重组人白细胞介素10基因的克隆及其在真核细胞中的表达

目的：克隆编码人白细胞介素10（hIL-10）基因的全长cDNA,构建真核表达载体,并在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中进行表达.方法：应用逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）技术,从活化的正常人外周血单个核细胞中扩增出hIL-10 cDNA,将测序正确的hIL-10 cDNA克隆至真核表达载体pcDNA3构建重组表达载体.采用磷酸钙法转染CHO细胞,用ELISA法检测hIL-10基因的表达,用单四唑（MTT）检测hIL-10蛋白的活性.结果：RT-PCR产物插入Teasy载体,经序列测定证实hIL-10基因全序列克隆成功.在CHO细胞培养上清中有hIL-10的表达,该产物能抑制淋巴细胞转化.结论：成功构建了真核表达质粒pcDNA3-hIL-10,为进一步研究hIL-10在自身免疫、移植免疫及炎症性疾病中的作用打下了基础.     

小鼠IL-17基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的克隆小鼠IL-17（mIL-17）基因编码区并构建其真核载体。方法将10 ug LPS和等体积的完全福氏乳化后免疫C57BL/6小鼠,7 d后,取小鼠脾脏,提取脾细胞总RNA,通过RT-PCR扩增mIL-17基因全长编码区并将其克隆至pcDNA3.1载体。菌落PCR筛选阳性克隆,限制性内切酶消化和序列分析进行鉴定。结果构建的重组载体中含有mIL-17基因编码区的全长序列,与NCBI公布的序列一致。结论获得mIL-17基因并构建了其真核表达载体,为研究IL-17在自身免疫性疾病中的作用奠定了基础。     

IL-17和IL-17受体及其基因多态性的研究进展

白细胞介素17(IL-17)是近期发现的辅助性T细胞17分泌的特征性细胞因子。IL-17及IL-17受体(IL-17R)家族在多种疾病,尤其是自身免疫性疾病中发挥了重要作用,如类风湿关节炎、炎症性肠病、哮喘等。近来已有IL-17及IL-17R与疾病的报道,但其基因多态性(SNPs)与相关疾病关系的研究尚少。该文对IL-17和IL-17R及其SNPs的研究进展予以综述,为今后IL-17及IL-17R的相关研究提供思路和方向。     

Panton-Valentine杀白细胞毒素(PVL)lukS-PV基因的克隆、原核表达及初步鉴定

目的构建Panton-Valentine杀白细胞毒素(PVL)lukS-PV基因表达载体,并在大肠杆菌中表达相应蛋白。方法提取PVL阳性金黄色葡萄球菌的基因,PCR方法扩增lukS-PV,A-T克隆至pGEM-T载体上,经PCR、双酶切和测序鉴定后,亚克隆到pET28a( )表达载体上,鉴定并转化至Rosetta(DE3)plys表达宿主菌中,用IPTG诱导表达,并用SDS-PAGE电泳分析和Western blot鉴定。结果构建了lukS-PV-pGEM-T和lukS-PV-pET28a( )重组质粒,经PCR扩增和限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切均得到939bp的目的片段,基因测序与GENEBANK中的PVL的序列一致,宿主菌表达带HIS标签的重组LukS-PV蛋白。结论成功克隆lukS-PV基因和构建重组表达质粒,并在宿主菌中成功表达重组LukS-PV蛋白,为PVL免疫学检测方法的建立奠定基础。     

人血管内皮生长因子的克隆表达及活性鉴定

【目的】克隆人血管内皮生长因子165基因,并测定蛋白质的表达及鉴定其活性。【方法】用PCR法从人心脏cDNA文库中钓取目的基因VEGF165,插入质粒PUC19中并测序鉴定。构建真核表达重组质粒AdtrackCMV-VEGF165转染293细胞,用RNA斑点杂交和Westernblot方法检测VEGF165基因表达,并通过Miles试验检测VEGF165蛋白活性。【结果】PCR产物为582bp,测序结果表明其序列正确,在RNA和蛋白水平检测到VEGF165基因表达,VEGF165蛋白相对分子质量为22ku,具有生物学活性。【结论】成功地克隆了有表达生物学活性的VEGF165基因。     

IL-17E和IL-17F及其受体在结直肠癌组织中的表达及其意义

目的：观察配体白细胞介素17E（IL-17E）、白细胞介素17F（IL-17F）及其受体白细胞介素17RB（IL-17RB）和白细胞介素17RC（IL-17RC）在肠炎、肠息肉及结直肠癌组织中的表达,探讨其与直结肠癌恶性度的关系。方法：收集15例肠炎、5例增生性肠息肉及30例结直肠腺癌组织病理标本,采用免疫组织化学染色法检测IL-17E、IL-17RB、IL-17F和IL-17RC在肠炎、肠息肉和肠癌组织中的阳性表达率,分析配体与受体阳性表达率的相关性以及配体阳性表达率与肠癌恶性度的关联。结果：IL-17E、IL-17F、IL-17RB和IL-17RC主要表达于腺上皮细胞、单个核细胞、血管内皮细胞和部分癌细胞;IL-17E在肠炎和肠息肉组织中的阳性表达率明显高于肠癌组织（P<0.05）,且随肠癌恶性度升高而降低;IL-17F在肠息肉和肠癌组织中阳性表达率明显高于肠炎组织（P<0.05）,且随肠癌恶性度的升高而升高;IL-17RB在肠炎及息肉组织中的阳性表达率明显高于肠癌组织（P<0.05）。与肠炎和肠息肉比较,肠癌组织中IL-17RC阳性表达率升高（P<0.05）。在肠癌组织中,IL-17F阳性表达率与IL-17RC阳性表达率呈正相关关系（r=0.667,P=0.001）。结论：IL-17F、IL-17RC、IL-17E和IL-17RB信号可能参与了肠癌的发生发展。     

人血管内皮生长因子的克隆表达及活性鉴定

[目的]克隆人血管内皮生长因子165基因,并测定蛋白质的表达及鉴定其活性。[方法]用PCR法从人心脏cDNA文库中钓取目的基因VEGF165,插入质粒PCU19中并测序鉴定,构建真核表达重组质粒AdtrackCMV-VEGF165转染293细胞,用RNA斑点杂交和Western blot方法检测VEGF165基因表达,并通过Miles试验检测VEGF156蛋白活性。[结果]PCR产物为582bp,测序结果表明其序列正确,在RNA和蛋白水平检测到VEGF165基因表达,VEGF165蛋白相对分子质量为22ku,具有生物学活性。[结论]成功地克隆了有表达生物学活性的VEGF165基因。     

重组人胸腺素β4基因的克隆、表达、纯化、鉴定及活性检测

目的：利用基因工程的方法原核表达重组人胸腺素β4（Tβ4）并对其进行纯化和鉴定．方法：使用大肠杆菌偏爱密码子合成人Tβ4全长基因，构建了Tβ4的二串联体基因（Tβ4②），将其克隆入表达载体pET-22b（＋）中，重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态，IPTG诱导表达后，经盐析、疏水层析和离子交换层析纯化重组蛋白，采用免疫印迹和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱对重组蛋白进行鉴定．结果：获得了纯化的重组Tβ4②蛋白，并具有生物学活性．结论：成功构建、表达和纯化了Tβ4②，为其功能研究奠定基础．     

IL-17在小鼠自身免疫性肝炎中的表达及其意义

目的 探讨IL-17在小鼠自身免疫性肝炎中的表达及其意义.方法 建立实验性自身免疫性肝炎小鼠模型,检测肝脏病理组织学改变以及血清中谷丙转氨酶(ALT)水平;免疫组化方法检测肝脏组织中IL-17的表达;ELISA方法检测小鼠血清中IL-17水平.结果 成功地建立实验性自身免疫性肝炎小鼠模型,其血清ALT水平在建模后21 d达到高峰.模型组小鼠的肝脏组织中IL-17高表达,而对照组肝脏组织中没有IL-17表达;建模后小鼠血清中IL-17水平较对照组明显升高(P＜0.05),并于21 d达峰值.IL-17与血清ALT水平以及肝脏损伤趋势一致.肝组织中IL-17阳性细胞数和浸润中性粒细胞数呈正相关.结论 IL-17可能在自身免疫性肝炎的发病中起重要作用.     

IL-21编码基因的克隆及其在大肠杆菌中表达

①目的 利用基因工程技术从人偏桃体细胞CDNA中克隆出白细胞介素21（IL-21）的编码基因，并在大肠杆菌中进行表达。②方法 以人扁桃体细胞经PHA刺激的CDNA文库为模板，经PCR获得IL-21的全基因片段。测序确认后，分别设计含BamH I和SalI酶切位点的引物，经PCR获得IL-121成熟肽的编码基因。将此IL-21基因插入表达载体PGEX4T-2，重组克隆经酶切与测序确认后转化大肠杆菌DH5α进行IPTG诱导表达。③结果 琼脂糖凝胶电泳显示重组质粒的PCR和双酶切产物与理论值的大小相等。SDS-PAGE显示经IPTG诱导后的大肠杆菌DH5α亦表达一与理论相符的条带。目的蛋白约占总菌体蛋白的10%。④结论 成功地构建了IL-21编码基因克隆载体并获得的大肠杆菌中的成功表达。     

小鼠精子蛋白Sp17的克隆、表达及其免疫原性研究

目的 获得鼠精子蛋白Sp17基因,构建重组表达载体并实现其在大肠杆菌中的高效表达,为制备免疫性避孕疫苗奠定基础.方法 提取BALB/c小鼠睾丸组织总RNA,通过RT-PCR扩增Sp17基因全长cDNA序列,并将其克隆至pMD 18-T质粒载体中,再经HindⅢ/ XhoⅠ双酶切将Sp17基因片段亚克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、Western blot对表达产物进行初步鉴定,并检测重组蛋白Sp17免疫小鼠后血清特异抗体滴度.结果 获得了小鼠Sp17的全长cDNA,成功构建了重组原核表达载体pET/Sp17,在IPTG的诱导下实现了目的蛋白在大肠杆菌中的高效表达,免疫后小鼠血清中检测到特异性抗体.结论 小鼠精子蛋白Sp17基因序列已被克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,并在大肠杆菌BL21(DE3)中获得高效、正确的表达,重组蛋白Sp17能够诱导产生特异性免疫反应,具有一定程度的免疫原性.     

人白细胞介素-6基因的克隆表达和纯化的研究

目的：研究人ＩＬ ６基因在大肠杆菌中的高效表达及表达产物的纯化。方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ方法克隆了人ＩＬ ６ｃＤＮＡ,用ｐＢＶ２２０载体对ＩＬ ６基因进行了表达调控研究,用阴离子交换柱和凝胶柱对表达产物进行纯化,用ＭＴＴ法测定ｒｈＩＬ ６的活性。结果：表达调控研究发现,当ＳＤ序列到ＡＴＧ之间的距离为６ｂｐ和１０ｂｐ时在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ胶上未见明显表达,而当距离为５ｂｐ、７ｂｐ、８ｂｐ、９ｂｐ时均可获高效表达,最高表达量占菌体总蛋白的２６％。表达产物经变性复性及纯化后产品纯度达９８％,比活性为１１×１０８Ｕ／ｍｇ。结论：本研究为ｒｈＩＬ ６的中试生产奠定了坚实的基础     

人survivin的克隆、在大肠杆菌中的表达及活性鉴定

目的在原核中高效表达及活性鉴定重组人survivin蛋白分子。方法应用RT-PCR的方法得到survivin的cDNA,并构建成pBV220-survivin原核表达质粒,将其导入E.coliBl21(Gold)中,诱导表达survivin蛋白。通过DEAESepharoseFastFlow离子交换柱和SephacrylS-200分子筛二步柱纯化以获取目的蛋白。用Westernblotting检测表达产物。结果PT-PCR产物经测序分析与预期结果完全一致,表达质粒在E.coliBl21(Gold)中得到高效表达,表达的survivin蛋白占总蛋白含量的30%以上,表达产物以包涵体的形式存在。通过离子交换柱和分子筛二步柱纯化及复性后获得的目的蛋白,其纯度达到95%以上。Westernblotting证明表达产物具有特异性。结论获得了较高纯度的survivin蛋白,为进一步深入研究该蛋白的细胞凋亡调控功能提供了工具。     

His标记小鼠SRG-S基因的克隆和表达纯化

目的构建His标记的小鼠精子发生相关基因SRG-S的原核表达载体并实现其表达及纯化。方法提取小鼠睾丸组织总RNA,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增目的基因片段,克隆入pGEM-T-easy载体,经测序正确后,定向亚克隆入pET-30a( )表达载体,转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3),异丙基硫代--βD-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,Ni-NTA亲和层析纯化融合蛋白,并利用抗His单克隆抗体进行Western blot检测。结果RT-PCR扩增得到大小约591 bp的目的基因片段,DNA序列分析结果与GenBank公布的序列一致,SDS-PAGE电泳显示经IPTG诱导有约32 kD的重组蛋白表达,纯化后的蛋白纯度达90%以上,且Western blot印迹表明该融合蛋白具有特异的抗His抗体特性。结论采用基因克隆技术成功构建了带His标签的小鼠SRG-S原核表达载体,并获得了高纯度的重组蛋白,有利于后期抗体的制备,为进一步从蛋白质水平研究该基因的功能奠定了基础。     

人白细胞介素17cDNA的克隆及表达

目的 获取重组的人白细胞介素17以进行科学研究和应用。方法 应用RT－PCR的方法，从经PHA活化的人外周血单个核细胞中扩增hIL-17cDNA的编码序列，将其克隆至测序载体pBS SKⅡ（ ）中进行测序，再将其亚克隆至表达载体pBV220中，在大肠杆菌XL1－Blue中进行表达。结果 克隆获得了hIL-17cDNA，经热诱导后使hIL-17蛋白在大肠杆菌中的表达量达到了39．7％。结论 通过克隆hIL-17cDNA的编码序列及热诱导使hIL-17蛋白在大肠杆菌中得到了高效表达。     

人白细胞介素-17F基因克隆及在大肠杆菌中的表达

目的 克隆人白细胞介素-17F基因，并构建含有该目的基因的重组原核表达载体，获得高效表达hIL-17F的基因工程菌。方法 利用RT-PCR法，以PHA活化的人外周血单个核细胞的总RNA为模板，扩增出hIL-17FFeDNA的编码序列，并分别亚克隆至pUCm-T载体和原核表达载体pGEX．5X-3中，进行PCR、酶切鉴定和DNA序列测定。将重组原核表达载体转化感受态大肠杆菌B121后经IPTG诱导表达获得包涵体融合蛋白，且Western印迹鉴定。结果 PCR产物大小及其单酶切鉴定均证明所克隆的基因是hIL-17F，DNA序列测定进一步证实与GeneBank报道的序列完全一致。成功构建了重组原核表达载体pGEX-5X．3／hIL-17F，并在大肠杆菌中获得高效表达，约占菌体总蛋白的55％，且Western印迹证实确为目的蛋白。结论 该基因系国内首次克隆，hIL-17F基因重组体的构建和在大肠杆菌BL21中的高效表达，为进一步探讨其生物学活性和应用奠定了基础。     

藤黄微球菌Rpf基因的克隆表达及纯化鉴定

目的:克隆藤黄微球菌Rpf基因,序列测定正确后进行融合表达纯化.方法:采用聚合酶链反应(PCR)方法,从藤黄微球菌基因组中扩增出藤黄微球菌Rpf基因,用限制性内切酶消化后插入到pUC-19克隆载体中,测序正确后再亚克隆到融合表达载体pPro-EXHT中,转化大肠杆菌DH5α,目的基因经IPTG诱导,由T7启动子调控表达了氨基端带6个连续组氨酸残基的Rpf蛋白,在变性条件下对目的蛋白进行纯化.结果:获得藤黄微球菌Rpf基因,得到融合6个组氨酸残基的藤黄微球菌Rpf蛋白,可溶性分析发现融合蛋白主要在包涵体中存在,最后在变性条件下,用Ni2 -NTA 亲和色谱柱纯化目的融合蛋白,纯化获得的融合蛋白纯度大于90%,Western-Blot证实获得的蛋白为所需要的目的蛋白.结论:构建了藤黄微球菌Rpf基因的重组表达载体,并获得了高纯度的融合表达蛋白,为以后的深入研究奠定了基础.     

EBI3蛋白基因克隆、表达及其初步鉴定

目的 进一步研究EB病毒诱导基因3(EBI3)蛋白在病原生物感染宿主中的功能,探讨原核表达小鼠EBI3蛋白并初步鉴定.方法 收集日本血吸虫感染的C57/BL6小鼠脾细胞后提取总RNA,利用所合成引物经RT-PCR获得EBI3的cDNA,将该基因亚克隆入原核表达载体pET32a(+) ,转化至大肠埃希菌(E.coli)BL21株, 经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,对包涵体进行变性、纯化和复性后获得可溶性的小鼠重组EBI3蛋白,用Western blot对其鉴定.用纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠获取血清,经饱和硫酸铵法和DEAE-Sephadex A-50柱纯化得到抗小鼠重组EBI3蛋白多克隆抗体,ELISA检测其免疫活性.结果 基因工程获得目的 蛋白变性复性成功后经Western blot鉴定证实为小鼠重组EBI3蛋白,免疫小鼠后取血清,分离纯化获得抗小鼠重组EBI3蛋白多克隆抗体,ELISA结果表明该蛋白具有免疫原性.结论 成功地表达了小鼠重组EBI3蛋白,并制备了抗小鼠重组EBI3蛋白多克隆抗体,为进一步研究EBI3蛋白在病原生物感染宿主中的功能奠定了基础.     

人巨噬细胞金属弹力酶催化域基因的克隆及表达

目的克隆人巨噬细胞金属弹力酶催化域（HMEcd）基因,构建原核表达质粒,在大肠杆菌中表达HMEcd基因融合蛋白。方法用RT-PCR方法提取人胃癌组织总RNA并扩增出HMEcd cDNA,克隆入pMD18-T载体,构建克隆载体pMD18-T-HM Ecd,双酶切鉴定及DNA测序正确后再将HMEcd cDNA亚克隆至pET-28a（＋）载体,构建原核表达载体pET-28a（＋）-HM Ecd,转化大肠杆菌BL21（DE3）诱导表达,并行SDS-PAGE及Western blotting鉴定。结果RT-PCR获得预期的HMEcd cDNA,双酶切鉴定及DNA测序证实将HM Ecd基因分别正确插入克隆载体和原核表达载体中,SDS-PAGE及Western blotting鉴定证实表达出HMEcd融合蛋白。结论成功表达出HMEcd基因融合蛋白,为进一步功能实验研究奠定基础。     

人bit1 cDNA基因的克隆、测序及表达

目的: 克隆并在大肠杆菌中表达人bit1 cDNA基因. 方法: 从新鲜的胎盘组织中提取总RNA,经反转录成单链cDNA, 以此为模板扩增出人bit1 cDNA基因,将该基因克隆入载体pUC19中,测序正确后亚克隆入表达载体pGEX-4T3中进行表达. 结果: 利用所设计的引物扩增出完整的人bit1 cDNA基因.以大肠杆菌为宿主在IPTG的诱导下获得表达,激光薄层扫描显示表达蛋白占总蛋白的40.6%. 结论: 获得了人bit1 cDNA基因及其原核表达产物,对研究人Bit1蛋白的功能具有重要的意义.