人脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化过程免疫特性的研究

目的研究人脐带间充质干细胞(huMSCs)向胰岛素分泌细胞(IPCs)分化过程中的免疫学特性,为huMSCs作为胰岛细胞移植治疗1型糖尿病的细胞来源提供依据。方法以流式细胞术检测huMSCs及huMSCs源性IPCs的免疫表型;RT-PCR法检测huMSCs及huMSCs源性IPCs的HLA-A、HLA-DR基因的表达;CCK8法测定细胞增殖率,观察huMSCs及huMSCs源性IPCs对外周血单个核细胞增殖的影响。结果 huMSCs在体外培养条件诱导下,具有向胰岛素分泌细胞分化的潜能;huMSCs及huMSCs源性IPCs均不表达CD80、CD86、CD40、CD40L、HLA-DR,均表达HLA-A;huMSCs能够抑制PHA刺激的外周血单个核细胞的增殖,但huMSCs源性IPCs未见该作用。结论 huMSCs及huMSCs源性IPCs均具有低免疫原性,可作为胰岛细胞移植的细胞来源,huMSCs对免疫反应具有负调节作用,但huMSCs源性IPCs不具有该作用。     

脐血间充质干细胞对T淋巴细胞增殖和激活影响的实验研究

目的研究脐血源间充质干细胞(UCB-MSCs)对T淋巴细胞激活和增殖的影响。方法2006—2007年广西壮族自治区人民医院从脐血中分离和培养间充质干细胞,流式细胞术检测其表面标志以鉴定纯度;用B r-du法测定细胞增殖率,观察UCB-MSCs对异体T淋巴细胞增殖的影响;流式细胞仪检测共培养体系中CD6 9细胞水平。结果从脐血获得的MSCs免疫表型分析显示,其不表达HLA-II抗原。对PHA刺激的脐带血T淋巴细胞,UCB-MSCs对其的增殖反应具有抑制作用,呈细胞数量剂量依赖性;UCB-MSCs与脐带血单个核细胞共培养体系中,CD 69细胞比例降低,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论UCB-MSCs抑制PHA刺激的T淋巴的增殖及激活,这种抑制特性表明,UCB-MSCs对免疫反应具负调节作用,可能为GVHD的防治提供一条新途径。     

人脐带间充质干细胞与sertoli细胞共培养下向男性生殖细胞分化的研究

目的探讨用睾丸支持细胞(SCs)模拟的睾丸微环境,通过共培养技术诱导人脐带间充质干细胞(HUMSCs)向男性生殖细胞分化的可能性,为男性不育治疗寻求一种新的途径。方法采用差异贴壁法分离、培养、扩增出HUMSCs,从新生昆明小鼠的睾丸中分离培养出SCs,制备SCs饲养层,将HUMSC:s加入SCs饲养层中共培养,显微镜观察诱导前及诱导后第7 d、14 d细胞的形态学变化;RT-PCR、细胞免疫荧光检测男性生殖细胞相关标记DAZL、VASA及Stella的表达。结果 HUMSCs在共培养体系中逐渐失去细小成纤维样的形状,形成类似精原细胞样的圆形细胞菌落,诱导7 d、14 d后,RT-PCR、细胞免疫荧光均可以检测到男性生殖细胞特异性标记VASA、DAZL及Stella的表达。结论在睾丸SCs模拟的睾丸微环境,HUMSCs不仅发生形态学的变化,而且能表达生殖细胞的特异生物学特性,表明在特定的微环境中,细胞与细胞间的相互接触是微环境中控制HUMSCs向男性生殖细胞方向分化的必不可少的因素。SCs与HUMSCs的直接接触诱导其向男性生殖细胞分化的诱导研究,为迫切需要的男性不育治疗提供了一个新的实验参考系统。     

人脐带间充质干细胞向心肌样细胞分化的研究

目的探讨人脐带间充质干细胞（MSCs）向心肌样细胞分化可能性,为心肌细胞移植探索新细胞来源。方法采用5-氮杂胞苷（5-Aza）和二甲基亚砜（DMSO）诱导人脐带间充质干细胞分化。观察诱导后分化细胞形态变化,用免疫组织化学方法检测分化心肌样细胞的心肌肌钙蛋白I（troponin I）、心肌肌钙蛋白T（troponin T）和心肌结蛋白（desmin）,逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）测定分化的心肌样细胞是否有细胞心肌特异转录因子（Nkx2.5）和心肌细胞desmin的cDNA表达。结果人脐带MSCs经5-Aza和DMSO诱导后可向心肌样细胞分化,分化细胞表达心肌细胞的标记troponinI、troponinT和desmin。RT-PCR检测证实,人脐带MSCs诱导前不表达Nkx2.5和desmin,经5-Aza和DMSO诱导后表达心肌细胞标记Nkx2.5和desmin。结论人脐带间充质干细胞可以分化为心肌样细胞,5-Aza和DMSO可作为心肌细胞诱导剂,人脐带间充质干细胞可以作为心肌细胞的来源。     

人脐带间充质干细胞分化为胰岛β细胞的实验研究

目的 探讨人脐带华尔通胶质来源的问充质干细胞(MSCs)分化为胰岛素分泌细胞的可能性.方法 从足月剖宫产的新生儿脐带华尔通胶质中分离培养出MSCs,传至第5代用含尼克酰胺和β巯基乙醇的低糖达尔伯克必需基本培养基预诱导,以含尼克酰胺和β巯基乙醇的高糖达尔伯克必需培养基诱导其向胰岛素分泌细胞分化,应用免疫细胞化学法检测其胰岛素的表达,以双硫腙染色鉴定胰岛β细胞,并用放射免疫法检测诱导后细胞培养液中胰岛素水平,检测均以未诱导细胞作为实验对照.结果 免疫细胞化学法检测结果显示,经尼克酰胺和β巯基乙醇联合诱导后的人脐带MSCs表达胰岛β细胞的标记胰岛素.双硫腙染色发现脐带华尔通胶质来源的MSCs经尼克酰胺和β巯基乙醇诱导后细胞内锌离子增加.通过胰岛素放射免疫法检测诱导前后细胞培养液中胰岛素水平,实验组和对照组分别为(6.63±1.80)U/L和(3.39±0.21)U/L,差异具有统计学意义(P<0.05).结论 人脐带MSCs经尼克酰胺和β巯基乙醇联合诱导后可表达胰岛素β细胞的表面标记,增加细胞内锌离子水平,使之具备胰岛β细胞的特点,诱导后的细胞也可分泌胰岛素.用尼克酰胺和β巯基乙醇可诱导人脐带MSCs分化成为胰岛素分泌细胞,从而为1型糖尿病的细胞移植治疗提供新的细胞来源.     

人脐带间充质干细胞的生物学特性及向神经样细胞分化的研究

目的 研究人脐带华尔通胶来源的间充质干细胞（MSCs）的特性及向神经细胞分化的可能性,为神经移植寻找新的细胞来源。方法 检测人脐带来源的MSCs的细胞表面标记;丹参和B巯基乙醇诱导人脐带来源的MSCs向神经细胞分化,用免疫细胞化学方法对分化和未分化的细胞进行鉴定;半定量逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测细胞的神经相关基因表达。结果 从人脐带分离、培养的贴壁细胞,体外生长形态类似于成纤维细胞,可以维持在未分化状态稳定增殖,体外增殖超过10代。这类细胞MSCs的表面标记CD29、CD44、CD59、CD105仿呈现高表达,造血细胞表面标记CD14、CD33、CD34、CD27、CD45、CD117和与移植免疫排斥相关的表面标记CD80（137—1）、CD86（B7-2）、CD40、CD40L不表达或低表达。丹参和β巯基乙醇均可诱导人脐带MSCs向神经样细胞分化,分化的细胞表达神经干细胞的标记巢蛋白（Nestin）,神经元的标记类神经微管（β-TubulinⅢ）和神经微丝（NF）,以及神经胶质细胞的标记胶质纤维酸性蛋白（GFAP）。RT-PCR检测证实,经丹参诱导后的MSCs表达神经干细胞相关基因Nestin,诱导前和诱导后的MSCs均表达神经细胞基因Pleiotrophin,诱导后的表达明显增强。结论 人脐带华尔通胶含有丰富的MSCs,易于培养扩增,其表达MSCs的表面标记。不表达或低表达造血细胞和与移植排斥相关的细胞标记。人脐带来源的MSCs能分化为神经细胞,表达神经细胞的相关标记和基因,这种细胞可能成为中枢神经系统细胞移植的一个干细胞来源。     

丹参诱导人脐血间充质干细胞分化为神经样细胞

目的探讨丹参注射液对人脐血单个核细胞来源的间充质干细胞(MSCs)向神经细胞分化的诱导作用。方法利用FACScan流式细胞仪检测MSCs表面抗原CD29、CD44、CD59、CD33,用丹参注射液诱导人脐血原代细胞和脐血来源的间充质干细胞向神经细胞方向分化,并与神经生长因子(NGF)和神经常苷脂(GM1)的诱导作用比较,用免疫细胞化学方法对分化和未分化细胞进行鉴定。结果人脐血原代细胞中MSCs的表耐标记CD29、CD44、CD59阳性率分别为10.7%、37.27%和66.67%,而造血细胞的表面标记CD33阳性率仅为0.33%。人脐血传代细胞(第5代)MSCs的表面标记CD29、CD44、CD59的阳性率分别为40.2%、70.5%和95.4%。原代培养的贴壁细胞形态呈大小不等圆形和条形,用丹参诱导可表达神经细胞的标记。传代培养的间充质干细胞,可维持在未分化状态稳定增殖。用丹参可诱导这种细胞向神经样细胞分化,表达神经干细胞标记nestin,神经元的标记β-Ⅲ类神经微管(β-TubulinⅢ)、神经微丝(NF)和神经胶质细胞的标记胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。与NGF和GMI的诱导作用比较,细胞形态类似,表达相同的神经细胞标记,丹参的诱导速度较快,诱导后细胞表达神经元标记的比例较高。结论人脐血是MSCs的来源之一,丹参可诱导人脐血干细胞分化为神经样细胞,丹参可作为神经诱导剂,人脐血干细胞可作为神经干细胞的来源。     

六个转录因子将人脐带间充质干细胞高效重编程为诱导性多能干细胞的实验研究

目的 建立人脐带间充质干细胞(HuMSCs)来源的诱导性多能干细胞(iPSC)系.方法 以慢病毒载体将OCT4、SOX2、KLF4、c-Myc、NANOG、LIN-28 6个转录因子转入HuMSCs使其重编程为iPSC.通过形态学观察、多能细胞特异性标志检测、碱性磷酸酶(AKP)染色、核型分析、拟胚体形成、体内成瘤实验鉴定获得的iPSC.结果 慢病毒感染后第4天,HuMSCs逐渐变成类圆形,第10天开始出现不规则细胞团,第14天出现较大的细胞团,约1.25％的细胞重编程为iPSC.建系后iPSC呈典型的克隆状生长,边缘清晰,内部细胞细小,排列紧密;AKP染色阳性;表达多能性相关基因及胚胎干细胞特异性蛋白;细胞核型正常(46,XY);体内外均能向3个胚层方向分化.结论 慢病毒携带OCT4、SOX2、KLF4、c-Myc、NANOG、LIN-28 6个因子能将HuMSCs高效诱导为完全重编程的iPSC.     

脐带间充质干细胞在精原细胞培养条件下的生殖细胞特性

目的 研究人脐带华尔通胶来源的间充质干细胞(MSCs)在精原细胞培养条件下向精原细胞方向分化的潜能.方法 采用组织块贴壁法获得MSCs,取第3代MSCs分组进行诱导培养:对照组用基本培养液培养,实验组用条件培养液培养.用倒置显微镜和扫描电镜观察对照组和实验组细胞的外部形态差异;透射电镜观察2组细胞内部的超微结构变化;免疫组织化学方法 检测2组细胞是否表达精原细胞的标记物CD117及CD49f;Western blot进一步检测2组细胞表达精原细胞特异性标记物CD49f的情况.结果 以人脐带华尔通胶为原料培养获得的贴壁细胞高表达MSCs相关的标记,不表达或低表达造血细胞和与移植排斥相关的细胞表面标记,并可以维持在未分化状态稳定生长、增殖;实验组细胞形态发生了明显变化,由成纤维细胞形变为圆形,并发现极少数变圆的细胞继续分化呈形似蝌蚪状,对照组细胞形态不发生类似变化,超微结构也显示了很大的差异;免疫组织化学证实实验组细胞表达精原细胞的标记物CD117、CD49f,而对照组细胞不表达CD49f,CD117弱阳性表达;Westem blot进一步证实人脐带MSCs诱导前不表达精原细胞标记CD49f,而诱导后表达CD49f.结论 用组织块贴壁法获得人脐带来源的MSCs,在精原细胞培养条件下进行诱导培养,不仅能发生精原细胞样的形态变化及伴发细胞的分化过程,而且能表达精原细胞的特征性标记,证实人脐带来源的MSCs具有向精原细胞方向分化的潜能.     

尘螨变应性哮喘患儿外周血T淋巴细胞中协同刺激分子和细胞因子的异常表达及其意义

目的分析变应原刺激前后变应性哮喘患儿外周血T淋巴细胞表面协同刺激分子及胞内细胞因子表达的变化,探讨CD28家族不同协同刺激信号在变应性哮喘免疫病理机制中的作用。方法选取尘螨变应性哮喘患儿(哮喘组)和健康儿童(健康对照组)各30例,密度梯度离心法分离其外周血单个核细胞,应用免疫荧光标记和流式细胞术检测尘螨刺激前后体外培养的CD4+T淋巴细胞表面协同刺激分子CD28、可诱导共刺激分子(ICOS)和细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)的表达,运用细胞内染色技术检测CD4+T淋巴细胞内细胞因子γ干扰素(IFN-γ)、IL-4和IL-13的表达。并运用统计学方法比较哮喘组和健康对照组之间的差异。结果哮喘组患儿外周血CD4+T淋巴细胞表面CD28和ICOS的表达与健康对照组比较差异均无统计学意义(Pa>0.05),而CTLA-4的表达显著降低(P<0.01);细胞内IFN-γ表达水平显著升高(P<0.000 1),而IL-4和IL-13表达水平无明显变化(Pa>0.05)。经尘螨刺激后,体外培养的哮喘患儿外周血CD4+T淋巴细胞表面ICOS的表达较健康对照组儿童显著上调(P<0.000 1),CD28和CTLA-4的表达则无明显变化(Pa>0.05);细胞内细胞因子IL-4和IL-13的表达显著上调(Pa<0.000 1),而IFN-γ的表达则无明显差异(P>0.05)。结论变应性哮喘患儿外周血存在组成性的CTLA-4的表达下调和细胞因子IFN-γ的表达上调,介导Th1型细胞的异常活化;而变应原尘螨的刺激又介导了ICOS依赖的Th2型细胞的分化,导致Th1/Th2失衡。     

先心病婴幼儿骨髓间充质干细胞向心肌样细胞诱导分化的实验研究

目的探讨先心病婴幼儿骨髓间充质干细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）向心肌样细胞诱导分化的可行性，为心肌组织工程提供新的种子细胞的来源。方法无菌条件下抽取先天性心脏病婴幼儿胸骨骨髓3～5ml，经密度梯度离心（Percoll分离液，T为1．073），接种获得BM～SCs，常规培养。流式细胞仪检测细胞表面抗原。将已传2代的细胞应用5-氮杂胞苷（5-Azacytidine，5Aza）诱导24h，更换为完全培养基（LG-DMEM）后继续培养，2周后行免疫细胞化学及透射电镜行超微结构检查。结果先心病婴幼儿BMSCs基本上为梭型成纤维细胞样形态，表面标记为CD29、CD44、CD71、CD90表达阳性，CD3、CD14、CD34、CD45、HLA-DR不表达。BMSCs经5-Aza诱导2周后α-actin，Desmin，cTnI，Cx-43免疫细胞化学染色阳性，透射电镜示诱导后的细胞有明显的肌丝，单个细胞核呈椭圆形，位于细胞的中央。结论先心病婴幼儿骨髓阃充质干细胞可在体外经5-Aza诱导分化为心肌样细胞，有望成为应用自体细胞体外构建工程化心肌重要的种子细胞。     

转化生长因子-β1和白介素-6对CD4~+CD25~-T细胞表型、细胞因子分泌及功能的影响

目的研究转化生长因子(TGF)-β1和白介素(IL)-6对体外培养CD4+CD25-T细胞表型及细胞因子分泌的影响。方法采用免疫磁珠分选法从健康人外周血中分离CD4+CD25-T细胞和CD4+CD25+nTreg细胞,分别或同时使用TGF-β1和IL-6体外刺激CD4+CD25-T细胞,培养120 h后检测细胞表型,以及细胞培养液中细胞因子水平。结果 CD4+CD25-T细胞在TGF-β1刺激下CD4+CD25+T细胞比例增高,细胞培养液中IL-10、IFN-γ、IL-4升高,IL-17降低,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.001);TGF-β1和IL-6联合刺激CD4+CD25-T细胞时,CD4+CD25+T细胞比例减少,细胞培养液中IL-10、IFN-γ、IL-4降低,IL-17水平增高,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.001)。结论 TGF-β1可诱导CD4+CD25-T细胞分化为CD4+CD25+Treg细胞;IL-6可抑制TGF-β1诱导CD4+CD25-T细胞分化为CD4+CD25+iTreg细胞,而促进Th17细胞的产生。     

免疫性血小板减少症患儿骨髓间充质干细胞与其他来源的间充质干细胞免疫调节作用的比较研究

目的比较免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenia,ITP)患儿与正常人骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)及脐带来源间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSCs)的性质及其对正常人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)分泌干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)、白介素-10(interleukin-10,IL-10)的调节能力。方法用密度梯度离心法体外分离培养16例ITP患儿和8例正常成人BMMSCs至5-6代,用酶消化法从10例健康胎儿脐带组织中分离培养UC-MSCs至5-6代。在培养过程中观察三种来源间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)形态,进行细胞表面分子及成脂成骨分化鉴定并用细胞增殖检测试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)检测三种MSCs的增殖能力。将上述三种MSCs用丝裂霉素(mitomycin C,MMC)处理后与植物血凝素(phytohaemagglutinin,PHA)刺激的PBMC按不同比例(1∶40,3∶40,9∶40)混合培养3 d,收集培养上清液。用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测各组共培养上清液中IL-10和IFN-γ的含量。结果三种MSCs有相似的细胞形态,UC-MSCs增殖速度最快,正常成人BMMSCs次之,ITP患儿BMMSCs最慢;三种MSCs有相似的分化能力。三种来源MSCs与PBMC以不同比例混合培养,随着MSCs比例的增加,PBMC分泌IL-10增加,在ITP患儿BMMSCs组中不同比例之间差异有显著性(P<0.05),而在正常人BMMSCs、UC-MSCs组中不同比例之间差异有非常显著性(P<0.01);随着MSCs比例的增加,PBMC分泌的IFN-γ减少,在ITP患儿及正常人BMMSCs组中不同比例之间差异有显著性(P<0.05),而在UC-MSCs组中不同比例之间差异有非常显著性(P<0.01)。在相同共培养比例条件下,三种MSCs刺激PBMC分泌IL-10和IFN-γ的量差异均无显著性(P>0.05)。结论 ITP患儿BMMSCs较其他两种来源的MSCs增殖速度慢,说明其体外增殖存在缺陷。但ITP患儿BMMSCs与其他两种来源MSCs对PBMC分泌IL-10、IFN-γ的调节具有相同的特点,即促进IL-10分泌,抑制IFN-γ分泌,均呈剂量依赖性,即三种细胞调节PBMC分泌IL-10及IFN-γ能力未见明显差异。     

体外扩增脐血间充质干细胞的生物学特性和

目的从脐血中分离单个核细胞(MNCs),体外培养扩增间充质干细胞(MSCs)并研究其生物学特性和诱导分化潜能.方法取35份足月顺产新生儿脐血,密度梯度离心法分离出其中的MNCs,采用含胎牛血清的DMEM培养基体外培养扩增MSCs.显微镜下观察MSCs的形态、细胞化学染色,流式细胞仪测定MSCs的细胞免疫表型,体外诱导分化实验检测MSCs分化成骨细胞、脂肪细胞和神经细胞的能力.结果从12份脐血中可培养出MSCs,形态上与从其他来源的MSCs类似,可传至20代而无形态上的变化.细胞化学染色示碱性磷酸酶(ALP)阴性,非特异性酯酶--α-丁酸萘酚酯酶(alpha-naphthol butyric acid esterase,NBE)阳性.其表达CD29、CD44和CD105,特别是人类MSCs标记SH-2 和 SH-3 阳性,而CD3、CD14、CD19、CD34和CD45阴性,说明它们并非来自造血细胞.这些MSCs在适当诱导分化剂的作用下,2周左右可以诱导分化形成骨细胞, 20天左右可以诱导分化形成脂肪细胞.脐血MSCs预诱导12 h后,胞体发生收缩,细胞边缘有细的突起.正式诱导5 h后大多数细胞呈现典型的神经元样.结论胎儿脐血MNCs可分离培养出MSCs.这些MSCs具有与其他来源MSCs类似的表型及分化潜能.     

溴隐亭对植物血凝素诱导活化T淋巴细胞的影响

目的 研究溴隐亭(BRC)对植物血凝素(PHA)诱导活化T淋巴细胞的影响.方法 用泌乳素(PRL)与BBC单独和联合刺激培养PHA诱导活化的CD4 T淋巴细胞系Jurkat E6-1细胞,利用实时聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测活化T淋巴细胞重要信号分子转接蛋白(LAT)、T细胞受体相关的相对分子质量为70000的蛋白激酶ζ链(ZAP-70)mRNA表达变化情况;利用Real time-PCR方法检测活化T淋巴细胞自身PRL mRNA表达变化情况;利用流式细胞术检测T淋巴细胞活化早期表面标志细胞分化抗原CD25分子表达变化情况;利用脂质体转染荧光素酶报告系统检测T淋巴细胞活化的核转录因子-kB(NF-kB)活性变化情况.结果 1.BRC可抑制PHA诱导的T淋巴细胞活化和PRL-泌乳素受体(PRLR)信号转导途径的共同信号分子ZAP-70 mRNA及活化T淋巴细胞自身PRL mRNA的表达;2.BRC促进了活化T淋巴细胞信号分子LAT mRNA和活化T淋巴细胞表面CD25分子的表达;3.BRC抑制了PHA诱导的活化T淋巴细胞核NF-kB活性.结论 BRC可通过抑制T淋巴细胞活化和PRL-PRLR途径中的共同信号分子ZAP-70及活化T淋巴细胞自身PRL mRNA分泌,对T淋巴细胞活化发挥抑制作用.     

体外扩增脐血间充质干细胞的生物学特性和诱导分化能力的研究

目的 从脐血中分离单个核细胞(MNCs)，体外培养扩增间充质干细胞(MSCs)并研究其生物学特性和诱导分化潜能。方法 取35份足月顺产新生儿脐血，密度梯度离心法分离出其中的MNCs，采用含胎牛血清的DMEM培养基体外培养扩增MSCs。显微镜下观察MSCs的形态、细胞化学染色，流式细胞仪测定MSCs的细胞免疫表型，体外诱导分化实验检测MSCs分化成骨细胞、脂肪细胞和神经细胞的能力。结果 从12份脐血中可培养出MSCs，形态上与从其他来源的MSCs类似，可传至20代而无形态上的变化。细胞化学染色示碱性磷酸酶(ALP)阴性，非特异性酯酶——α-丁酸萘酚酯酶(alpha-naphthol butyrjc acid esterase，NBE)阳性。其表达CD29、CD44和CD105，特别是人类MSCs标记SH-2和SH-3阳性，而CD3、CD14、CD19、CD34和CD45阴性，说明它们并非来自造血细胞。这些MSCs在适当诱导分化剂的作用下，2周左右可以诱导分化形成骨细胞，20天左右可以诱导分化形成脂肪细胞。脐血MSCs预诱导12h后，胞体发生收缩，细胞边缘有细的突起。正式诱导5h后大多数细胞呈现典型的神经元样。结论 胎儿脐血MNCs可分离培养出MSCs。这些MSCs具有与其他来源MSCs类似的表型及分化潜能。     

人脐带间充质干细胞源性心肌细胞的纯化及生物学特性鉴定

目的 探讨基因修饰的方法纯化人脐带间充质干细胞源性心肌细胞的可行性,为临床心肌细胞移植寻找新的干细胞来源。方法 将人心肌球蛋白轻链（MLC-2v）基因启动子与嘌呤霉素抗性基因融合,然后转染人脐带间充质干细胞,通过嘌呤霉素筛选,纯化培养出 MLC-2v阳性细胞,用5-氮杂胞苷进行诱导,检测诱导后 MLC-2v阳性细胞是否表达心脏相关标记物。结果 纯化培养出的 MLC-2v阳性细胞经5-氮杂胞苷诱导后表达心肌细胞的标记物肌钙蛋白Ⅰ(troponin Ⅰ)、MLC-2v和结蛋白(desmin)。RT-PCR检测证实,人脐带间充质干细胞在转染及诱导前不表达Nkx2.5和desmin,经筛选诱导后细胞表达Nkx2.5和desmin。结论 人脐带间充质干细胞通过基因修饰方法可以得到相对纯化的心肌样细胞,可能成为心脏细胞移植治疗重要的细胞来源。     

SV40T抗原基因介导尿源性干细胞永生化

目的 建立猿肾病毒40大T抗原(SV40Tag)永生化尿源性干细胞,为组织工程学及再生医学提供稳定的细胞来源.方法 利用脂质体(Lipofectamine2000)介导将含SV40Tag基因质粒pMPH-FRT-SV40T及转座酶质粒(transposase)共转染至临床分离的尿源性干细胞中.潮霉素(Hy-gromycin)筛选后阳性细胞克隆并连续传代,观察细胞形态学以及增殖情况,RT-PCR,免疫荧光等检测转染细胞的生物学特性,细胞裸鼠皮下注射检测其安全性.结果 筛选获得的阳性克隆扩大培养,即永生化尿源性干细胞(imrnorterlized urine derived stem cell,iUSC),增殖能力强,能连续传代培养.RT-PCR证实iUSC表达SV40Tag基因,而用翻转重组酶(Flippers recombination enzyme Flp)处理iUSC可敲除RFT-SV40Tag基因而逆转永生化.应用免疫荧光细胞化学技术检测该细胞株表达干细胞表面标志物CD73,CD44,CD90 (Thy-1),CD29 (Integrin),CD105 (Endoglin),CD166 (ALCAM),BMPR Ⅱ,SSEA4,CD117,CD133;BMP9可诱导其分化为成骨细胞,脂肪细胞,具备干细胞多向分化能力;转染细胞2×106个/点接种裸鼠,连续观察4周无肿瘤形成.结论 脂质体转染技术成功构建SV40Tag永生化尿源性干细胞,该细胞株仍具有干细胞增殖及多向分化潜能,为组织工程学及再生医学的体外研究和发展应用提供了安全稳定的细胞来源.     

胶质细胞源性神经营养因子和神经营养素-3双基因转染大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经样细胞的研究

目的 探讨胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和神经营养素3(NT-3)双基因修饰诱导的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化为神经样细胞的可行性以及GDNF和NT-3的表达变化.方法 全骨髓法分离培养BMSCs,流式细胞术检测BMSCs标志CD90和造血干细胞标志CD45.转染带荧光的GDNF和NT-3基因,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达及细胞形态变化;免疫荧光检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)和神经胶质酸性蛋白(GFAP)表达;Western blot 检测细胞中GDNF及NT-3蛋白表达.对照组为未转染GDNF和NT-3基因的BMSCs.结果 BMSCs能在体外成功分离培养,细胞高表达CD90(92.7%),不表达CD45.诱导分化后,BMSCs胞体变圆,伸出明显突起,并可见多数细胞相互交织成网状结构,呈神经细胞样形态.免疫荧光标记检测可见实验组细胞表达NSE和NF,而不表达GFAP.而对照组阴性.Western blot检测可见细胞GDNF及NT-3蛋白表达增强.结论 GDNF和NT-3双基因修饰诱导的BMSCs可分化为神经样细胞并表达神经元的标志,为基因治疗神经系统疾病如先天性巨结肠提供实验基础.     

体外活化脐血免疫活性细胞输注治疗小儿急性淋巴细胞白血病微量残留病疗效观察

目的　观察体外激活培养的脐血免疫活性细胞对急性淋巴细胞白血病患儿微量残留病 (MRD)的免疫治疗作用。方法　收集无菌ACD抗凝脐血 ,进行单个核细胞分离与植物血凝素 (PHA)培养 ,采用APAAP免疫组化方法进行PHA激活培养前后CD3、CD4、CD8测定。应用ELISA检测肿瘤坏死因子α(TNF α) ,利用PCR法对克隆性重排的T细胞受体 (TCR)基因进行MRD测定。结果　①脐血经Ficoll分离、PHA激活培养后 ,其中淋巴细胞占优势 ;②激活后脐血中表达CD3、CD4、CD8抗原淋巴细胞比例增高 ;③PHA激活前脐血TNF α <10ng/L ,激活后TNF α维持在较高水平 ,超过 6 0 0ng/L ;④ 6例ALL患儿输注前MRD均阳性 ,有 3例经多次输注 ,1年后外周血、骨髓中MRD全部阴性 ,余 3例外周血MRD消失 ,骨髓中MRD减少。在输注过程中有 2例出现寒战、体温上升 ,1例出现皮疹。结论　体外活化脐血免疫活性细胞多次输注后MRD可减少、消失 ;这可能与活化免疫细胞能够分泌抗肿瘤细胞因子有关