水溶性大豆异黄酮对破骨细胞分化和功能的影响

目的:研究水溶性大豆异黄酮(WSSI)对1,25-二羟基维生素D3诱导兔骨髓细胞分化形成破骨细胞样细胞以及兔成熟破骨细胞骨吸收功能的影响。方法:通过TRAP染色对骨髓细胞诱导分化形成的TRAP阳性多核巨细胞计数;用显微摄影结合计算机图像分析测定骨吸收造成的陷窝数目及表面积,以评价破骨细胞活性;用扫描电镜观察骨吸收陷窝的形态。结果:浓度为20.0、4.0、2.0和0.4μg/ml的水溶性大豆异黄酮既能抑制破骨细胞样细胞的形成(P<0.001),还能抑制成熟破骨细胞的骨吸收功能(P<0.001),具体表现在随着浓度的升高骨吸收陷窝数目及表面积减少。结论:WSSI可以明显抑制破骨细胞样细胞的形成和成熟破骨细胞的骨吸收功能。     

鲫鱼卵唾液酸糖蛋白对小鼠破骨细胞活性的影响

目的研究鲫鱼卵唾液酸糖蛋白(Carassius auratus sialyglycoproteins,CA-SGP)对破骨细胞活性的影响。方法通过M-CSF和RANKL体外诱导小鼠骨髓造血细胞分化,建立破骨细胞模型,以MTT法检测CA-SGP对破骨细胞前体细胞及破骨细胞增殖活性的影响;采用TRAP染色和TRAP含量测定法评价其对小鼠骨髓细胞向破骨细胞分化的影响;利用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测CA-SGP对小鼠破骨细胞促炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α分泌的影响。结果 CA-SGP对破骨细胞前体细胞和破骨细胞的增殖活性无影响,可明显抑制小鼠骨髓造血细胞向破骨细胞的分化,且在早期抑制作用最强。ELISA试剂盒检测结果表明,CA-SGP能明显降低小鼠破骨细胞IL-6、IL-1β和TNF-α的含量。结论鲫鱼卵唾液酸糖蛋白可明显抑制小鼠骨髓造血细胞向破骨细胞的分化以及破骨细胞炎症因子的分泌。     

1α,25-(OH)_2D_3促进骨细胞形成及骨吸收活性（英文）

目的研究1α,25-二羟维生素D_3(1α,25-(OH)_2D_3)对破骨细胞(osteoclast,OC)形成及骨吸收活性的影响。方法在巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor,M-CSF)和核因子-κB受体活化因子配体(receptor activator for nuclear factor-иB ligand,RANKL)诱导破骨细胞前体细胞RAW264.7细胞分化为OC的基础上,添加不同浓度1α,25-(OH)_2D_3(10~(-7),10~(-8)和10~(-9)mol/L),通过抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)染色鉴定成熟OC的形成,环境扫描电镜观察牛皮质骨片吸收陷窝。结果各浓度1α,25-(OH)_2D_3均可以促进RAW264.7细胞分化为OC,并增强其骨吸收活力。其中,10~(-8)mol/L的1α,25-(OH)_2D_3诱导效果最好,所形成的OC数最多,骨吸收活性最强。结论 1α,25-(OH)_2D_3能促进OC形成,增强骨吸收活性,从而调节骨代谢。     

成年大鼠腰椎成骨细胞和破骨细胞的体外培养

[目的]探讨正常大鼠腰椎骨组织成骨细胞和破骨细胞的体外培养方法。[方法]分离成年大鼠腰椎(L1～5),分别采用酶消化法分离获取成骨细胞,骨髓诱导法分离获取破骨细胞,并对在体外培养的成骨细胞和破骨细胞进行鉴定与功能评价。[结果]所培养的成骨细胞表达标志性分化基因,具有较好的钙化能力;破骨细胞表现为多核巨细胞外观,抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性,具有良好的骨吸收功能。[结论]成功分离、培养获得了成年大鼠腰椎成骨细胞和破骨细胞,为进一步研究骨质疏松腰椎并发症的预防与治疗方法打下基础。     

记忆T细胞CD45~+通过RANKL对破骨细胞的影响及调控

目的分析记忆T细胞CD45~+(CD45RO)通过核因子κβ受体活化因子配体(RANKL)对大鼠破骨细胞的影响及调控,观察其与骨质疏松发病机制相关性,旨在为未来骨质疏松的治疗提供新靶点。方法购入40只24 h内新生Wistar大鼠,使用机械分离法,取大鼠四肢长骨,经消化酶法提取破骨细胞,进行培养,后将大鼠处死经酒精浸泡后分离其股骨、肱骨及胫骨,剔除软组织与软骨骺,处理后,将大鼠随机分为A、B、C、D 4组,分别向内加入RANKL试剂,各组大鼠RANKL浓度分别为0μg/L、50μg/L、100μg/L、150μg/L,对比不同浓度RANKL大鼠模型破骨细胞数量、骨陷窝面积,同时计算破骨细胞所含细胞核数量,即核数目;测定不同RANKL浓度大鼠血清抗酒石酸酸性磷酸酶-5b(TRACP-5b)表达及CD45RO表达;并分析CD45RO表达与破骨细胞数量、骨陷窝面积及核数目的相关性。结果随着RANKL浓度增加,大鼠破骨细胞数量增加、骨陷窝面积增加、核数量增加,TRACP-5b、CD45RO表达均升高,但C组与D组比较差异无统计学意义(P> 0. 05),其他各组组间比较差异有统计学意义(P <0. 05)。经双变量Pearson相关性分析检验证实,大鼠CD45RO与破骨细胞数量、骨陷窝面积、核数目均呈正相关(r=0. 958、0. 834、0. 972,P <0. 05)。结论记忆T细胞CD45~+能够产生大量炎性因子,通过对RANKL/RANK/OPG信号传导系统的直接作用,对破骨细胞及成骨细胞产生影响,来促进骨吸收,抑制骨形成,可能参加了骨质疏松的调控,可将其作为未来骨质疏松治疗研究的新靶点。     

成纤维母细胞样基质细胞在人工假体无菌性松动中的作用

目的研究成纤维母细胞样基质细胞（FBSCs）在人工关节置换术后无菌性松动中的作用。方法酶消化法从人工假体周围假膜标本中分离FBSCs并作体外培养并加入骨水泥颗粒,检测FBSCs核因子KB受体激动剂配体（RANKL）和肿瘤坏死因子（TNFα）mRNA表达的变化。同时FBSCs与外周血单个核细胞共培养,加入巨噬细胞克隆集落刺激因子、骨保护素或抗TNFα中和抗体;检测破骨细胞的形成并比较其生物学活性。结果假膜组织来源的FBSCs均表达RANKL和TNFamRNA;骨水泥颗粒组FBSCs RANKL和TNFα mRNA的表达量分别是对照组的1．9倍和2．1倍（P=0．002;P=0．004）。共培养细胞培养终末时见到抗酒石酸磷酸酶染色阳性的多核细胞,同时象牙磨片上有虫噬样骨吸收陷窝的形成;OPG完全阻断共培养组抗酒石酸磷酸酶染色阳性多核细胞以及虫噬样骨吸收陷窝的形成,而TNFα中和抗体对上述现象无显著抑制作用。结论骨水泥颗粒显著增强人工假体周围假膜中FBSCs RANKL和TNF mRNA的表达;FBSCs通过表达RANKL而支持外周血单个核细胞分化为具有骨吸收活性的破骨细胞。     

辛伐他汀对人骨髓基质细胞成骨、成脂分化的作用及其机制

[目的]研究辛伐他汀对体外培养的成人骨髓基质细胞成骨分化和成脂分化的影响,并探讨其作用机制。[方法]分离健康成人骨髓基质细胞进行培养,传代后骨分化诱导组和脂肪分化诱导组分别添加10-7mol/L的辛伐他汀,同时进行空白对照。实时荧光定量PCR检测转录因子Cbfa1在成骨细胞中的分化,PPARγ2和LPL在脂肪细胞分化过程中的表达;碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒检测成骨细胞ALP比活性;流式细胞仪、油红O(oilredO)染色检测细胞成脂分化能力。[结果]骨分化诱导组Cbfa1表达(P﹤0.01)、ALP比活性(P﹤0.05)均高于对照组,脂肪分化诱导组PPARγ2(P﹤0.01)、LPL(P﹤0.05)表达均低于对照组;流式细胞仪脂肪细胞计数及脂肪细胞形成脂滴能力实验组均低于对照组。[结论]10-7mol/L辛伐他汀能促进Cbfa1的表达,增强成骨细胞ALP比活性和细胞外基质矿化;抑制PPARγ2、LPL的表达及脂肪细胞分化。     

基质Gla蛋白对骨量的调节作用及其机制

目的 检测基质Gla蛋白（MGP）对小鼠骨量的影响,分析其作用机制。 方法 利用腺相关病毒干涉小鼠体内MGP基因表达,microCT扫描分析检测小鼠骨量,利用抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色检测小鼠股骨破骨细胞的数目,利用ELISA检测骨转换标志物TRAP5b水平。 结果 与对照组相比,经过MGP干扰处理的小鼠骨体积分数显著降低,骨小梁数目和骨小梁厚度也显著减少,骨小梁间隔显著增高,差异均有统计学意义（均P<0.01）。小鼠股骨切片TRAP阳性破骨细胞数目增多,血清TRAP5b水平显著增加（P<0.01）。 结论 MGP可能通过抑制破骨细胞形成和骨吸收来维持骨量。     

Ca~(2+)信号对1α,25-(OH)_2D_3调控破骨细胞形成及骨吸收活性的影响

目的探讨Ca2+信号对1α,25-二羟维生素D3(1α,25-(OH)2D3)调控破骨细胞(osteoclast,OC)形成及骨吸收活性的影响。方法在巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,M-CSF)及核因子-κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL)联合诱导RAW264.7细胞分化为OC的基础上,添加10-8 mol/L 1α,25-(OH)2D3,并设Ca2+螯合剂1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N`,N`-四乙酸四乙酸甲酯(BAPTA-AM)干预组,通过抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色鉴定OC的形成,环境扫描电镜观察牛皮质骨片吸收陷窝。结果添加10-8 mol/L 1α,25-(OH)2D3可显著增加OC数量,促进骨吸收活性。然而,与添加10-8 mol/L 1α,25-(OH)2D3比较,5μmol/L BAPTA-AM干预可显著降低OC数量,抑制骨吸收活性。结论 10-8 mol/L 1α,25-(OH)2D3能够促进OC形成和骨吸收活性,此过程涉及Ca2+信号机制。     

异补骨脂素对磷酸三钙颗粒诱导骨溶解抑制作用

目的研究异补骨脂素抑制磷酸三钙(tricalciumphosphate,TCP)磨损颗粒诱导小鼠颅骨溶解作用。方法取36只雄性ICR小鼠,随机分为假手术组、TCP颗粒组和异补骨脂素干预组(isopsoralen,20 mg/kg)。采用TCP颗粒诱导小鼠颅骨溶解模型,于术后D2颅顶局部注射异补骨脂素,每周3次,2 w后处死动物取颅骨及其骨膜。通过H.E.染色和抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)染色观察颅骨表面炎症反应、破骨细胞形成和骨吸收程度,研究异补骨脂素对TCP颗粒诱导骨溶解的影响;应用ELISA法检测颅骨骨膜TNF-α、IL-1β和IL-6水平,观察异补骨脂素对TCP颗粒诱导的炎症因子释放影响;通过检测骨组织中破骨细胞特异性标志物TRAP和组织蛋白酶K(cathepsin K)活性及其m RNA水平的变化,探讨异补骨脂素对破骨细胞功能的影响。结果异补骨脂素可明显抑制TCP颗粒诱导破骨细胞形成和骨溶解;同时显著降低骨组织中TRAP和cathepsin K的活性及m RNA表达,阻断TCP颗粒诱导的炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6释放。结论异补骨脂素能有效抑制TCP颗粒诱导的骨溶解,可作为防治磨损颗粒诱导骨溶解和关节晚期松动的候选药物,减少磨损颗粒所致的骨溶解和关节松动的发生。     

KYMASIN UP Natural Product Inhibits Osteoclastogenesis and Improves Osteoblast Activity by Modulating Src and p38 MAPK

The imbalance in osteoblast (OB)-dependent bone formation in favor of osteoclast (OC)-dependent bone resorption is the main cause of loss of tissue mineral mass during bone remodeling leading to osteoporosis conditions. Thus, the suppression of OC activity together with the improvement in the OB activity has been proposed as an effective therapy for maintaining bone mass during aging. We tested the new dietary product, KYMASIN UP containing standardized Withania somnifera, Silybum marianum and Trigonella foenum-graecum herbal extracts or the single extracts in in vitro models mimicking osteoclastogenesis (i.e., RAW 264.7 cells treated with RANKL, receptor activator of nuclear factor kappa-Β ligand) and OB differentiation (i.e., C2C12 myoblasts treated with BMP2, bone morphogenetic protein 2). We found that the dietary product reduces RANKL-dependent TRAP (tartrate-resistant acid phosphatase)-positive cells (i.e., OCs) formation and TRAP activity, and down-regulates osteoclastogenic markers by reducing Src (non-receptor tyrosine kinase) and p38 MAPK (mitogen-activated protein kinase) activation. Withania somnifera appears as the main extract responsible for the anti-osteoclastogenic effect of the product. Moreover, KYMASIN UP maintains a physiological release of the soluble decoy receptor for RANKL, OPG (osteoprotegerin), in osteoporotic conditions and increases calcium mineralization in C2C12-derived OBs. Interestingly, KYMASIN UP induces differentiation in human primary OB-like cells derived from osteoporotic subjects. Based on our results, KYMASIN UP or Withania somnifera-based dietary supplements might be suggested to reverse the age-related functional decline of bone tissue by re-balancing the activity of OBs and OCs, thus improving the quality of life in the elderly and reducing social and health-care costs.     

自体骨髓基质干细胞移植对大鼠脊髓损伤的疗效

[目的]观察自体骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)移植对大鼠脊髓损伤(SCI)的治疗效果。[方法]体外分离纯化大鼠骨髓基质干细胞,取46例Wistar大鼠采用改良的Allen’s装置在T11水平制成大鼠脊髓损伤模型,随机分成基质干细胞(MSCs)移植组(n=23)和对照组(n=23),分别于术后1、4周通过BBB评分观察大鼠SCI后功能的恢复情况。[结果]术前所有大鼠BBB评分均为21分,脊髓损伤后为0分,所有大鼠神经功能缺损症状随着时间的推移都有不同程度的减轻。两组术后4周时BBB评分均较术后1周时高,差异有统计学意义(P﹤0.05)。移植组术后1、4周时BBB评分均高于对照组,差异有统计学意义(P﹤0.05)。[结论]BMSCs移植有助于大鼠脊髓损伤后的修复重建和功能恢复。     

介孔纳米SiO2致小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞毒性与氧化损伤

[目的]探讨介孔纳米SiO2对小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞的毒性和氧化损伤作用。[方法]设4个浓度组（2.5、10、50、100I.tg／mL）和生理盐水对照组,染毒24h后,用四甲基偶氮唑盐（MTT）方法观察细胞毒性,并根据染毒后细胞的总蛋白（TP）、乳酸脱氢酶（LDH）、一氧化氮（NO）、谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）的变化情况分析介孔纳米SiO2的细胞毒性和氧化损伤作用。[结果]10、50和100μg／mL浓度组细胞存活率随着染毒浓度的升高而降低,差异有统计学意义;50、100μg／mL浓度组细胞及其上清液中TP、LDH、NO和MDA含量随染毒浓度增加而升高,而GSH和SOD含量降低;而且与细胞发生融解破碎、间隙加大等形态学改变情况相符。[结论]介孔纳米SiO2对体外培养巨噬细胞株RAW264.7具有细胞毒性和氧化损伤作用,且随剂量的加大而增强。     

腺病毒介导LMP-1基因治疗骨缺损的实验研究

[目的]探讨以PLGA为支架,用含腺病毒介导的LMP-1修饰BMSCs修复胫骨缺损的可行性。[方法]分离兔骨髓间充质干细胞;应用AdEasy腺病毒载体系统构建人LMP-l基因的腺病毒重组体,并检测感染病毒的兔骨髓间充质干细胞。测定LMP-1阳性细胞的数量,测定各组细胞ALP、OC、COL1表达。建立胫骨近端骨缺损新西兰大白兔模型,以PLGA为支架材料,分为4组:Ad LMP-1转染组、AdLacZ转染组、空白组和阳性对照组。术后2周、4周、8周每组处死动物,动态观察并比较缺损区新骨面积,分析其在骨缺损修复过程中的作用。[结果]成功分离兔MSC。同源重组成功构建AdLMP-1。体外实验MTT法分析表明AdLMP-1对MSC增殖无明显作用。AdLMP-1可促进OC和I型胶原蛋白的合成和分泌。第4、8周时阳性对照组和AdLMP-1转染组的成骨量明显增高(P﹤0.05),随时间延长,成骨均以线性增长,AdLMP-1转染组的成骨量则显著高于阳性对照组(P﹤0.05)。Ad-Lacz转染组和空白组比较差异无统计学意义(P﹥0.05),第4、8周时尤为明显。说明AdLMP-1可促进成骨量增加。[结论]构建的Ad LMP-1能高效转染MSCs,且转染后的细胞能促进OC和I型胶原蛋白的合成和分泌。PLGA为支架携带腺病毒介导的LMP-1的BMSCs具有明确的骨缺损修复能力,为临床促进骨折愈合提供了一种有效的方法和材料。     

微波预先辐照致γ射线对小鼠骨髓基质细胞毒性作用的改变

[目的]探讨微波预先辐照对γ射线致骨髓基质细胞凋亡、线粒体膜电位、胞内游离Ca^2＋浓度和Ca^2＋ Mg^2＋-ATP酶活性改变的影响。[方法]将原代培养的骨髓基质细胞随机分为正常对照组、单纯微波组、单纯γ射线组和联合组。12μW／cm。微波对单纯微波组和联合组连续辐照7d,每天1h,第8天对单纯丫射线组和联合组进行5Gy的γ射线照射。用钙离子依赖性磷脂结合蛋白．异硫氰酸荧光素及碘化丙啶（Annexin V-FITC及PI）双标记法检测细胞凋亡,流式细胞仪检测线粒体膜电位和胞内游离Ca^2＋浓度,试剂盒检测Ca^2＋ Mg^2＋-ATP酶活性。[结果]与正常对照组相比,各处理组细胞的凋亡率和线粒体膜电位未见明显改变。γ射线照射后24h,单纯微波组、联合组和单纯γ射线组细胞内游离Ca^2＋浓度明显升高（P〈0．05）,Ca^2＋ Mg^2＋-ATP酶活性明显降低（P〈0．05）.与单纯γ射线组相比,联合组细胞内游离Ca^2＋浓度明显降低（P〈0．05）,Ca^2＋ Mg^2＋-ATP酶活性明显升高（尸〈0．05o[结论]本实验条件下,900MHz,12μW／cm。的微波辐射和5Gvl,射线均不能引起细胞凋亡率、线粒体膜电位的明显变化,但能导致胞内游离Ca^2＋浓度明显上升和Ca^2＋ ATP酶活性明显降低。预先微波辐照能够明显减弱γ射线引起的胞内游离Ca^2＋浓度和Ca^2＋ Mg^2＋-ATP酶活性改变。     

转基因技术及骨髓间充质干细胞在骨缺损修复中的应用与展望

骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）是一类存在骨髓内的非造血干细胞,具有较强的增殖功能及多向分化潜能.在一些细胞因子的诱导下可以向成骨系细胞、内皮细胞、成纤维系细胞、成软骨系细胞等方向分化,近年来已成为生物学和医学的研究热点.而转基因技术是一项目前较为热门的生物科技技术.本文简要介绍了不同基因如骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein,BMP）、血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、软骨源性形态发生蛋白1（cartilage-derived morphogenetic protein 1,CDMP-1）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）、成骨生长肽（osteogenic growth peptide,OGP）等通过转染后对BMSCs增殖、分化的影响及其在骨缺损修复中的应用.     

甲醛与苯对小鼠遗传毒性联合作用的研究

目的探讨甲醛和苯对小鼠遗传毒性的联合作用。方法将健康昆明种小鼠随机分为阴性对照组、甲醛组、苯组、联合组、阳性对照组,进行小鼠骨髓细胞微核试验及精子畸形试验。结果苯组、甲醛组和甲醛、苯联合组小鼠骨髓细胞微核率分别为（13．5±1．27）‰、（11．9±0．99）‰、（25．5±1．58）‰及精子畸形率分别为（101．2±4．22）‰、（94．8±3．71）‰、（167．2±3．78）‰,均明显高于各自的阴性对照组（P〈0．01）。析因分析表明,甲醛和苯联合染毒致小鼠骨髓细胞微核率及精子畸形率交互作用显著（P〈0．01）。结论析因分析量效曲线随染毒剂量增大而远离,甲醛及苯联合染毒对小鼠遗传毒性有协同作用。     

Hijikia fusiforme protects against ovariectomy-induced bone loss in rats

The prophylactic effects of Hijikia fusiforme on bone metabolism were examined using in vitro indices of bone formation and resorption. As the indices of bone formation, osteoblast proliferation and differentiation were measured through mitochondrial enzyme activity [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay] and bone marker alkaline phosphatase (ALP) activity. The aqueous extract of H. fusiforme stimulated the proliferation of the human osteoblast-like cell line MG63 and the ALP activity of the mouse osteoblast-like cell line MC3T3-E1. Moreover, extracellular matrix mineralization was accelerated by the addition of H. fusiforme. As the indices of bone resorption, differentiation of the murine macrophage/osteoclast precursor cell line RAW 264.7 by receptor activator of nuclear factor-κB ligand (RANKL) was measured as tartrate-resistant acid phosphatase-positive multinucleated cells, which were suppressed by H. fusiforme. Additionally, H. fusiforme lowered the secreted amount of RANKL that is required for the osteoclastic differentiation and activation, but the amount of osteoprotegerin as a decoy receptor for RANKL was not affected. The bone-protective effects of H. fusiforme in estrogen-deficient ovariectomized rats were also investigated. Osteoporosis was induced in female Sprague-Dawley rats by ovariectomy for 15 weeks, and then H. fusiforme was orally administered at a dose of 100 mg/kg of body weight every day for 6 weeks. Bone mineral density in the group orally administered H. fusiforme was increased, compared with ovariectomized rats, but not significantly (P>.05). Oral administration of H. fusiforme improved microarchitecture of bone in terms of bone volume (bone volume/total volume ratio) and trabecular separation (P<.05). The amounts of osteocalcin and C-telopeptide type I collagen in serum were measured as the biomarkers for bone formation and resorption. The level of osteocalcin in serum was increased, but not significantly. However, the level of C-telopeptide type I collagen in serum was significantly decreased (P<.05). When the results are taken together, the present study indicates that H. fusiforme might be useful in the treatment of osteoporosis.