敏度高，能快速区分3种病毒。结论：这些方法将为了解冠状病毒在呼吸道感染中的作用提供一个有利的工具。     

逆转录聚合酶链反应检测大肠癌患者外周血CK—20mRNA

目的 检测大肠癌患者外周血CK－20mRNA并评价其临床意义。方法 应用逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）检测肿瘤细胞株及大肠癌患者外周血CK－20mRNA。结果 大肠癌细胞株CK－20mRNA阳性；肺癌、肝癌、乳腺癌等肿瘤细胞株及20例健康志愿者外周血中未见CK－20mRNA的表达。51例大肠癌患者外周血中25例CK－20mRNA表达阳性，阳性率为49．0％。大肠癌患者外周血CK－20mRNA的表达与临床分期关系为：A期14．3％（1／7）、B期25．0％（3／12）、C期55．0％（11／20）、D期83．3（10／12）；其中C、D期与A、B期相比有显著性差异（P＜0．01）。结论 CK－20mRNA可以作为对大肠癌血行转移进行早期诊断的生物学标志物，并能监测大肠癌的疗效。     

逆转录聚合酶链反应用于检测恶性疟原虫的初步研究

目的 建立逆转录聚合酶链反应系统,用于检测恶性疟原虫感染。方法 以恶性疟原虫小亚单位核糖体核糖核酸基因为靶片段,设计一对特异引物,分别采用RT－PCR技术和PCR技术进行检测恶性疟原虫血样并比较两才检测的敏感性。结果 从培养的恶性疟原血样中扩增出359bp特定扩增带,而间日疟和健康人血样均未见扩增带。经限制性内切酶分析证实扩增产物为目的片段。检测系统初步显示可检出恶性疟血样中0．34个疟原虫所含的RNA模板。以RNA为检测对象的RT－PCR肉眼可见条带的检测水平较以DNA为检测对象的PCR扩增高。结论 RT－PCR检测恶性疟原虫方法具有敏感性高、特异性强的特点,有一定的应用价值。     

荧光定量逆转录聚合酶链式反应检测宫颈癌患者外周血CK19mRNA表达的临床意义

目的探讨宫颈癌患者外周血中CK19mRNA的表达及其临床意义。方法应用荧光定量逆转录聚合酶链式反应（FQ—RT—PCR）技术检测138例经病理证实的宫颈癌及36例妇科良性肿瘤（对照组）外周血液中CK19mRNA的表达,并分析其与临床病理因素的关系。结果138例宫颈癌组外周血CK19阳性率（69．6％）高于对照组（13．9％,X2=36．34,P=0．000）。宫颈癌组中早期宫颈癌（I-ⅡA期）外周血CK19mRNA阳性率（57．9％）低于中晚期宫颈癌（Ⅱb-Ⅳ期,80．6％,x。=8．14,P=0．004）。早期宫颈癌患者CK19mRNA的表达与年龄（〈40岁、≥40岁）、肿瘤大小（〈4cm、≥4cm）、病理类型（鳞癌、非鳞癌）、浸润深度、淋巴转移（＋／-）均无关（P〉0．05）;与肿瘤分期（IA、IB、ⅡA）、组织分化（G1-2、G3）、脉管瘤栓（＋／-）有关（x。=9．59,7．27,9．94,P〈0．01）。早期宫颈癌患者Logistica多因素分析示CK19mRNA的表达与脉管瘤栓相关（x2=5．29,P=0．021）。结论荧光定量RT—PCR技术可检测出各期宫颈癌患者外周血中CK19的表达,其敏感性和特异性高,可作为检测宫颈癌微转移的生物学指标,对判断宫颈癌的预后具有一定指导意义。     

多重逆转录聚合酶链反应检测主要上呼吸道病毒

目的：建立用多重逆转录聚合酶链反应（mRT-PCR）检测甲1型、甲3型、乙型流感病毒以及呼吸道全胞病毒（RSV）A型、B型等主要上呼吸道病毒的方法，以快速检测上呼吸道感染主要病毒及对甲型、甲亚型、乙型流感病毒在上海地区人群感染、流行情况设计。方法：采用经MDCK细胞接种培养的甲3型、乙型流感病毒和Hep-2细胞接种培养的RSV A型、B型标准毒株病毒液，以及甲1型、甲3型、乙型流感病毒和RSV A型、B型混合毒株病毒液，使用5组引物，分别为HA1-5al和Hal-3al（甲1型流感病毒）、HA3-5al和HA3-3al和HA3-3al（甲3型流感病毒）、NP-5b1和NP-3bl（乙型流感病毒）、RSVAF和RSVAR(RSVA型)、RSVBF和RSVBR(RSVB型)，经mRT-PCR，琼脂糖凝胶电泳，于紫外灯下观察上述病毒特异核苷酸条带。结果：甲1型、甲3型、乙型流感病毒，RSVA型、B型分别在431，210，390，334，183bp处出现清晰的5条DNA条带。结论：应用5组引物，mRT-PCR可用于快速检测临床上呼吸道感染标本中的流感病毒和RSV，并可对其进行分型，对上呼吸道病毒感染性疾病的诊断和流感的监测方面是非常重要的。     

用RT-PCR法鉴定人冠状病毒SARS、229E和OC43

目的:建立两种简单、快速和特异性的RT-PCR法鉴定SARS-HCoV、HCoV-229E和HCoV-OC43。方法:用DNA Star和Prem ier 5.0软件设计SARS-HCoV、HCoV-229E和HCoV-OC43及其它冠状病毒针对保守区Pol1b基因的一对通用引物和分别针对M基因的3对引物,然后通过对扩增片断测序、限制性酶切方法和根据扩增片断的长度进行鉴定。结果:两种方法均能扩增到与预期目标一致的片断,特异性和灵敏度高,能快速区分3种病毒。结论:这些方法将为了解冠状病毒在呼吸道感染中的作用提供一个有利的工具。     

应用通用引物建立巢式逆转录聚合酶链反应检测肠道病毒

目的设计通用引物建立巢式逆转录聚合酶链反应(RT-n-PCR),以求敏感、特异及快速诊断肠道病毒(EV)感染。方法在EV基因组5'端非编码区(5'-UTR)设计2对通用引物,建立RT-n-PCR检测方法。结果共有104份临床标本检测到相应大小扩增条带,阳性率31.8%(104/327);在147例病例中粪便和咽拭子EV阳性比较差异无统计学意义(P>0.05)。病例总阳性数64例,阳性率38.8%(64/165)。正常儿童与可疑EV感染病人EV阳性率比较差异有统计学意义(u=3.38,P<0.01)。结论RT-n-PCR可以准确快速地检测出肠道病毒,同时检测多份标本可以提高EV阳性率。     

逆转录聚合酶链反应检测疟原虫混合感染的研究

〔目的〕建立在同一反应体系中能同时检测和鉴定恶性疟、间日疟的一步逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测方法,并用于国境口岸归国劳务人员的疟疾检测。〔方法〕以疟原虫小亚单位核糖体核糖核酸基因为靶片段,设计恶性疟原虫和间日疟原虫的上游通用引物和各自的下游特异性引物,在同一反应体系中同时扩增恶性疟原虫和间日疟原虫的特异片段,对疟疾患者的PCR产物进行序列测定和分析。〔结果〕用建立的RT-PCR检测方法对广东口岸回国劳务人员中发现的2名疟疾患者的不同采样时间的全血进行检测,2006年10月和2007年1月采集的样本被分别扩增出预期大小为360bp和450bp特异扩增带,推测2名患者为恶性疟原虫和间日疟原虫的混合感染,其在入境时处于恶性疟的发作期和间日疟的潜伏期,均属于典型的集体输入性疟疾案例。〔结论〕RT-PCR检测疟原虫方法具有敏感性高、特异性强的特点,对国境口岸疟疾诊断、镜检质量控制和流行病学研究具有较大的实用价值。     

不同人群新型冠状病毒核酸检测的临床价值

 目的 探讨新型冠状病毒（SARS-CoV-2）核酸检测在发热门诊、隔离病房、易感人群以及大规模筛查等不同人群中的应用价值,为SARS-CoV-2实验室检测提供参考依据。方法 采集2020年2月1日-3月22日郑州人民医院不同人群的咽拭子,包括发热门诊、隔离病房患者,一线疫情防控医护人员,以及无新型冠状病毒肺炎（COVID-19）症状的住院患者、陪护家属和复工人员。采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法,使用A、B两种国产检测试剂盒对发热门诊、隔离病房的患者进行SARS-CoV-2核酸检测。结果 共检测15 497份咽拭子标本,SARS-CoV-2核酸阳性24份,核酸阳性病例均来自发热门诊和隔离病房。24例咽拭子SARS-CoV-2核酸阳性患者同时送检的血标本核酸结果均呈阴性。A、B两种试剂首次咽拭子核酸检测结果一致,2例确诊COVID-19患者治疗后复查咽拭子标本,A组试剂检测为阳性,B组试剂检测为阴性。该院疫情防控一线医护人员、未出现COVID-19症状的住院患者、陪护家属和复工体检人员核酸检测均为阴性。结论 复工人员、住院患者、陪护家属和一线疫情防控人员SARS-CoV-2核酸筛查均未发现阳性,咽拭子标本SARS-CoV-2核酸检测阳性率高于血标本,不同核酸检测试剂检测阳性率稍有差异。     

逆转录聚合酶链反应与常规法检测蚊体内黄病毒的…

检测比较蚊体内的黄病毒。方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ技术及常规的Ｃ６／３６细胞培养结合免疫荧光法。结果；无论实验感染的登革热病毒蚊虫标本，还是从野外捕捉 的标本，均表明ＲＴ－ＰＣＲ检出黄病毒的阳性率比常规法高，且快速，敏捷，操作简便；常规法检出周期长，操作复杂，繁琐和反复多次，检出率低。