一种简便的外周血干细胞冷冻保存法

为了简化传统的细胞冷冻方法。即用10%二甲基亚砜（DMSO）作为冷冻保护剂并用程控降温仪-196℃液氮保存,研究了用5%DMSO,3%羟乙基淀粉（HES）和4%人血白蛋白（HSA）作为冷冻保护剂,而不用程控降温仪直接-80℃冰箱冷冻细胞的方法。对比了不同方法冷冻保存外周血干细胞（PBSCs)的细胞活性,单个核细胞数,CFU-GM和CD34^ 细胞回收率。结果发现,简便冷冻法可获得更高的单个核细胞（MNC）和CFU-GM回收率,无凝集现象;并且经长达24个月冷冻保存后仍可获得满意的CFU-GM和CD34^ 细胞回收率,37℃融冻和20℃室温融冻法之间各项指标无明显差别。细胞融冻后在室温下暴露于5%DMSO中1小时,CFU-GM回收率并不降低。而细胞活性从93.2%降至84.5%,所以,这种简便的细胞冷冻保存法简便易行。可替代传统的液氮保存法,对于没有程控降温仪的单位具有实用价值。而且还可减少病人DMSO输入量第一线决策。     

脐带血单个核细胞分离及保存的优化研究

目的优化脐带血单个核细胞的分离制备及保存的方法。方法采集符合要求的足月顺产或剖宫产新生儿脐带血,采用二次回浆法分离制备脐带血有核细胞并与传统离心法比较。对分离制备的脐血有核细胞采用不同的降温速率进行低温保存研究,优化降温速率及程序降温终止温度。结果采用二次回浆法和传统离心法分离制备脐带血有核细胞,其总数(×109)分别为1.52±0.89和1.11±0.35,回收率(%)分别为92.12±5.78和86.94±7.34,差异有统计学意义(P<0.05)。脐血造血干细胞在4℃～-40℃降温过程中,采用1℃/min和5℃/min的降温速率,细胞回收率(%)分别为92.4±2.3和84.7±2.4,P<0.05;在-40℃～-90℃时,采用l℃/min或5℃/min的降温速率,细胞回收率(%)分别为91.1±1.9和90.3±2.8,P>0.05。在程序降温仪降至-90℃和-130℃后移至液氮,细胞回收率(%)分别为91.1±2.1和92.3±1.9,P>0.05。结论二次回浆法能提高脐带血制备有核细胞数;脐血干细胞保存优化的方法为4℃～-40℃时采用1℃/min的降温速率,再以5℃/min的降温速率降至-90℃后...     

一种不用程控降温在—80℃冷冻保存外周血干细胞的简便方法

通常外周血单个核细胞(PBMCs)经控速降温后在液氮(LN_2)中保存。该方法存在三个问题:(1)如果外周血干细胞(PBSCs)单用二甲基亚砜(DM-SO)冷冻,那么解冻后回输时常常会出现细胞凝块(clumping)。(2)程控降温和液氮保存操作复杂。(3)重复单采大量PBMCs,冷冻保存所需的空间和液氮的需用量增加。为获得简单理想的冷冻保存方法,本文介绍了一种用细胞外冷冻防护剂羟乙基淀粉(HES,它可以降低解冻后细胞的溶解和凝块的形成)和DMSO 作为PBMCs 的冷冻防护液,不经程控降温在—80℃冰箱中保存的方法。在小样品试验中,用7种不同浓度的HES 和DMSO 冻存外周血的回收率分别是92±3.5%,734.8±4.1%和82.2±6.9%,胎盘兰拒染率88.4±3.6%,明显高于单用5%或10%DMSO冻存的结果。样品冻存5—18个月时CFU-GM 保持     

二甲基亚砜联合羟乙基淀粉的非程控降温法冻存脐血造血干细胞研究

为了探索有效低温保存脐血造血干／祖细胞的冷冻保护剂和技术，进行了二种方法试验。第一种方法联合使用二甲基亚砜(DMSO)和羟乙基淀粉(HES)(分子量120000)作为冷冻保护剂并用非程控降温冷冻技术；第二种方法只使用DMSO作为冷冻保护剂并用程控降温仪冷冻技术保存脐血。对二种方法的效果进行比较。结果表明：15份脐血冻存后细胞存活率、CFU—GM回收率，无论在使用非程控降温的第一种方法和使用程控降温仪的第二种方法均无显著性差异。183份脐血质量检测结果及21例临床移植结果也显示两种方法无显著性差异。结论：联合使用DMSO和HES作为冷冻保护剂并用非程控降温冷冻的方法对脐血造血干细胞有良好的保护作用，是一种简单易行、省时省力、适合于脐血造血干细胞库大批量冻存脐血的方法。     

脐血造血干细胞低温保存方法探讨

为使脐血有更广阔的应用前景及建立脐血造血干细胞(CBSC)库,笔者探讨了脐血低温保存的有效方法。结果显示:CBSC 4℃低温保存以2～3d为宜;液氮低温保存是一种有效的CBSC保存方法,回收率高,较长时间保存,回收率不受影响;-80℃冰箱保存法具有与液氮相同的低温保存效果;且简单、经济、方便和实用,无需程序降温仪,便于大规模开展应用和建立CBSC库;脐全血保存可以避免分离过程CBSC的丢失,保存效果不受影响。     

脐血造血干细胞短期冻存效果的评价

为了探讨脐血造血干细胞在液氮中短期冻存复苏后的效果，分别将各自为8例冻存6个月、1年、2年的脐血千细胞进行复苏，观察造血干细胞活性。有核细胞(NC)计数采用自动血细胞分析仪测定，CD34^ 细胞采用流式细胞技术测定，用体外造血细胞培养技术分析粒一巨噬细胞集落生成单位(CFU-GM)产率，台盼蓝染色法判断造血细胞存活率。结果表明：脐血造血干细胞在液氮中冻存6个月、1年、2年后解冻，其有核细胞、CD34^ 细胞、细胞活率、CFU-GM产率在3个不同冻存时间的差异无显著性。结论：脐血干细胞于液氯中短期冻存，其干细胞数量和细胞活性没有明显的变化，冻存效果较好。     

BioArchive自动液氮储存系统保存脐带血造血干细胞的效果评价

目的　评价BioArchive自动液氮储存系统脐带血造血干细胞的保存效果。方法　通过分析脐带血造血干细胞在BioArchive自动液氮储存系统中保存半年复苏后脐血有核细胞总数、CD34 细胞数量和造血祖细胞集落形成单位(CFU GM)的回收率,评价自动液氮储存系统保存效果。结果　85份新生儿脐带血复苏后有核细胞仍获得较高的产率,达到(8.97±4 .12 )×10 8,CFU GM计数达(90 .5 8±84 .5 0 ) /2×10 5,CD34 细胞数达到(7.2 8±3.5 7)×10 6。比较脐带血有核细胞冻存前后各组数据,经统计学分析,差异无显著性。结论　BioArchive自动液氮储存系统储存脐血造血干细胞的效果较为理想,适合于各种脐血库和细胞库的应用。     

脐血造血干/祖细胞冷藏效果的比较研究

目的：探讨脐血细胞和1.064g/L ficoll分离的脐血造血干／祖细胞（简称1064脐血造血干／祖细胞）在不同冷藏条件下的效果。方法：21例脐血和12例1064例脐血造血干／祖细胞在4℃保存；16例1064脐血造血干／祖细胞分别冷藏在－80℃和－196℃，观察不同时间造血细胞活性；单个核细胞（MNC）采用自动血细胞分析仪测定，CD34^ 细胞采用流式细胞技术（FCM）测定，体外造血细胞培养技术分析粒－单系祖细胞（CFU－GM）和红系祖细胞（CFU－E)产率，台盼蓝着色法判断造血细胞活率。结果：脐血细胞在4℃保存第1、2d时，MNC、细胞活率、CFU－GM和CFU－E产率均无明显改变，第3d-5d CFU-GM和CFU－E产率明显下降；1064脐血造血干／祖细胞在4℃保存第3d出现CFU－GM和CFU－E的下降，至第5d下降更显著；1064脐血造血干／祖细胞冷藏在－80℃和－196℃，在半年内CFU－GM、CFU－E、CD34^ 细胞及细胞周期无显著变化，在－80℃冷藏一年时，CFU－GM、CFU－E和CD34^ 阳性细胞下降显著，而－196℃储藏一年时，上述指标及细胞周期无明显改变，98％以上的细胞处在G0－G1期。结论：脐血细胞4℃保存时间不宜超过3d；1064脐血造血干／祖细胞于－80℃和－196℃冷藏在半年内效果一致；－196℃长期冷藏脐血造血干／祖细胞是一种最可靠的方法，但－80℃冷藏脐血造血细胞是一种值得会尝试和实用、费用低的有效方法。     

骨髓基质细胞对多细胞因子介导人脐血单个核细胞体外扩增的影响

背景:体外扩增脐血造血细胞的目的是促进脐血造血细胞的植入能力,细胞因子介导的脐血造血细胞能使细胞数有效扩增,但同时也耗竭了具有分化潜能的造血干细胞.目的:观察骨髓基质细胞对多细胞因子组合介导人脐血单个核细胞体外扩增及扩增后黏附分子和CXCR4表达的影响.方法:将分离的人脐血单个核细胞接种在预先建立的人骨髓基质细胞层上,分组培养:对照组仅含有脐血单个核细胞;多种细胞因子+脐血单个核细胞组;骨髓基质细胞+脐血单个核细胞组;骨髓基质细胞+多种细胞因子+脐血单个核细胞组.培养0,7 d检测有核细胞数, CD34+细胞数及CD34+CXCR4+,CD34+CD62L+,CD34+CD49d+的细胞数.结果与结论:单纯骨髓基质细胞和单用细胞因子组均可有效地扩增脐血造血细胞,并提高造血细胞上CD49d,CD62L及 CXCR4表达.而单用细胞因子组促进脐血造血细胞扩增能力较单纯骨髓基质细胞强,提高造血细胞CD49d,CD62L及 CXCR4表达能力较单纯骨髓基质细胞差.提示骨髓基质细胞虽可支持脐血造血细胞扩增,但难以实现造血细胞的大量扩增,但在骨髓基质细胞层的支持下,多细胞因子可有效地促进脐血造血细胞的扩增,并优于单用细胞因子及骨髓基质细胞,证实骨髓基质细胞可协同多细胞因子有效地促进脐血单个核细胞的扩增,促进造血干细胞的黏附和趋化能力.     

CD45/SSC双参数设门分析法用于冻存细胞CD抗原检测

流式细胞仪检测CD抗原一般需新鲜标本，鉴于受检标本无法及时送检，有报道用联合开窗法检测液氮保存细胞的表面抗原表达，虽然结果与新鲜标本无明显差别，但方法较繁琐。为此，我们试用CD45／SSC双参数设门法，研究了-80℃低温保存标本的细胞表面抗原表达。