TNFα对人脂肪细胞STEAP4基因表达的调控

目的：人STEAP4基因是一个参与胰岛素敏感性调节的肥胖相关差异表达基因,本研究旨在探讨胰岛素抵抗相关脂源性细胞因子TNFα对人成熟脂肪细胞中STEAP4基因的调节作用。方法：体外培养人前体脂肪细胞,在诱导人前体脂肪细胞分化成熟的基础上,应用不同浓度（0、5、10、25、50 ng/mL）人重组TNFα干预成熟脂肪细胞24 h,采用实时荧光定量RT-PCR技术、Western blot技术检测干预后人成熟脂肪细胞STEAP4基因在核酸和蛋白表达水平的变化。结果：不同浓度TNFα（5、10、25、50 ng/mL）干预24 h能显著上调人成熟脂肪细胞中STEAP4基因的mRNA表达,与未干预对照组差异有显著性（P<0.05）;50 ng/mL TNFα干预时STEAP4基因在人成熟脂肪细胞中的mRNA表达水平最高。与基因表达结果相一致,不同浓度TNFα（5、10、25、50 ng/mL）干预24 h能显著上调人成熟脂肪细胞中STEAP4蛋白的表达,与未干预对照组差异有显著性（P<0.05）;干预浓度提高到25 ng/mL 时干预效果最为明显。结论：TNFα能显著上调人成熟脂肪细胞中STEAP4基因核酸和蛋白的表达。［中国当代儿科杂志,2009,11（12）：1008-1011］     

STEAP4基因在人前体脂肪细胞诱导分化过程中的表达

目的观察人肥胖相关全长新基因STEAP4在人前体脂肪细胞诱导分化过程中不同时段表达水平的变化,探讨STEAP4基因与脂肪细胞分化、脂质积聚的关系。方法体外培养人前体脂肪细胞,待细胞生长融合后以1-甲基-3-异丁基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素及罗格列酮联合诱导方案,在体外诱导其分化为成熟脂肪细胞。在前体脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化过程中观察细胞形态及脂质积聚变化;采用实时荧光定量RT-PCR技术检测诱导分化不同时段(前体,第0、4、6、8、11、14、17天)脂肪细胞中STEAP4基因mRNA的表达水平。结果STEAP4基因高表达于人前体脂肪细胞;加入脂肪细胞分化诱导剂后(第4天)表达略有上调,其后随脂肪细胞分化成熟该基因表达量呈逐渐下降趋势;至脂肪细胞完全分化成熟(第14-17天)表达量最低。STEAP4基因表达水平除在诱导分化前至第4天、第14-17天差异无统计学意义外,余各时间点的表达水平差异均有统计学意义(Pa<0.05)。结论STEAP4基因随脂肪细胞分化成熟表达逐渐下调,可促进脂肪细胞的分化成熟和脂质积聚,与肥胖的发生有关。     

丝裂原活化蛋白激酶8基因在3T3-L1细胞诱导分化中表达水平的变化及肿瘤坏死因子-α对其调节的作用

目的观察丝裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)基因在3T3-L1脂肪前体细胞诱导分化过程中表达水平的变化,探讨TNF-α,对成熟脂肪细胞中MAPK8基因表达水平的调节作用,分析MAPK8基因与脂肪细胞分化、脂质形成及肥胖间的关系。方法体外培养3T3-L1脂肪前体细胞,在诱导其分化成熟的基础上,采用RT-PCR技术检测诱导分化不同时段(0~10 d)脂肪细胞中MAPK8基因的表达水平;应用重组TNF-α(0.1,1.0,10.0μg/L)干预分化成熟的脂肪细胞,采用RT-PCR技术检测TNF-α干预后不同时间(0.5,2,6,12,24 h)脂肪细胞中MAPK8基因的表达水平。结果1.3T3-L1前体脂肪细胞中,MAPK8基因表达水平较高。应用地塞米松(DEX)、1-甲基-3-异丁基黄嘌呤(MIX)、胰岛素后脂肪细胞逐渐分化成熟,MAPK8基因mRNA表达水平逐渐减低。MAPK8基因表达水平除在诱导分化前至d4、d2~5、d6~10时段内无显著性差异外(P均>0.05),余各时段间表达水平均有显著差异(P均<0.01);2.不同浓度重组TNF-α干预成熟脂肪细胞,均能显著上调MAPK8基因的表达,并呈现随TNF-α浓度增加、刺激时间延长,表达调控作用逐渐增强的总体趋势。TNF-α浓度为0.1μg/L时,MAPK8基因的表达水平于干预12 h时间点开始出现明显上调;浓度增加至1.0μg/L时,MAPK8基因表达水平开始显著上调的时间点提前至干预2 h时,但24 h时间点的表达水平未见继续上调;TNF-α浓度为10.0μg/L时,除2 h时间点MAPK8基因表达开始显著上调外,12~24 h时段的表达也呈上调趋势。结论1.MAPK8基因在3T3-L1细胞分化过程中表达逐渐下调,其机制可能有利于脂肪细胞的分化成熟和脂质积聚,与肥胖发生有关;2.TNF-α能够上调成熟脂肪细胞中MAPK8基因的表达,其效应总体趋势上呈现剂量及时间反应性特征。     

Ⅱ型钙调蛋白激酶δ亚基基因在3T3-L1脂肪细胞诱导分化中的表达及肿瘤坏死因子-α调控作用

目的观察3T3-L1前体脂肪细胞诱导分化过程中Ⅱ型钙调蛋白激酶δ亚基基因表达水平及肿瘤坏死因子-α对成熟脂肪细胞中Ⅱ型钙调蛋白激酶δ亚基((2AMKⅡD)基因表达的调控作用。方法检测3T3-L1前体脂肪细胞体外诱导分化不同时段CAMKⅡD基因的mRNA表达水平;采用不同浓度TNF-α干预成熟脂肪细胞,检测干预后不同时间点CAMKⅡD基因的表达水平。结果3T3-L1前体脂肪细胞中CAMKⅡD基因mRNA表达,于d1显著下调,与d0比较具有显著差异(P< 0.01);d2其表达水平显著上调,并明显高于d0表达水平(P<0.01);d2-10表达一直维持在较高水平(P>0.05)。0.1、1.0 μg/L的TNF-α干预后,成熟脂肪细胞该基因各时段的表达水平无显著变化(P>0.05);10.0 μg/L的TNF-α干预后,在12 h 始,其表达水平有显著性下调(P<0.01);其他各时段之间无显著变化(P>0.05)。结论CAMKⅡD基因参与脂肪细胞分化的调控,与肥胖发生相关,其在3T3-L1细胞分化过程中的表达变化可能有利于脂肪细胞的分化成熟和脂质积聚。TNF-α对成熟脂肪细胞中CAMKⅡD基因表达可能不具有调控作用。     

TSG-6基因在3T3-L1脂肪细胞诱导分化中表达水平的变化及TNF-α对其调节作用的研究

目的观察3T3-L1脂肪细胞诱导分化过程中TSG-6基因mRNA表达水平的变化,探讨TNF-α对成熟脂肪细胞中TSG-6基因表达水平的调节作用.方法体外培养3T3-L1脂肪细胞,在诱导3T3-L1脂肪细胞分化成熟的基础上,应用重组TNF-α干预分化成熟的脂肪细胞,采用RT-PCR技术检测诱导分化不同时段及TNF-α干预后不同时间脂肪细胞中TSG-6基因的表达水平.结果 (1)随脂肪细胞逐渐分化成熟,TSG-6 基因mRNA表达水平逐渐升高.TSG-6 基因表达水平除在细胞分化第0～2天、第3～5天、第4～6天和第7～10天各时段内差异无显著意义(P>0.05)外,其余各时段之间表达水平,差异均有显著意义(P＜0.05);(2)不同浓度重组TNF-α(0.1～10.0 ng/ml)均能显著抑制成熟脂肪细胞中TSG-6基因mRNA的表达,除外TNF-α浓度1.0 ng/ml时6～24 h时段,其抑制作用呈现随TNF-α浓度增加和刺激时间延长而明显增强的总体趋势.TNF-α浓度为0.1 ng/ml时,TSG-6基因表达水平6 h内下降33.73%,12 h内下降97.39%;TNF-α浓度为1.0 ng/ml时,TSG-6基因表达水平6 h内下降78.68%,并持续至24 h;TNF-α浓度达10.0 ng/ml时,TSG-6基因表达水平2 h内即下降96.27%,TSG-6基因的表达几乎被完全抑制.结论 (1)TSG-6基因可能参与脂肪细胞分化及脂质形成过程;(2)TNF-α对脂肪细胞中TSG-6基因表达具有抑制作用,其抑制效应总体趋势上呈现剂量反应性特征.     

细胞外信号调节激酶抑制剂PD98059对脓毒症新生大鼠脑组织肿瘤坏死因子-α表达的影响

目的探讨脓毒症新生大鼠脑组织炎性细胞因子TNF-α的表达水平及细胞外信号调节激酶(ERK)抑制剂PD98059对其表达的影响。方法行盲肠结扎穿孔术(CLP)建立脓毒症新生大鼠模型。将74只10日龄新生大鼠随机分为对照组(6只)、CLP组(34只)和PD98059组(34只)。CLP组只采用CLP措施,PD98059组新生大鼠于CLP处理前0.5 h腹腔内注射入PD98059,0.3mg·kg-1。于CLP处理后2 h、4 h、6 h、8 h,CLP组和PD98059组各取6只新生大鼠处死,取出脑组织,采用酶联免疫吸附试剂盒检测脑组织TNF-α蛋白的表达,反转录PCR检测其mRNA表达。结果对照组新生大鼠脑组织仅微量表达TNF-αmRNA及TNF-α蛋白。CLP组新生大鼠脑组织TNF-αmRNA及其蛋白的表达量于CLP处理后2 h开始升高,6 h达高峰,8 h下降,均明显高于对照组(P<0.001、0.05)。PD98059组各个时间点TNF-αmRNA及其蛋白的表达量均明显低于CLP组(Pa<0.001、0.05)。实验10 d,CLP组和PD98059组未处死的20只新生大鼠共有10只大鼠死亡。其中CLP组8只死亡,死亡率为80%(8/10);PD98059组死亡2只,死亡率为20%(2/10)。2组间死亡率比较差异有统计学意义(P=0.023)。结论新生大鼠脓毒症早期,脑组织中炎性细胞因子TNF-α表达上调,而ERK抑制剂PD98059可下调其表达,缓解脑损伤,降低其死亡率。     

GADD45β基因在脂肪细胞分化过程中的表达及肿瘤坏死因子-α对其的调节作用

目的观察3T3-L1脂肪细胞诱导分化过程中生长抑制和DNA损伤诱导家族45β(GADD45β)基因mRNA表达水平的变化,探讨TNF-α对成熟脂肪细胞中GADD45β基因表达水平的调节作用。方法体外培养3T3-L1脂肪细胞,在诱导3T3-L1脂肪细胞分化成熟的基础上,应用重组TNF-α干预分化成熟的脂肪细胞,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测诱导分化不同时段及TNF-α干预后不同时间脂肪细胞中GADD45β基因表达水平。结果随脂肪细胞逐渐分化成熟,GADD45β基因mRNA表达水平渐降低。GADD45β基因表达水平除在细胞分化d1~7、d8~10各时段内差异无显著意义(P>0.05)外,余各时段之间表达水平差异均具有显著意义(P<0.05)。不同质量浓度重组TNF-α(0.1~10.0μg/L)均能显著促进成熟脂肪细胞中GADD45β基因mRNA的表达。TNF-α质量浓度为0.1μg/L时,GADD45β基因表达水平6 h内上升51.39%,24 h内上升100.15%;TNF-α质量浓度为1.0μg/L时,GADD45β基因表达水平6 h内上升44.15%,24 h内上升100.63%;TNF-α质量浓度达10.0μg/L,GADD45β基因表达水平6 h内即上升104.26%,24 h内上升122.17%。结论GADD45β基因可能参与脂肪细胞分化及脂质形成过程;TNF-α对成熟脂肪细胞中GADD45β基因表达具有促进作用,其促进效应总体趋势呈现时间依赖性特征。     

PRNP基因在3T3-L1脂肪前体细胞分化过程中的表达及肿瘤坏死因子-α对其调节作用

目的 探讨3T3-L1脂肪前体细胞诱导分化过程中PRNP基因表达水平的变化及TNF-α对其调节作用.方法 体外培养3T3-L1前体脂肪细胞,胰岛素加地塞米松加1-甲基-3-异丁基黄嘌呤(MDI)方案诱导3T3-L1细胞分化成熟,并收集分化前、分化0～10 d各时段细胞,采用RT-PCR技术检测诱导分化不同时段3T3-L1细胞PRNP基因表达水平;同时在成功诱导3T3-L1细胞分化成熟的基础上,应用不同水平TNF-α(0.1、1.0、10.0 μg/L)干预分化后的成熟脂肪细胞(第10天),收集TNF-α刺激前(0 h)及刺激后0.5、2.0、6.0、12.0、24.0 h的脂肪细胞,通过RT-PCR测定TNF-α干预前后不同时间点脂肪细胞中PRNP基因表达水平.采用Excel软件进行统计学分析.结果 1.PRNP基因低表达于3T3-L1脂肪前体细胞中,随细胞分化成熟该基因表达水平逐渐上调,至分化第10天其表达水平最高.PRNP基因表达水平除在诱导分化前(第-1天)至第4天、第2～5天、第6～10天时段内无显著性差异外(Pa＞0.05),其余各时段间表达水平均有显著性差异(Pa＜0.05);2.在分化前的3T3-L1脂肪细胞和成熟脂肪细胞中,不同水平TNF-α(0.1、1.0、10.0 μg/L)均能在短时间内明显抑制PRNP基因mRNA的表达,且呈时间依赖性.结论 PRNP基因可能参与3T3-L1脂肪细胞分化及脂质积聚过程;不同水平重组TNF-α对成熟脂肪细胞的PRNP基因表达具有抑制作用,其抑制效应总体趋势上呈时间依赖性.     

乙型肝炎病毒X蛋白通过激活细胞外蛋白调节激酶转导机制上调大鼠系膜细胞肿瘤坏死因子-α的表达

目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)X基因编码的蛋白(HBx)导致大鼠系膜细胞(MC)增殖及TNF-α高表达的细胞外蛋白调节激酶(ERK)1/2信号转导机制.方法 PCR扩增HBV X基因,然后与真核表达载体PCI-neo质粒连接,构成含有HBV X基因的质粒(PCI-neo-X),采用限制性内切酶法及测序证实.采用脂质体法将PCI-neo-x转染入体外培养的大鼠MC,采用抑制剂U0126阻断ERK1/2通路,观察培养细胞增殖、TNF-α及其mRNA表达,以不加抑制剂作为对照.Western blot检测HBx、ERK1/2及磷酸化ERK(p-ERK)1/2表达.半定量RT-PCR检测TNF-α mRNA表达,酶联免疫吸附法(ELISA)检测培养上清液TNF-α表达.甲基噻唑摹四唑(MTT)法检测MC增殖.结果 无论是否加入UO126,在转染PCI-neo-X 36,48 h后,肾小球系膜细胞(GMC)明显表达HBx,细胞TNF-αmRNA的表达加入U0126较不加入U0126显著下降.不加入U0126组上清液TNF-α水平在转染后36 h和48 h分别为(189.0±18.1)ng/L和(172.3±24.3)ng/L;加入U0126组上清液中TNF-α水平在转染后36、48 h分别为(65.6±11.6)ng/L和(84.0±24.6)ng/L,组间不同时间点比较均有显著性差异(Pa<0.05).加入U0126后MC增殖也显著下降.结论 HBx可促使MC增殖,细胞TNF-α mRNA及上清液TNF-α表达均增高,这一作用可能是通过HBx激活ERK1/2信号通路实现的.实用儿科临床杂志,2009,24(10):738-740     

急性淋巴细胞性白血病患儿血清高迁移率族蛋白1检测及其诱导白血病细胞分泌肿瘤坏死因子α的实验研究

目的探讨血清高迁移率族蛋白1（HMGB1）水平与儿童急性淋巴细胞性白血病（ALL）发病的关系;研究HMGB1对白血病细胞分泌肿瘤坏死因子α（TNF-α）的影响及其与丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路的关系。方法采用Westernblot方法检测正常、ALL患儿初治期、完全缓解期各15例血清HMGB1水平;制备HMGB1重组蛋白刺激人K562白血病细胞损伤模型,采用ELISA和Westernblot方法检测HMGB1对TNF-Or．分泌及其p38、c-Jun氨基末端激酶（JNK）、细胞外信号调节激酶（ERK）MAPK信号通路活化的影响;采用ELISA方法检测MAPK抑制剂对HMGB1所致TNF-α．分泌的影响。结果初治ALL患者血清HMGB1[（43．78±4．62）μg／L]显著高于正常对照组[（0．60±0．48）μg／L,P〈0．01]和缓解组[（0．89±0．62）μg／L,P〈0．01],正常对照组与缓解组比较差异无统计学意义（P〉0．05）;HMGB1以时效和量效依赖性方式诱导K562细胞分泌TNF-α．并且促进了p38、JNK、ERK蛋白发生磷酸化;p38抑制剂（SB203580）、JNK抑制剂（SP600125）和MEK抑制剂（PD98059）抑制了HMGB1诱导K562细胞TNF-α．的分泌。结论血清HMGB1水平与儿童ALL发病、发展密切相关;HMGB1通过活化MAPK信号通路促进白血病细胞分泌TNF-α．参与肿瘤细胞免疫调节。     

NYGGF4基因过表达对成熟脂肪细胞线粒体形态及动力学的影响

目的 探讨NYGGF4基因过表达对成熟3T3-L1脂肪细胞线粒体形态及动力学的影响.方法 以3T3-L1前体脂肪细胞为载体,建立NYGGF4基因稳定过表达细胞株,以空载质粒转染的细胞为对照,将前体脂肪细胞诱导分化为成熟脂肪细胞.采用透射电镜观察成熟脂肪细胞的线粒体形态,采用荧光定量PCR技术检测成熟脂肪细胞中线粒体融合基因(Mfn)1 mRNA、Mfn2 mRNA、线粒体动态相关基因(Drp)1 mRNA的表达水平.采用Western blot方法检测Mfn1蛋白、Mfn2蛋白、Drp1蛋白的表达水平.结果 1.电镜观察发现NYGGF4基因过表达的成熟脂肪细胞线粒体体积变小、数量明显减少,线粒体嵴断裂、减少、消失,部分线粒体肿胀,甚至呈空泡状;对照组成熟脂肪细胞的线粒体形态基本正常,线粒体嵴清晰可见,线粒体无明显肿胀、皱缩.2.NYGGF4基因过表达成熟脂肪细胞Mfn1 mRNA及Mfn1蛋白表达水平均显著高于对照组.3.NYGGF4基因过表达成熟脂肪细胞的Mfn2 mRNA、Drp1 mRNA及相应蛋白表达水平与对照组比较差异均无统计学意义.结论 在3T3-L1成熟脂肪细胞中,NYGGF4基因过表达可导致线粒体形态发生变化、数量减少,同时上调Mfn1 mRNA和Mfn1蛋白表达水平,提示NYGGF4基因在成熟脂肪细胞中过表达能影响细胞线粒体形态及动力学.     

NYGGF4基因过表达对脂肪细胞胰岛素敏感性及分泌功能的影响

目的：观察肥胖相关新基因NYGGF4过表达对脂肪细胞的胰岛素敏感性及分泌功能的影响。方法：体外培养稳定转染NYGGF4基因（NYGGF4-pcDNA3.1）的3T3-L1前体脂肪细胞,以转染空载体（pcDNA 3.1）的3T3-L1细胞为对照,胰岛素加地塞米松加1-甲基-3-异丁基黄嘌呤(MDI)方案诱导细胞分化成熟,液闪仪测定3H标记的葡萄糖摄取率,Western blot检测葡萄糖转运体4（GLUT4）的表达及转位;采用ELISA双抗体夹心法检测培养上清中TNF-α、IL-6、脂联素、抵抗素4种细胞因子的水平。结果：NYGGF4过表达显著降低胰岛素刺激的葡萄糖摄取率（P<0.05）。NYGGF4过表达对总的GLUT4的表达量没有影响,但明显降低胰岛素刺激的GLUT4由细胞浆向细胞膜的转位（P<0.05）。过表达NYGGF4的脂肪细胞其培养上清中TNF-α、IL-6、脂联素及抵抗素的分泌水平与对照组相比差异无显著性（P>0.05）。结论：NYGGF4基因过表达通过下调胰岛素刺激的GLUT4的转位而减少脂肪细胞的葡萄糖摄取率,提示脂肪细胞对胰岛素的敏感性降低,而对脂肪细胞的分泌功能无明显影响。［中国当代儿科杂志,2009,11（10）：846-849］     

凋亡蛋白酶活化因子1基因在脂肪细胞诱导分化中表达及肿瘤坏死因子-α对其调节作用

目的 观察3T3-L1脂肪前体细胞诱导分化过程中（0~10 d）凋亡蛋白酶活化因子1（APAF1）基因表达水平的变化趋势，探讨肿瘤坏死因子-α（TNF-α）对成熟脂肪细胞中APAF1基因表达水平的调节作用。方法 体外培养3T3-L1脂肪前体细胞，通过油红O染色鉴定其分化成熟的基础上，应用人重组TNF-α 1.0 ng·mL-1干预分化成熟的脂肪细胞，抽提脂肪细胞总RNA和总蛋白后，采用RT-PCR及Western blot技术检测诱导分化不同时段及TNF-α干预后不同时间（2、6、12和 24 h）脂肪细胞中APAF1基因的表达水平。结果 ① 3T3-L1 前体脂肪细胞诱导分化过程中（0~10 d），APAF1基因表达水平呈现逐渐减低的趋势;②人重组TNF-α对成熟脂肪细胞中APAF1基因的表达具有显著的增强作用，且TNF-α对APAF1基因表达的上调作用呈现随刺激时间延长而明显增强的总体趋势。结论 ① 在3T3-L1前体脂肪细胞分化过程中，APAF1基因的表达逐渐下调可能有利于脂肪细胞的分化成熟和脂质积聚；② APAF1基因在人重组TNF-α刺激成熟脂肪细胞过程中呈明显上调趋势，这种上调可能具有协同TNF-α促进成熟脂肪细胞去分化的作用。     

胰岛素受体底物1基因沉默对3T3-L1细胞CCAAT增强子结合蛋白α、过氧化物酶体增殖物激活受体γ表达的影响

目的研究胰岛素受体底物1(IRS-1)沉默对3T3-L1前脂肪细胞分化关键分子CCAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)mRNA及蛋白表达的影响,并观察IRS-1沉默后前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞能力的改变,探讨胰岛素受体底物(IRSs)是否作为C/EBPα、PPARγ的上游调节信号在前脂肪细胞分化中起到重要的调节作用。方法合成4条IRS-1 shRNA,Western blotting筛选出沉默效率最高的1条。3T3-L1前脂肪细胞分为IRS-1沉默组和对照组。IRS-1沉默组细胞用沉默效率最高的IRS-1 shRNA质粒转染3T3-L1前脂肪细胞,沉默细胞中的IRS-1分子;对照组采用无意义IRS-1 shRNA质粒转染3T3-L1前脂肪细胞。转染24 h后诱导其分化成熟,分化72 h后检测促进前脂肪细胞分化的关键分子C/EBPα、PPARγ的表达。继续诱导分化至第7天,油红O染色观察IRS-1沉默后前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞的比例,检测其分化能力的改变。结果与对照组相比,IRS-1沉默组在诱导分化72 h后,Real-time PCR结果显示3T3-L1前脂肪细胞中C/EBPαmRNA、PPARγmRNA表达明显下降(Pa<0.05),Western blotting结果显示C/EBPα、PPARγ蛋白水平也同样显著下降(Pa<0.05);细胞继续分化至第7天,油红O染色显示,IRS-1沉默组前脂肪细胞分化成熟的比例与对照组比较显著降低。结论胰岛素可能通过IRS-1刺激C/EBPα、PPARγ的表达促进前脂肪组织的分化。     

细胞外信号调节激酶信号转导通路在病毒性心肌炎心肌细胞中的调控作用

目的：细胞外信号调节激酶(ERK)与细胞生长，分化，增殖等生理病理过程有密切关系。该研究通过比较ERK1/2在病毒性心肌炎心肌细胞中表达变化及ERK特异性阻断剂PD98059干预后细胞活性的改变，探讨ERK信号传导通路在病毒性心肌炎早期病毒攻击心肌细胞过程中的作用。方法：取新生SD大鼠，采用酶消化法分离得到心肌细胞。将培养细胞分为对照组，柯萨奇B3(CVB3)感染组，20 μmol/L和50 μmol/L PD98059干预组，后3组用柯萨奇B 3M 株感染。采用Westen blot分别测定ERK1/2，ERK激活后产物(P-ERK1/2)表达变化，采用MTT法检测细胞活性，采用细胞病变法计算细胞病变。结果：4组ERK1/2表达总量差异无显著性；CVB3感染组P-ERK1/2表达为 135.57 ± 0.7 高于对照组的 119.41 ± 1.97 ，差异有显著性( P < 0.01 )。经20 μmol/L或 50 μmol/L PD98059干预后心肌细胞P-ERK1/2 表达为 113.75±1.03，42.56±2.17 比感染组细胞低，差异有显著性(均P<0.01)；其中50 μmol/L PD98059干预组P-ERK1/2表达较20 μmol/L组低(P<0.01)。PD98059干预组心肌细胞活性0.53±0.13，0.41±0.04 明显高于感染组0.17±0.04，差异有显著性(P<0.01)；不同浓度PD98059干预组间心肌细胞活性差异无显著性(P>0.05)。PD98059干预组细胞出现细胞病变的时间较感染组晚，程度较感染组轻，感染面积较感染组小。结论：病毒在攻击心肌细胞时启动了ERK信号通路；PD98059能干预病毒对心肌细胞的感染。     

Ghrelin对3T3-L1前脂肪细胞增殖和凋亡作用的研究

目的 研究ghrelin对3T3-L1前脂肪细胞增殖和凋亡的影响及其分子机制.方法 体外培养3T3-L1前脂肪细胞,四甲基偶氮唑盐法(MTT法)检测ghrelin对3T3-L1前脂肪细胞增殖影响的剂量-时间效应关系;Annexin V-FITC/PI 流式细胞术分析ghrelin对3T3-L1前脂肪细胞凋亡率的影响;Western blot方法检测ghrelin 干预后p-ERK1/2和p-Akt蛋白表达的变化.结果 Ghrelin 时间依赖性促进3T3-L1前脂肪细胞增殖,ghrelin 10-7～10-15mol/L作用24 h明显促进3T3-L1前脂肪细胞增殖,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05),其中ghrelin 10-11 mol/L促增殖效应最明显(P<0.01);10-11、10-13 mol/L ghrelin干预后前脂肪细胞凋亡率较对照组显著降低(P<0.05),其中10-11mol/L时抑凋亡效应最明显;10-11 mol/L ghrelin干预后前脂肪细胞和成熟脂肪细胞中p-ERK1/2和p-Akt蛋白表达量较对照组显著增加(P<0.01).结论 Ghrelin促进3T3-L1前脂肪细胞增殖并且抑制其凋亡,ERK1/2和PI3K/Akt信号通路可能参与了ghrelin调节细胞增殖和凋亡的过程.     

STEAP4基因蛋白铁氧化还原酶活性分析

目的 分析肥胖相关基因STEAP4的铁氧化还原酶活性.方法 体外温箱培养昆虫细胞株(Sf9),分别将 pAcSec1-STEAP4 转移载体和pAcSec1-vector转移载体与 SapphireTM杆状病毒基因组混合后共转染 Sf9 昆虫细胞,通过G418药物筛选稳定表达STEAP4蛋白的细胞株,并抽提细胞总蛋白进一步应用Western blot 技术验证其转染情况.应用分光光度计法检测铁氧化还原酶活性.应用SPSS 11.5软件进行统计学分析.结果 Western blot 技术证实STEAP4过表达细胞株构建成功;分光光度计法检测STEAP4铁氧化还原酶活性,STEAP4过表达组A值为5.182 5±0.230 4,空载组A值为1.615 0±0.822 6,STEAP4过表达组铁氧化还原酶活性明显高于空载组,差异有统计学意义(Pa<0.001).结论 STEAP4基因蛋白具有铁氧化还原酶活性.     

重组人白细胞介素-6对SW872脂肪细胞葡萄糖代谢和胰岛素敏感性的影响及其机制

目的观察重组人白细胞介素-6(rhIL-6)对SW872脂肪细胞葡萄糖代谢和胰岛素敏感性的影响,观察JAK2抑制剂AG490及PI3K抑制剂Wortmannin是否影响rhIL-6对SW872脂肪细胞葡萄糖转运的抑制作用。方法体外培养SW872脂肪细胞,应用rhIL-6干预,采用3H-2-脱氧-D葡萄糖摄入法,测定葡萄糖转运率;流式细胞术检测细胞膜葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)水平。结果1.用1μg/L rhIL-6作用24 h,对基础状态及胰岛素刺激下,SW872脂肪细胞葡萄糖转运无影响;5、10、20、50μg/L rhIL-6作用24 h使基础状态及胰岛素刺激下SW872脂肪细胞葡萄糖转运率分别下降16%vs20%、28%vs36%、39%vs50%、47%vs57%。2.AG490预处理,使rhIL-6对SW872脂肪细胞在基础状态及胰岛素刺激下葡萄糖转运的抑制作用分别降低20%和33%;Wortmannin预处理,增加基础状态及胰岛素刺激下rhIL-6对SW872脂肪细胞葡萄糖转运的抑制作用。3.用20μg/L rhIL-6作用24 h,细胞膜GLUT4蛋白水平降低。结论rhIL-6通过降低脂肪细胞膜GLUT4的蛋白水平而降低脂肪细胞葡萄糖的转运,从而诱导脂肪细胞胰岛素抵抗。     

U937巨噬细胞对SW872脂肪细胞增殖及凋亡的影响

目的 探讨U937巨噬细胞与SW872脂肪细胞混合培养状态下对脂肪细胞增殖及凋亡的影响,及巨噬细胞在脂肪细胞胰岛素抵抗形成中的意义.方法 以SW872前脂肪细胞,0.6、1.2 mmol/L油酸诱导分化成熟SW872脂肪细胞为研究对象,分别与U937巨噬细胞混合培养,采用酶联免疫吸附法测定各组混合培养前后TNF-α、单核细胞趋化因子-1(MCP-1)分泌水平的变化,应用四甲基偶氮唑盐比色法检测对前脂肪细胞增殖的影响,采用流式细胞术检测各组脂肪细胞在不同炎性反应状态下对细胞凋亡的影响.采用配对t检验对数据进行分析处理.结果 随着油酸诱导水平的增加及SW872前脂肪细胞分化成熟,TNF-α、MCP-1分泌水平均明显升高,脂肪细胞凋亡率亦逐渐增加(Pa<0.05);在与U937巨噬细胞混合培养后,TNF-α、MCP-1分泌水平进一步升高,但炎性反应状态改变对各脂肪细胞组混合培养前后的凋亡率无明显影响(Pa>0.05);U937巨噬细胞的混合培养对SW872前脂肪细胞的增殖率有明显抑制作用(P<0.05).结论 油酸诱导SW872前脂肪细胞成熟分化,在高脂负荷下,炎性反应因子分泌水平急剧升高,同时脂肪细胞凋亡率增加.炎性反应负荷改变对脂肪细胞凋亡率无明显影响.巨噬细胞的趋化加重了其炎性反应状态,并抑制了前脂肪细胞的增殖.     

解偶联蛋白4基因在3T3-L1脂肪细胞诱导分化中的表达水平

目的　观察 3T3 L1脂肪前体细胞诱导分化过程中解偶联蛋白 4 (UCP4 )基因表达水平变化 ,探讨UCP4基因与肥胖发生之间的关系。方法　体外培养 3T3 L1细胞 ,诱导细胞分化 ,采用RT PCR技术在细胞分化成熟的不同时段检测脂肪细胞中UCP4基因mRNA表达水平。结果　UCP4基因高表达于 3T3 L1脂肪前体细胞中 ,随细胞分化成熟该基因表达水平渐下调。UCP4基因表达水平在诱导分化前 (d - 1)至d0、d0～ 3、d4～6、d7～ 8、d9～ 10内无显著性差异 (P >0 .0 5 ) ,余各时段表达水平均有显著差异 (P均 <0 .0 1)。结论　UCP4基因与肥胖发生相关 ,其在 3T3 L1细胞分化过程中表达逐渐下调可能有利于脂肪细胞的脂质积聚