沉默G250基因对肾癌786-0细胞移植瘤Skp2表达的影响

目的探讨沉默G250基因对肾癌786-0细胞移植瘤S期激酶相关蛋白2(Skp2)表达的影响。方法构建靶向G250的siRNA表达质粒pshRNA-G250并转染肾癌786-0细胞,12只BALB/c裸鼠分为阴性对照组和干扰成瘤组,干扰成瘤组每只裸鼠皮下接种5×106个G250基因沉默后的肾癌786-0细胞(786-0/si-G250-b),以转染空质粒的细胞(786-0/si-G250-0)为对照。成瘤3 w后,处死裸鼠后切取瘤块,采用组织芯片技术及免疫组化SP法检测Skp2的表达。结果 5×106个细胞皮下接种BALB/c裸鼠3 w后均成瘤,Skp2在阴性对照组和干扰成瘤组裸鼠的肿瘤组织中表达率分别为83.33%(5/6)和16.67%(1/6),两者有显著性差异(P=0.04)。结论 G250基因表达沉默抑制了肾癌细胞移植瘤Skp2的表达。     

G250基因沉默对肾癌786-0细胞增殖和细胞周期的影响

目的 观察沉默G250基因对肾癌786-0细胞增殖和细胞周期的影响.方法 构建靶向G250的siRNA表达质粒pshRNA-G250并转染肾癌786-0细胞,MTT法观察了G250基因沉默后肾癌786-0细胞(命名786-0/si-G250-a和786-0/si-G250-b)体外增殖情况,以转染空质粒的细胞(空白组,命名786-0/si -G250-0)及转染阴性对照干扰载体的细胞(阴性组,命名786-0/si-G250-n)作对照;流式细胞仪检测了786-0/si-G250-b的细胞周期,以786-0/si-G250-0作对照.结果 与786-0/si-G250-0细胞及786-0/si-G250-n细胞相比,786-0/si-G250-a、786-0/si-G250-b细胞增殖速度减慢,四组差异显著(F=360.17,P=0.000);786-0/si-G250-b G0/G1期细胞比例较786-0/si-G250-0高(t=6.620,P=0.003),而S期、G2/M 期细胞比例较786-0/si-G250-0低(t=4.889,P=0.008;t=6.676,P=0.003),表现出G0/G1期阻滞.结论 G250基因表达沉默抑制肾癌786-0细胞的DNA合成,将细胞阻滞于G0/G1期,肾癌786-0细胞增殖能力降低,肾癌细胞体外生长被显著抑制.     

千金子对表达人G250基因小鼠renca细胞增殖的影响

目的观察中药千金子对表达人G250基因小鼠renca细胞增殖的影响。方法利用DNA重组技术将成功扩增的人G250基因编码区序列定向插入到pRNAT-U6.1/Neo质粒真核表达载体中,得到重组质粒pRNAT-U6.1/Neo-G250,将该质粒转染renca小鼠细胞,经G418筛选获得抗性单克隆,扩大培养后经Western印迹鉴定人G250基因的表达。将该细胞在不同浓度含千金子二萜醇(111μg/ml、333μg/ml、1 000μg/ml、3 000μg/ml、9 000μg/ml)的培养基中培养,MTT法观察千金子二萜醇对表达人G250基因小鼠renca细胞体外增殖情况的影响。结果与空白对照组相比,24 h后实验组细胞增殖速度减慢,并随浓度增加增殖速度减慢越明显,空白组与3 000μg/ml及9 000μg/ml浓度组比较差异有明显统计学(P=0.006,P=0.000)。结论中药千金子使表达人G250基因小鼠renca细胞增殖能力降低,renca细胞体外生长被显著抑制。     

β-榄香烯对肾癌786-0细胞凋亡的影响及其机制探讨

目的观察β-榄香烯对肾癌786-0细胞凋亡的影响,并探讨其可能机制。方法使用不同浓度β-榄香烯作用于786-0细胞24 h,MTT法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡率,W estern b lot法检测细胞内磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）及总Akt。结果随β-榄香烯浓度增大,细胞存活率逐渐降低,细胞凋亡率明显增加,细胞内p-Akt表达水平逐渐降低,均呈一定浓度依赖性（P均〈0.05）。结论β-榄香烯可诱导肾癌细胞凋亡,其机制可能为抑制PI3K/Akt通路活性。     

TMPRSS4基因沉默对胰腺癌SW1990细胞生长及侵袭的影响

目的 观察TMPRSS4基因沉默对人胰腺癌SW1990细胞体外生长增殖和侵袭的影响.方法 体外合成4个靶向TMPRSS4基因和阴性对照的真核表达载体,瞬时转染到SW1990细胞,实时定量PCR法检测转染细胞的TMPRSS4 mRNA表达.以干扰效率最高的真核表达载体转染SW1990细胞,G418筛选出稳定的TMPRSS4基因沉默的细胞株,蛋白质印迹法检测稳定细胞株TMPRSS4蛋白抑制效率,CCK-8法检测细胞生长抑制率,Transwell小室检测细胞侵袭能力.结果 成功构建了稳定下调TMPRSS4表达的细胞株SW1990/psi-TMPRSS4,细胞转染效率为82.9%.与亲本SW1990细胞比较,TMPRSS4 mRNA和蛋白水平分别下调了80.1%、60%.SW1990/psi-TMPRSS4组穿膜细胞数为(118.6±13.4)个,显著低于阴性对照组的(157.4±12.9)个和亲本细胞组的(157.0±9.5)个(P值均<0.01).SW1990/psi-TMPRSS4组细胞的侵袭抑制率为24.5%.但各组细胞增殖无明显变化.结论 成功筛选出稳定下调TMPRSS4表达的细胞株.下调TMPRSS4表达能有效抑制胰腺癌SW1990细胞的侵袭能力,但对细胞增殖无影响.     

核糖核酸干扰沉默生长抑制因子1基因表达对胃腺癌AGS细胞凋亡的影响

目的 探讨RNA干扰沉默生长抑制因子1(ING1)基因表达对胃腺癌AGS细胞凋亡的影响。方法人胃腺癌细胞株AGS经常规培养后分为空白对照组、阴性对照组[转染阴性对照小干扰RNA(siRNA)序列]、siRNA组（转染特异性ING1 siRNA序列）。应用免疫荧光、定量PCR和免疫印迹方法检测转染后不同时间的ING1基因表达沉默效果。应用流式细胞技术检测ING1基因表达沉默对AGS细胞凋亡的影响。结果ING1主要在AGS细胞胞质中表达。在荧光定量PCR技术检测中将空白对照组的ING1基因表达量设为1,则转染后24和40 h阴性对照组的ING1基因相对表达量分别为0.88±0.16和0.92±0.13,siRNA组ING1基因相对表达量分别为0.38±0.09和0.17±0.06。空白对照组和阴性对照组比较,P值分别=0.78和0.82。空白对照组和siRNA组比较,P值均=0.01。阴性对照组和siRNA组比较,P值分别=0.02和0.01。免疫印迹技术检测结果显示,转染后40 h AGS细胞中ING1蛋白表达水平明显下调。空白对照组AGS细胞凋亡率为11.06％±0.97％,阴性对照组、siRNA组转染40 h后AGS细胞凋亡率为11.82％±0.69％和 6.70％±0.41％。空白对照组与siRNA组比较P=0.024。空白对照组与阴性对照组比较P=0.76。阴性对照组与siRNA组比较P=0.019。结论ING1在人胃癌细胞凋亡过程中发挥重要作用,可能成为胃癌基因治疗的新靶点。     

鼠双微粒体-2基因沉默对人肝癌HepG2细胞移植瘤生长的抑制作用

目的 构建鼠双微粒体-2基因(MDM2)靶向小分子干扰RNA (siRNA)质粒,研究其对人肝癌HepG2细胞裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用,探讨其在肝癌基因治疗中的可行性.方法 构建MDM2的siRNA真核表达载体pSilencer-siRNA-MDM2 (siMDM2),建立裸鼠荷瘤模型,分别给予阴性对照质粒和siMDM2质粒处理.监测肿瘤生长变化,RT-PCR、Western blot方法检测MDM2及p53 mRNA和蛋白的表达变化.正态分布数据的组间比较用单因素方差分析及LSD检验.结果 裸鼠体内实验结果显示,转染siMDM2-1和siMDM2-2组与对照组相比,肿瘤增长受到明显抑制,抑瘤率分别为60.6％和54.6％.RT-PCR和Westem blot结果示MDM2的mRNA和蛋白质表达下调,而p53的mRNA和蛋白质表达上调.与空白组比较,转染siMDM2-1和siMDM2-2组的MDM2mRNA表达分别下调62.8％和61.5％,MDM2蛋白表达分别下调60.7％和59.5％;p53 mRNA表达分别上调47.1％和45.6％,p53蛋白表达分别上调45.9％和44.3％,差异均具有统计学意义(F值分别为75.099、47.860、17.676和235.770,P值均＜0.01).结论 siRNA沉默MDM2基因能抑制人肝癌HepG2细胞裸鼠皮下移植瘤的形成,可能与其在体内有效下调MDM2和上调p53的mRNA及蛋白质表达有关.     

醛酮还原酶1B10基因沉默对MHCC97H细胞生长和基因表达的影响

目的 探讨醛酮还原酶1B10(AKR1B10)基因在肝癌发生和发展过程中的作用及其机制.方法 化学合成AKR1B10序列特异性小干扰RNA,用脂质体LipofectaminrTM2000介导转染人肝癌细胞系MHCC97H,设实验组转染AKR1B10-小干扰RNA,设阴性对照组转染非编码序列双链小RNA,设空白对照组不作转染.用实时定量PCR、Western blot和酶活性检测法检测AKR1B10 mRNA和蛋白的表达情况,用细胞计数试剂盒CCK-8检测转染细胞的生长增殖变化,用流式细胞仪检测膜联蛋白V/碘化丙啶双标记的凋亡细胞变化,并用实时定量PCR检测c myc、c-fos、N-ras、ki-67、caspas 3、bax肿瘤相关基因的表达变化.用析因设计的方差分析和完全随机方差分析进行组间比较,LSD法进行多重比较.结果 转染24、48 h和72 h后,AKR1B10 mRNA的相对表达量在实验组分别为0.382±0.048、0.098±0.008和0.257±0.032;阴性对照组分别为0.797±0.092、0.742±0.086和0.794+0.105;空白对照组分别为0.808±0.118、0.716±0.083和0.706±0.067.不同转染时间和不同实验组中AKR1B10 mRNA的表达比较,F值分别为11.650和566.971,P值均＜0.01,差异均有统计学意义.转染24、48 h和72 h后,实验组的AKR1B10mRNA表达较空白对照组被明显抑制,抑制率分别为52.7%±5.6%、86.3%±4.4%和63.7%±6.1%,以转染48 h的抑制率最高(t=80.68,P＜0.01);阴性对照组的表达水平接近空白对照组(P＞0.05).Western blot结果显示,转染24、48 h和72 h后,实验组的AKR1B10蛋白表达水平均有下降,其中以转染72 h的降低幅度最大;阴性对照组的表达水平接近空白对照组.转染24、48、72h和96h后,实验组450nm处吸光度值分别为1.465±0.040、1.724±0.106、1.934±0.069和2.377±0.163;阴性对照组分别为1.528±0.044、2.019±0.091、2.711±0.204、3.151±0.159;空白对照组分别为1.567+0.057、2.102±0.099、2.642±0.198、3.069±0.180;不同转染时间和不同实验组间比较,F值分别为128.092、36.535,P值均＜0.01,差异均有统计学意义.转染了AKR1B10-siRNA的MHCC97H细胞生长受到抑制.与空白对照组相比,实验组的细胞生长抑制率在转染48、72 h和96 h分别为18.0%±1.6%、26.1%±3.2%和22.5%±1.1%,t值分别为19.197、13.093和23.553,P值均＜0.01,差异均有统计学意义;阴性对照组的细胞生长未受到明显抑制(P＞0.05).实验组、阴性对照组和空白对照组各基因mRNA的相对表达量:c-myc基因分别为1.047±0.156、1.737±0.193和1.631±0.128;c-fos基因分别为0.041+0.003、0.082±0.006和0.081±0.004; N-ras基因分别为0.082±0.009、0.156±0.013和0.133±0.015;ki-67基因分别为0.032±0.002、0.070±0.008和0.069±0.005; caspasc-3基因分别为0.148±0.018、0.110±0.009和0.108+0.012;bax基因分别为0.780±0.092、0.629±0.058和0.617±0.073,各基因的mRNA在不同组别表达差异均有统计学意义(F值分别为104.384、400.915、211.903、427.041、67.750和37.272,P值均＜0.01).结论 AKR1B10可能通过调节肿瘤相关基因的表达水平来促进细胞增殖、抑制细胞凋亡.     

shRNA沉默增殖诱导配体基因抑制胰腺癌细胞生长的研究

目的 研究靶向增殖诱导配体(a proliferation-inducing ligand,APRIL)基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)在体内外对胰腺癌细胞生长的影响,探讨其对胰腺癌基因治疗的可行性.方法 将前期构建的LV-shAPRIL感染CFPAC1细胞,MTY法及流式细胞技术分别检测CFPAC1细胞生长和凋亡.用CFPAC1细胞建立裸鼠移植瘤模型,观察瘤内注射LV-shAPRIL对瘤生长的影响.结果 LV-shAPRIL感染CFPAC1细胞96 h后,CFPAC1细胞的生长明显受抑制,与对照组及空载体组相比有显著差异(P＜0.05);同时细胞凋亡率为(17.35±0.96)%,明显高于对照组和空载体组(P＜0.05).将LV-shAPRIL局部注射到裸鼠移植瘤内,LV-shAPRIL组肿瘤生长明显比同期对照组和空载体组减缓;第27天LV-shAPRIL组肿瘤体积和重量分别为(821.8±123.3)mm3和(2.16±0.18)g,明显小于其他两组(P＜0.05).结论 靶向APRIL基因的慢病毒表达载体LV-shAPRIL在体内外抑制胰腺癌CFPAC1细胞的生长,为胰腺癌基因治疗探索新的思路.     

沉默Bcl-2基因对A549细胞的影响

目的 探讨Bcl-2基因在抑制细胞凋亡的作用.方法 利用RNA干扰技术,通过向人非小细胞肺癌A549细胞中导入siRNA表达载体,抑制Bcl-2基因表达,诱导细胞凋亡.结果 Bel-2基因沉默导致A549细胞发生凋亡.结论 Bcl-2家族成员之间相互拮抗的关系及由此产生的A549细胞凋亡,为治疗肿瘤提供了一条新的途径.     

RNA干扰沉默Livin基因对裸鼠移植瘤生长的影响

目的 利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术沉默凋亡抑制蛋白基因Livin基因在人肺腺癌细胞株SPC-A-1中的表达,探讨Livin基因表达沉默对SPC-A-1裸鼠移植瘤生长的影响.方法 以慢病毒为载体,将携带针对Livin基因短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)及无关序列片段的shRNA转染SPC-A-1细胞,转染成功后将转染Livin shRNA的SPC-A-1细胞(实验组)、转染无关序列的SPC-A-1细胞(阴性对照组)及未转染任何序列的SPC-A-1细胞(空白对照组)分别接种于BALB/C裸鼠右腋皮下,复制SPC-A-1裸鼠皮下移植瘤模型,观察各组细胞在裸鼠体内的成瘤时间、成瘤率、瘤体体积及重量,绘制肿瘤生长曲线并计算抑瘤率;RT-PCR、免疫组织化学法分别检测Livin mRNA及蛋白的表达情况,原位末端转移酶标记法(TdT-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)检测移植瘤组织凋亡情况.结果 与空白对照组、阴性对照组比较,实验组裸鼠移植瘤成瘤时间晚,瘤体生长缓慢(F=70.509,P＜0.01),体积抑瘤率达(59.5±3.4)%;瘤体重量明显减轻(F=12.821,P＜0.01),瘤重抑瘤率达(71.1±5.6)%.实验组Livinα mRNA表达水平为(37.2±1.6)%,Livinβ mRNA表达水平为(29.4±1.1)%,明显低于空白对照组[(63.3±3.8)%,(53.2±3.4)%]及阴性对照组[(66.1±2.6)%,(52.3±3.1)%],差异有统计学意义(Fα=45.309,Fβ=30.076,均P＜0.01).实验组Livin蛋白表达水平为(15.3±2.8)%,明显低于空白组的(51.3±2.1)%和阴性对照组的(52.5±2.5)%(F=78.92,P＜0.01).实验组瘤组织细胞凋亡明显增多,凋亡率为(35.4±3.2)%,明显高于空白对照组的(5.4±1.3)%和阴性对照组的(8.6±1.5)%,差异有统计学意义(F=14.509,P＜0.01).结论 沉默SPC-A-1细胞中Livin基因表达可有效抑制人肺癌裸鼠移植瘤的生长,Livin基因有望成为肺癌治疗的靶点之一.

Abstract：

Objective To explore the in vivo inhibitory effect of Livin gene silencing by RNA interference on xenograft of lung adenocarcinoma SPC-A-1 cells in BALB/C nude mice. Methods Three different BALB/C nude mice models were established by subcutaneously inoculating differently treated SPC-A-1 cells into 3 nude mice groups: the blank control group was inoculated with blank SPC-A-1 cells,while the negative group was inoculated with cells transfected with lentivirus-delivered negative shRNA, the experimental group was inoculated with cells with lentivirus-delivered Livin shRNA. Then the growth of tumors was observed, and the volume and weight of the tumors were measured at different time points. The curve of tumor growth was then described, and the inhibition rate was calculated. Livin gene expression in the tumor tissues was determined by RT-PCR and Inmunohistochemistry. Cell apoptosis of tumor tissues was detected by TUNEL. Results Slower tumor growth, smaller tumor volume and lighter tumor weight were observed in the experimental group as compared to the blank and negative groups ( F = 70. 509, P ＜ 0. 01; F = 12. 821, P ＜ 0. 01 ). The inhibition rate of tumor volume was ( 59. 5 ± 3.4 ) % , and the inhibition rate of tumor weight was (71. 1 ±5.6)%. Livinα mRNA and Livinβ mRNA expressions in the experimental group were significantly lower than the 2 control groups [ ( 37. 2 ± 1.6 ) % versus ( 63.3 ± 3.8 ) % , ( 66. 1 ±2.6)% ;(29.4±1.1)% versus (53.2 ±3.4)% ,(52.3 ±3. 1)% (Fα =45.309, P ＜0.01 ;Fβ =30.076,P ＜ 0. 01 ) ] . Livin protein expression level was also significantly lower than the blank and the negative groups [ ( 15.3 ± 2. 8 ) % versus(51.3 ± 2. 1 ) %, ( 52. 5 ± 2. 5 ) %, F = 78. 92, P ＜ 0. 01 ]. The apoptosis rate in the experimental group was significantly higher than that in the 2 control groups [ ( 35.4 ± 3.2 ) %versus(5.4±1.3)%,(8.6 ± 1.5)%,F= 14.509, P＜0.01]. Conclusion The lentivirus-delivered Livin shRNA was shown to inhibit the proliferation of transplantation tumor of lung carcinoma effectively, and Livin may be a target for gene therapy in lung cancer.     

Dysadherin基因沉默对胰腺癌细胞侵袭移行能力的影响

目的 探讨靶向封闭dysadherin基因对胰腺癌细胞PANC1、BxPC3体外侵袭移行能力的影响.方法 应用脂质体转染方法将小分子RNA(siRNA)转染细胞.实验分为dysadherin-siRNA转染(dysa)组、阴性对照siRNA转染(HK)组、脂质体对照(对照)组、.采用RT-PCR、免疫组化方法检测转染细胞的dysadherin mRNA及蛋白表达;采用Transwell侵袭小室检测转染细胞体外侵袭移行能力.结果 转染dysadherin-siRNA(5 nmol/L)的PANC1和BxPC3细胞的dysadherin mRNA表达较HK组细胞分别下降95.4%、52.1%(P＜0.05);dysadherin蛋白表达亦分别降低91.2%、83.6%(P＜0.01).PANC1细胞的对照组、HK组和dysa组穿膜细胞数分别为163.2±15.5、154.4±17.3和53.6±7.9;BxPC3细胞的对照组、HK组和dysa组穿膜细胞数分别为30.7±3.2、27.5±2.8和4.7±2.4.dysa组显著低于HK组和对照组(P值均＜0.01).结论 应用RNA干扰技术沉默人胰腺癌细胞株PANC1、BxPC3的dysadherin基因可使细胞的侵袭移行能力下降.     

赫赛汀联合IFNα-2b对肾癌细胞耐药性的影响

目的了解赫赛汀联合干扰能α-2b(IFNα-2b)对肾癌细胞系在体外的杀伤抑制作用,同时检测肾癌细胞在药物作用前后人类表皮生长因子受体2(HER2)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)的表达情况。方法肾癌细胞系通过细胞培养技术进行培养,用四唑比色法观察赫赛汀联合干扰能对该细胞系的抑制杀伤效果,应用链霉抗生物素—过氧化物酶免疫组织化学(SP)法测定HER2、γ-GCS表达情况。结果赫赛汀联合IFNα-2b对肾癌细胞的生长抑制及耐药性呈时间和剂量依赖性。经药物处理后,HER2、γ-GCS表达明显下降(P<0.05)。结论赫赛汀能有效抑制肾癌细胞的生长,对瘤细胞的耐药性也有一定的抑制作用。     

VEGF基因沉默对肝癌HepG2细胞侵袭和迁移的影响

目的观察VEGF基因沉默对人肝癌细胞株HepG2迁移和侵袭的影响。方法采用siRNA技术沉默HepG2细胞内血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因。体外成功构建针对VEGF的3种siRNA表达载体和1个阴性对照,分别命名为pGenesil-1-VEGF-shRNA-1、2、3和pGenesil-1-VEGF-shRNA-scramble。Lipofectamine 2000介导转染HepG2,用RT-PCR筛选出沉默效果最好的siRNA片断(pGenesil-1-VEGF-shRNA-2),将其重组质粒转染HepG2(观察组),以空质粒细胞(空载组)和空白细胞(空白组)作为对照。采用细胞创伤愈合试验、Transwell小室体外侵袭试验分别检测三组细胞迁移、侵袭能力。结果细胞创伤愈合试验显示,观察组细胞迁移速度为(3.02±0.03)μm/h,显著慢于空载组的(8.67±0.02)μm/h和空白组的(8.78±0.03)μm/h,P均<0.05;细胞侵袭试验显示,观察组穿膜细胞数为(14.0±1.3)个,显著低于空载组的(35.0±2.3)个和空白组的(36.0±2.5)个,P均<0.05。结论 VEGF基因沉默可抑制肝癌细胞株HepG2的迁移和侵袭能力。     

腺病毒介导的Akt／mTOR基因沉默抑制肾癌786-O细胞增殖并促进细胞凋亡

目的应用腺病毒技术下调Akt／mTOR表达水平,检测Akt／mTOR基因沉默对人肾癌786-O细胞增殖和凋亡的影响。方法收集人肾癌及癌旁样品,RealtimePCR检测两组样品中Akt和mTOR的mRNA水平。利用病毒包装细胞293A获得靶向Akt／mTOR基因的重组腺病毒,感染人肾癌786-O细胞株。实验分2组：加人靶向Akt／mTOR基因的腺病毒感染的肾癌细胞组（rAd5-Am组）,未处理的腺病毒感染的。肾癌细胞组（NC组）。应用Real timePCR及Western blot检测干扰前后Akt和mTOR mRNA及蛋白表达水平的变化。用细胞增殖及凋亡试剂盒检测Akt和mTOR沉默后,肾癌786-O细胞增殖、凋亡及PCNA表达水平的改变。结果与癌旁组织相比,Akt和mTOR的mRNA水平在肾癌组织中分别上调了2．613和3．254倍。成功获得knockdownAkt／mTOR的rAd5-Am腺病毒及对照腺病毒,感染肾癌786一O细胞。Real time PCR显示rAd5-Am组与NC组相比Akt／mTOR的mRNA水平分别下调65．3％和77．1％,Westernblot结果显示rAd5-Am组与NC组相比Akt／mTOR的蛋白表达水平分别下调78．4％和89．2％。rAd5．Am能显著降低786-O细胞中Akt／mTOR基因的表达。细胞增殖与凋亡实验表明,Akt／mTOR基因沉默后能显著抑制肾癌细胞786-O的增殖,并促进其凋亡（rAd5-Am组细胞凋亡率是NC组的2．57倍）。进一步的实验结果表明,Akt／mTOR下调后能降低PCNA的蛋白量,从而抑制。肾癌细胞的增殖。rAd5-Am感染的。肾癌786-O细胞的增殖和PCNA蛋白量受到抑制,而凋亡率增加。结论构建出能稳定干扰Akt／mTOR基因表达的。肾癌786-O细胞株。Akt／mTOR腺病毒干扰载体可有效沉默肾癌786-O细胞的内源性Akt／mTOR基因,抑制肾癌786-O细胞的增殖,下调PCNA的表达,并促进细胞凋亡。     

siRNA靶向沉默hTERT基因对宫颈癌Caski细胞特性的影响

目的研究siRNA靶向沉默h TERT基因后对宫颈癌Caski细胞特性的影响。方法设计、合成特异性针对h TERT mRNA的siRNA,将其克隆入p Genesil-1.1质粒中,重组成h TERT mRNA-siRNA的表达载体,导致目的基因沉默,是由电转染入宫颈癌Caski细胞,从而产生RNA干扰作用。应用Western印迹法及RT-PCR法检测沉默h TERT基因后对于宫颈癌Caski细胞的蛋白及mRNA的表达情况;检测细胞周期运用流式细胞仪;沉默h TERT基因后宫颈癌Caski细胞的增殖能力可通过CCK-8增殖实验检测。沉默h TERT基因后宫颈癌Caski细胞的侵袭能力可通过小室侵袭实验检测。结果 h TERT基因沉默48 h以后,与空白组及未转染组相比,转染组宫颈癌Caski细胞的蛋白及mRNA表达出现明显降低(P<0.05);细胞周期的检测结果显示S期的细胞数目明显减低,转染组的宫颈癌Caski细胞停留于G0/G1周期,空白组、转染组及未转染组相比差异显著(P<0.05);宫颈癌Caski细胞在转染组的增殖过程中被明显抑制(P<0.05);转染组穿过滤膜的细胞数量明显减少(P<0.05)。结论 Si RNA靶向沉默h TERT基因电转染后,使宫颈癌Caski细胞的增殖和迁移能力得到抑制,一定程度上改善了宫颈癌患者的预后。     

STAT3基因沉默对人胰腺癌SW1990细胞的裸鼠移植瘤生长的影响

目的 观察信号转导与转录激活因子3（STAT3）基因表达沉默后对人胰腺癌SW1990细胞的裸鼠移植瘤生长的影响,探讨其机制.方法 构建靶向STAT3短发卡RNA（shRNA）表达载体,稳定转染胰腺癌SW1990细胞（SW1990-RNAi组）,以转染阴性对照shRNA表达载体细胞（SW1990-Con组）及亲本SW1990细胞（SW1990组）作为对照.应用蛋白质印迹法检测各组细胞STAT3、血管内皮生长因子（VEGF）、基质金属蛋白酶2（MMP-2）蛋白的表达.建立各组细胞的裸鼠皮下移植瘤模型,观察移植瘤的生长,应用免疫组化法检测移植瘤的CD34表达,计算肿瘤的微血管密度（MVD）.结果 SW1990组、SW1990-Con组、SW1990-RNAi组细胞的STAT3蛋白表达量分别为84.69±9.31、82.00±7.76、7.93±1.24,VEGF蛋白表达量分别为82.94±8.97、80.86±10.28、39.04±6.23,MMP-2蛋白表达量分别为40.88±5.09、38.26±5.71、12.54±2.15,SW1990-RNAi组均显著低于其他两组（P值均＜0.05）,而SW1990-Con组与SW1990组细胞的3种蛋白表达量差异均无统计学意义.SW1990组、SW1990-Con组、SW1990-RNAi组裸鼠移植瘤的重量分别为（2.2±0.4）、（2.2±0.3）、（0.5±0.3）g,瘤组织的MVD分别为每高倍视野（20.35±2.41）、（18.79±1.94）、（9.62±1.06）个,SW1990-RNAi组均显著低于其他两组（P值＜0.05或＜0.01）,而SW1990组与SW1990-Con组间的差异均无统计学意义.结论 STAT3基因表达被抑制后SW1990细胞的裸鼠移植瘤生长减缓,其机制可能是通过下调VEGF及MMP-2的表达、抑制肿瘤血管形成所致.     

5-LOX基因沉默对人胰腺癌细胞SW1990裸鼠移植瘤生长的影响

目的 观察裸鼠的人胰腺癌细胞SW1990移植瘤内注射靶向5-脂氧合酶(5-LOX)的短发夹RNA(shRNA)对移植瘤以及瘤组织5-LOX和血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响,探讨其临床应用价值.方法 将胰腺癌细胞SW1990接种至裸鼠背部皮下,待移植瘤生长至100 mm3左右后随机分为shRNA1组、shRNA2组、阴性对照shNC组和脂质体组.每组6只,雌雄各半.实验组瘤内注射相应shRNA 50μg/次,1次/3 d,共7次.对照组瘤内注射脂质体液100 μl/只.每3 d测体重及移植瘤长、短径一次.第29天处死动物,取肿瘤组织,称瘤重.应用免疫组化和RT-PCR法检测移植瘤组织5-LOX、VEGF的mRNA和蛋白的表达.结果 shRNA1组、shRNA2组、shNC组和脂质体组的瘤重分别为(32.5±19.0)mg、(30.1±14.1)mg、(50.5±15.6)mg和(71.7±25.4)mg,shRNA1组、shRNA2组、shNC组抑瘤率分别为54.7%、58.0%和29.5%,shRNA1组、shRNA2组较shNC组和脂质体组相差显著(P值均＜0.05).shRNA1组和shRNA2组移植瘤的5-LOX、VEGF mRNA和蛋白的表达较shNC组和脂质体组均显著减少,但两治疗组之间未见明显差异,shNC组和脂质体组之间也无明显差异.结论 靶向5-LOX的RNA干扰治疗通过直接抑制5-LOX的表达、间接抑制VEGF的表达而抑制SW1990裸鼠移植瘤的生长.     

siRNA沉默Livin基因对胃癌细胞生长、凋亡的影响

目的:观察小分子干扰RNA(siRNA)沉默Livin基因在胃癌BGC-823细胞中的表达, 并探讨Livin基因对胃癌细胞生长、凋亡的影响.方法:自行设计两条针对Livin基因的siRNA:Livin-sh-1和Livin-sh-2, 以此构建相应的表达载体并分别转染至对数生长期胃癌BGC-823细胞, 经G418筛选后分别采用半定量RTPCR检测不同siRNA实验分组细胞BGC-823mRNA水平变化, 四氮唑盐比色法(MTT)检测细胞增殖、流式细胞仪检测胃癌细胞的凋亡.结果:siRNA对照组与空siRNA载体组Livinα/β mRNA表达差别无显著性; 但转染siRNA组Livin α/β mRNA表达显著低于空白对照组和空siRNA载体组(Livin α:0.11±0.07 vs 0.37±0.10, 0.34±0.08; Livin β:0.13±0.04 vs 0.43±0.09, 0.45±0.11, 均P<0.05). 空白对照组与空siRNA载体组相比, 24、48、96 h和1 wk时细胞生长未受影响; 而siRNA组在转染后24 h和48 h细胞生长未受影响, 但在96 h和1 wk时则被明显抑制( P<0.01). 转染siRNA组的细胞的凋亡率与空白对照组和转染空siRNA载体组相比显著增加(14.85%±1.35% vs 4.51%±0.36%, 6.13%±0.71%, 均P<0.05).结论:siRNA沉默Livin基因能抑制胃癌细胞的生长, 促进胃癌细胞的凋亡, Livin基因有可能成为胃癌治疗的新靶点.