人胰岛素样生长因子Ⅰ基因的半合成及其克隆表达

目的 将人胰岛素样样生长因子Ⅰ（ＩＧＦ－Ⅰ）基因克隆到ｐＥＴ１１Ｃ中，构建成ｐＥＴＩＧＦ－Ⅰ表达载体，完成人ＩＧＦ－Ⅰ基因大在大肠杆菌中的表达。方法 利用固相亚磷酸三酯法化学合成人ＩＧＦ－Ⅰ基因的２条寡核苷酸片段，通过互补配对和Ｋｌｅｎｏｗ酶促补平成完整的ＩＧＦ－Ⅰ双链ＤＮＡ片段，然后经酶切克隆于ｐＴＶ１１８Ｎ载体中，构建ｐＴＶＩＧＦ－Ⅰ克隆载体并测定ＤＮＡ序列后，构建ｐＥＴＩＧＦ－Ⅰ表达载体。结     

接种表达细胞因子基因的重组HIV-1基因组DNA疫苗能增强HIV-1特异性免疫应答

１型人类免疫缺陷症病毒（ＨＩＶ－１）ＤＮＡ疫苗能诱导实验动物产生体液和细胞免疫应答,但这些免疫应答弱且短暂。ＤＮＡ疫苗免疫研究结果证实,白细胞介素２（ＩＬ－２）或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）基因与ＨＩＶ－１基因共表达可增强抗原特异性抗体应答。 作者以ＨＩＶ－１基因组为载体,通过ＤＮＡ重组技术分别构建了缺失ｔａｔ及ｎｅｆ基因（以消除其免疫抑制作用）但含有ＩＬ－２、ＧＭ－ＣＳＦ及γ干扰素（ＩＦＮ－γ）基因的重组质粒,分别称为ｐＴＸ ＧＥ／ＩＬ－２、ｐＴＸ ＧＥ／ＧＭ－ＣＳＦ及 ｐＴＸ ＧＥ…     

梭曼单链抗体的基因克隆和表达

成功地扩增了有机磷毒剂梭曼类似物１－羟基－１－对胺基苯基甲膦酸单频哪基醇酯与血蓝蛋白结合物免疫小鼠脾细胞中抗体重链和轻链基因片段，构建了单链抗体可变区基因（ＶＨ－ｌｉｎｋｅｒ－ＶＬＤＮＡ），并将该基因克隆到噬菌体表达载体ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ的外壳蛋白ｇ３ｐ基因中，使单链抗体以融合蛋白的形式在Ｅ．ｃｏｌｉＴＧ１中表达在噬菌体表面，构成噬菌体抗体库．通过免疫亲和淘洗和竞争抑制酶联免疫吸附测定法筛选，得到１２株克隆，其分泌的单链抗体与梭曼有结合活性．     

基因工程丙酰螺旋霉素

以碳霉素４＂异戊酰基转移酶基因（ＣａｒＥ）为探针，从麦迪霉素产生菌基因文库中，经菌落杂交获得阳性菌落ｐＣＮ１０Ｆ５。经分子杂交证明ｐＣＮ１０Ｆ５ＤＮＡ的ＢａｍＨＩ－ＢａｍＨＩ８．０ｋｂ片段与ＣａｒＥ基因同源。将ｐＣＮ１０Ｆ５ ＢａｍＨＩ８．０ｋｂ片段分别克隆到ｐＩＪ６８０、ｐＷＨＭ３，ｐＷＨＭ６０１质粒载体上，获得重组质粒ｐ６Ｆ５，ｐＷＦ５和ＰＧＦ５。含上述重组质粒的螺旋霉素产生菌克隆菌株均产生与     

人IL—15cDNA的克隆及真核表达载体的构建

目的 构建人白细胞介素－１５（ＩＬ－１５）ｃＤＮＡ真核表达载体,以期在哺乳类细胞中获得高效、稳定表达。方法 从外周血粘附性单核细胞（ＰＢＭＣ）中提取总ＲＮＡ,经ＲＴ－ＰＣＲ方法获取了人ＩＬ－１５ｃＤＮＡ,并与ｐｃＤＮＡ３．１质粒的ＥｃｏＲＩ和ＸｂａＩ位点定向连接,构建受控于人巨细胞病毒（ＣＭＶ）启动子的重组真核表达载体ｐｃＤＮＡ３１－ＩＬ－１５。结果 经ＰＣＲ扩增鉴定和ＤＮＡ序列分析,证明ＩＬ－１５已经正确插入克隆载体且序列正确。     

人G—CSF基因组基因的克隆和序列测定

用ＰＣＲ方法，以提取的正常中国人染色体ＤＮＡ为模板，成功地扩增出１．５ｋｂ的人Ｇ－ＣＳＦ基因组基因。将其克隆至ｐＵＣ１９，构建成重组质粒ｐＧＧ－２，在酶切证实正确的基础上，将其酶切成三个片段进行了亚克隆。利用ｐＵＣ１９的的正反通用引物进行序列分析。自动测序结果表明其编码区的序列是正确的。并对该基因的应用前景做了讨论。     

人碱性成纤维细胞生长因子基因在大肠杆菌中的表达

用ＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩ酶切，获得人碱性成纤维细胞生长因子基因，将该基因插入原核高效表达载体ＰＢＶ２２０的ＰＬＰＲ启动子下游，获得重组质粒ＰＢＶ－ＦＧＦ，转化大肠杆菌ＤＨ５α，４２℃诱导使重组子表达。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ、ＭＴＴ活性检测结果表明，该重组菌能够表达具有生物活性的ｈｂＦＧＦ。     

新型降钙素的基因合成与克隆表达

借助计算机辅助设计了一种新的人降钙素类似物（新型降钙素）。根据密码子偏爱性原理及基因操作原则了它的基因,运用化学法和酶法相结合的技术合成了该基因,并克隆到质粒ｐＵＣ１９中,ＤＮＡ测序验证正确。该基因被克隆到融合型表达本ｐＧＥＸ－２Ｔ中,重组融合型表达载体ｎＣＴ／ｐＧＥＸ－２Ｔ转化Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１,增减表达,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析可见Ｍｒ约３１０００的融合蛋白带,融合蛋白占细胞内总蛋白３４％。Ｗｅ     

大肠杆菌分泌型载体表达重组人碱性成纤维细胞生长因子

设计构建了带有大肠杆菌外膜蛋白信号肽序列的重组分泌型表达载体ｐＳＥ－ｈｂＦＧＦ，在大肠杆菌ＤＨ５α中分泌表达了重组人碱性成纤维细胞生长因子。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、免疫印迹及生物活性测定均表明表达产物分泌到细胞细菌周质和培养式中。分泌到周质中的ｒｈｂＦＧＦ可占周质总蛋白的１５％。     

人TIMP-2基因逆转录病毒重组体的构建及表达

目的：构建含人ＴＩＭＰ－２基因可调控逆转现毒重组体。方法：通过四步亚克隆将编码人组织金属蛋白酶抑制剂－２（ＴＩＭＰ－２）的基因片段从表达载体Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中切下,定向插入经改良的逆转录病毒载体ｐＬ－ＭＴ上,以限制性内切酶鉴定插入方向是否正确。结果：结果：限制性内切酶谱分析与理论计算相等。结论：含人组织金属蛋白酶抑制剂ＴＩＭＰ－２基因可逆转录病毒重组体构建成功,为体外胶原代谢的基因调控研究提供     

重组人白细胞介素-21的原核表达及其复性与纯化

目的构建工程菌BL21/pET30a(+)-IL-21表达体系,表达并纯化出具有生物学活性的目的蛋白质。方法用基因工程方法构建表达质粒pET30a(+)-IL-21;在BL21大肠杆菌中诱导表达基因重组人白细胞介素-21(rhIL-21);提取包涵体并建立复性条件;用Ni-NTA凝胶纯化出rhIL-21;以NK92为效应细胞,观察rhIL-21对NK92的生物学作用,以此检测其活性。结果构建了重组质粒pET30a(+)-IL-21,工程菌BL21/pET30a(+)-IL-21能大量表达目的蛋白质;经复性和纯化得到具有生物学活性的rhIL-21。结论成功建立了人IL-21的原核表达体系,得到了有生物学活性的rhIL-21蛋白质。     

凋亡素基因的克隆及其原核表达

目的建立凋亡素基因克隆及原核表达的方法。方法根据已报道的鸡贫血病毒凋亡素基因设计合成一对引物 ,通过PCR扩增 ,构建重组质粒pUC18 VP3,将其与pET30质粒分别用限制性内切酶NdeⅠ、EcoRⅠ消化 ,构建原核表达载体pET30 VP3,用以转化感受态的E .coliDE3,经IPTG化学诱导表达 ,表达产物进行SDS PAGE电泳鉴定。结果凋亡素基因在E .coliDE3中获得了大量表达。结论该结果对凋亡素进一步开发为抗肿瘤新药具有重要意义。     

sCR1在原核中表达、纯化、复性及活性鉴定

目的采用原核表达载体pET28a在E.coli BL21(DE3)中获得高表达、高活性的重组人sCR1融合蛋白。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,将其克隆入原核表达载体pET28a中,构建含人sCR1的重组质粒(pET28a-sCR1),经测序鉴定正确,转化入E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后进行复性及生物学活性鉴定。结果获得原核表达载体pET28a-sCR1,经PCR鉴定及测序鉴定,得到重组E.coli BL21(DE3)克隆菌株,经IPTG诱导含有pET28a-sCR1的E.coli BL21(DE3)克隆菌,表达出重组人sCR1融合蛋白。此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr大于29000的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆单抗体(mAb)识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化、复性后得到高纯度的sCR1融合蛋白表达及较高的生物学活性。结论人sCR1融合蛋白在E.coli BL21(DE3)表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性及其生物学活性。     

人源热休克蛋白HSC70与HPV16型E7融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化和活性检测

目的 克隆人热休克蛋白HSC70的N端具有ATPase活性的结构域(简称为A基因)与HPV 16型E7的融合基因,在大肠杆菌中表达,并纯化获得有生物活性的AE7融合蛋白.方法 利用PCR方法扩增获得A基因片段,插入原核表达载体pET29b中,再通过PCR方法扩增HPV 16型E7基因片段,插入A基因的3′端,构建原核表达质粒pET29b-AE7,并转化大肠杆菌BL21(DE3),表达产物经离子交换层析和金属螯合层析纯化后,在一定的剂量下皮下免疫小鼠,检测对HPV-16的E7基因感染的预防及治疗作用.结果 重组质粒pET29b-AE7经DNA序列测定确认.SDS-PAGE检测,表达产物分子量为66kD,大部分为包涵体.纯化后产物经SDS-PAGE电泳分析纯度>90%.纯化产物AE7在一定的剂量下皮下免疫小鼠,对HPV-16的E7基因的感染有预防及治疗作用.结论 AE7融合蛋白的获得为进一步临床研究奠定基础.     

心肌肌钙蛋白Ⅰ的融合表达和分离纯化

目的研究人心肌肌钙蛋白(cTnⅠ)在大肠杆菌中稳定高效的融合表达和分离纯化,以满足临床诊断的需要。方法人cTnⅠDNA序列由pdf 5-cTnⅠ质粒经PCR亚克隆而得,然后将其插入pET32a(+)载体,构建成pET32a(+)-cTnⅠ表达质粒,以大肠杆菌BL21(DE3)为表达菌,在IPTG诱导下进行表达。结果硫氧还蛋白(TrxA)-cTnⅠ融合蛋白得到高效表达,并经金属螯合亲和色谱一步纯化得到目的蛋白质。试剂盒检测结果表明该重组蛋白质具有cTnⅠ免疫原活性。结论构建了pET32a(+)-cTnⅠ重组质粒,并在大肠杆菌中获得高效表达,为建立急性心肌梗死早期诊断试剂奠定了基础。     

重组人白细胞介素24蛋白对胰腺癌细胞生长的影响

目的构建人白细胞介素24(IL-24)基因的表达载体并在大肠杆菌中诱导表达,观察纯化后的IL-24融合蛋白导致人胰腺癌细胞(Panc-1)生长抑制的作用。方法用限制性内切酶从质粒pET30b-IL-24中酶切获取人IL-24cDNA片段。并将该片段与pET42a原核表达载体基因重组,在大肠杆菌中实现重组基因的表达,提取并纯化rhIL-24蛋白。用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)和Westernblot对表达产物进行鉴定。以不同浓度的重组蛋白IL-24与胰腺癌细胞Panc-1、正常肝胚细胞CCC-HEL-1共培养48h,同时设立相应浓度梯度的HIS-GST融合蛋白组对照组。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测各组细胞的生长抑制情况。结果酶切结果证实,成功构建了pET42a-IL24原核表达载体,并在大肠杆菌中获得稳定的表达。rhIL-24蛋白以浓度依赖性的关系抑制Panc-1细胞的生长,抑制率明显高于HIS-GST蛋白。结论rhIL-24蛋白对胰腺癌细胞Panc-1生长有抑制作用。     

红色荧光蛋白变种mCherry的表达、纯化和应用探讨

目的 应用pET表达系统原核表达红色荧光蛋白变种mCherry,分析重组mCherry表达与荧光变化的关系,为其纯化及作为原核报告系统应用提供依据.方法 根据GenBank中收录的mCherry氨基酸序列合成其编码基因,构建pET-mCherry表达质粒,转化入大肠埃希菌BL21 (DE3)表达宿主.在不同诱导时间点,考察菌株荧光强度、mCherry表达量、培养上清液mCherry泄漏情况.诱导10h后提取重组mCherry,利用荧光强度估算提取收率,并通过凝胶电泳分析提取液的蛋白纯度.结果 成功构建pET-mCherry表达载体,并在BL21(DE3)中得到高效诱导表达.荧光检出滞后于mCherry的表达,随诱导时间延长重组mCherry不断泄漏至培养液中.初步提取的重组mCherry纯度达到95％以上.结论 应用pET表达系统可高效表达mCherry,过表达mCherry可泄漏至胞外,方便其纯化.mCherry作为原核报告系统应用时,合理的诱导时间可能是关键影响因素.     

HPV18E6基因的原核克隆及表达

目的:构建pET32a(+)HPV18E6原核表达质粒并优化其表达条件,探讨喉癌组织中HPV18E6蛋白的表达及意义.方法:应用基因重组技术,构建pET32a(+)与HPV18E6的原核表达重组质粒,采用PCR方法扩增HPV18E6基因,经BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切后插入相同酶切pET32a(+)载体,转化JM109感受态细胞并进行阳性克隆筛选,用限制性内切酶酶切和核酸序列检测方法鉴定重组质粒DNA,将其转入宿主菌E.coli BL21(DE3),用IPTG对重组质粒进行诱导表达,SDS-PAGE及Western blot方法鉴定表达蛋白的分子质量及特异性.结果:成功构建了原核表达质粒Pet32/HPV18E6, 限制性内切酶酶切和核酸序列检测证实重组质粒中插入的是目的基因,其DNA大小、方向、插入位点和阅读框架均正确;HPV18E6蛋白得到高效原核表达,表达HPV18E6的工程菌BL21(DE3)的最佳诱导温度是37 ℃,诱导剂IPTG的浓度为1 mmol/L. 结论:HPV18E6融合蛋白的表达为进一步深入研究HPV18E6蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用机制奠定了基础.     

一种新穿膜肽的构建、表达及其活性检测

通过对穿膜肽TAT-PTD构效关系的分析和结构改造，构建能有效进入血脑屏障且低毒的新穿膜肽。该研究用分子克隆技术构建出表达型载体pET28a—T1-GFP，重组质粒在大肠杆菌Ecoli BL21（DE3）中表达融合蛋白His-T1-GFP，经组氨酸亲和层析纯化后，用荧光显微镜和免疫组化的方法来检测His—T1-GFP在活体动物小白鼠体内的跨膜递送作用。经测序证实成功构建了表达型载体pET28a—T1-GFP，融合蛋白His—T1-GFP在大肠杆菌EcoliB L21（DE3）中表达率为20％。经组氨酸亲和纯化，得到纯度达85％的融合蛋白。SDS-PAGE和Western Blotting显示纯化蛋白为His-T1-GFP，动物实验表明融合蛋白His—T1-GFP能够有效跨过血脑屏障，主要分布在大脑皮层和海马回。该研究成功地构建了-种新的穿膜肽-T1，为其携带有生物活性的大分子物质到达脑部进行蛋白治疗奠定了基础。     

Daxx-C626-740原核细胞表达载体的构建与诱导表达

目的为了研制Daxx-C抗体并观察其在宫颈癌细胞中的应用效果,构建原核表达载体pET28a／DM626-740,将其在大肠杆菌中进行诱导表达,纯化表达产物,鉴定其抗原性。方法用PRIMER5．0软件设计Daxx-C基因片段（氨基酸626-740）特异性引物,引入BamHl和SalI酶切位点,PCR扩增目的基因。将PCR产物连入载体pMD18-T,构建pMD18-T／DM626-740;然后,将BamHI和Sail酶切产物连入载体pET28a,经酶切鉴定及DNA序列分析后,构建原核表达载体pET28a／DM626-740。将其转化E．coliBL21,IPTG诱导表达,利用Ni琼脂糖凝胶层析柱纯化表达产物,Western-blot检测表达物与纯产物。结果双酶切和DNA测序结果显示,PCR正确扩增了Daxx-C基因片段并成功连入载体pET28a,构建了原核表达载体pET28a／DM626-740,该质粒在E．coli中诱导表达分子量约19kDa目的蛋白,且该蛋白能被抗Daxx抗体检出。结论构建的原核表达载体pET28a／DM626-740能在E.coli中表达目的的蛋白6His-DM626-740,并具有良好的抗原性。