参芪脑保含药血清在体外培养PC12细胞抗凋亡作用中的量效分析

目的：观察在经典药方补阳还五汤基础上加减而成的参芪脑保对体外培养的正常PC12细胞增殖和对抗活性氧（100μmol／L过氧化氢）引起的细胞凋亡作用，分析该作用的量效关系。方法：实验于2002—09／2003—04在解放军总医院老年医学研究所老年医学实验室完成。①含药血清制备：选用3月龄SD大鼠。随机分为4组：对照组，参芪脑保6．4，3,2，1．6g／kg组，每组12只。参芪脑保6．4，3,2，1．6g／kg组：将参芪脑保颗粒剂（成分：黄芪、丹参、当归尾、桃仁、红花、川芎、赤芍、地龙，10g/包，由解放军总医院制剂室提供，批号000831）按6．4，3．2，1．6g／kg剂量溶于2mL蒸馏水中灌胃；对照组：给予等量蒸馏水。各组连续灌胃7d后腹主动脉取血分离含药血清。（当参芪脑宝对正常细胞增殖的影响：采用大鼠PC12细胞作为体外神经细胞模型。将对数生长期细胞接种于96孔培养板，将细胞随机分为4组：对照组和参蓖脑保6．4．3,2，1．6g/kg组，分别加入含体积分数0．1各组相应含药血清的DMEM蜊养液，分别于培养24，60和86h进行细胞计数。③参琵腑保抗活性氧引起的细胞凋亡作用：将对数生长期细胞培养24h。将细胞随机分为5组：对照组、过氧化氢损伤组和过氧化氢＋参芪脑保6．4，3．2，1．6g/kg组，除对照组外，其余并组均用含过氧化氢（终浓度100μmol／L）和20g／L B27的无血清DMEM培养基处理30min，过氧化氢损伤组和氧化损伤组改用含体积分数0．1的对照组血清培养基，参芪脑保各剂量组改用相应的含药血清培养基继续培养48h。（14）采用四氨唑监比色法测定正常细胞增殖和活性氧损伤后细胞存活数；采用流式细胞仪和DNA ladder法观察细胞凋亡及参芪脑保抗凋亡作用及其剂量效应关系。⑤多组间差异采用方差分析，根据方差齐性结果，采用非配对t检验作两组间比较。结果：④参芪脑保对正常细胞增殖的影响：与对照组相比，参芪脑保6．4，3,2，1．6g／kg组在培养24，48和86h时均能明显提高正常PC12细胞的存活数（P〈0．01），但无明显剂量效应关系。②参芪脑保对活性氧损伤后细胞存活数的影响：过氧化氢损伤组的细胞存活数明显低于对照组（P〈0．01），除了过氧化氯十参芪脑保1．6g／kg组外，过氧化氢＋参芪脑保6．4，3．2g／kg组细胞存活数明显高于过氧化氢损伤组（P〈0．01）。③参芪脑保对活性氧损伤后细胞凋亡率影响：过氧化氢损伤组的细胞凋亡率明显高于对照组，除过氧化氢＋参芪脑保1．6g／kg组外，过氧化氢＋参芪脑保6．4，3．2g／kg组细胞凋亡率均明显低于过氧化氢损伤组（P〈0．01）。④参芪脑保对活性氧损伤后细胞DNA片断化的影响：过氧化氢损伤组细胞的DNA片断化明显增强，过氧化氢＋参芪脑保3．2g／kg组也可见轻度DNA ladder现象，但过氧化氢十参芪脑保3．2g／kg和6．4g／kg组的DNA ladder则明显减弱甚至消失，说明有明显的剂量效应关系。结论：参芪脑保对正常培养PC12细胞具有明显促进增殖作用，并在较岛剂量下能显著对抗过氧化氢引起的细胞存活率降低、细胞凋亡率增高和DNA片断化，表明参芪脑保具有明显的神经保护作用，其机制可能与抗氧化反应有关。     

反义阻断α-Synuclein表达对PC12细胞凋亡的作用

目的:观察α-Synuclein表达对6-羟基多巴诱导的多巴胺能细胞凋亡的影响及分析其在帕金森病发病机制中所起的作用。方法:实验于2001-12/2004-10于中山大学第一附属医院神经科实验室完成。用100μmol/L的6-羟基多巴诱导PC12细胞凋亡。采用多组样本的完全随机设计方法,将1×105个细胞接种于4块四孔培养板中,共16个孔,随机分为4组:反义、正义、无义寡核苷酸治疗组和空白对照组。前3组分别加入相应的寡核苷酸5μmol/L治疗24h,空白对照组不加。反义寡核苷酸阻断PC12细胞α-Synuclein表达,用原位杂交和定量Westernplot检测其基因和蛋白表达;凋亡原位末端标记检测试剂盒检测6-羟基多巴诱导的PC12细胞凋亡。全自动图象分析系统测量有关平均积分吸光度。用SPSS10.0软件进行统计学分析。结果:①反义阻断后α-SynucleinmRNA表达:反义寡核苷酸治疗组较空白对照组明显减少(P<0.01),正义寡核苷酸治疗组和无义寡核苷酸治疗组与空白对照组比较无差异(P>0.05)。②α-Synuclein蛋白表达:反义寡核苷酸治疗组明显减少,较空白对照组减少约53.93%(P<0.05)。正义寡核苷酸治疗组、无义寡核苷酸治疗组和空白对照组之间差异不显著(P>0.05)。③6-羟基多巴治疗后的反义寡核苷酸治疗组、正义寡核苷酸治疗组、无义寡核苷酸治疗组和空白对照组随机计数的200个细胞中,凋亡细胞数量间相互比较无显著统计学意义(P>0.05)。结论:α-Synuclein表达减少对6-羟基多巴诱导的PC12细胞凋亡无影响。推测在帕金森病的多巴胺神经元凋亡的发生机制中,α-Synuclein在神经元内的异常聚集较其表达量的多少更重要。     

LPA2在PC12细胞缺血再灌注损伤致细胞凋亡中的作用

目的探讨溶血磷脂酸(LPA)2受体在PC12细胞缺血再灌注损伤致细胞凋亡中的作用。方法以实验方法完成研究,通过建立PC12细胞缺血再灌注受损细胞模型,分别于缺氧环境中培养0、3、6、9、12、15h以进行糖氧剥夺,之后再将其放入高糖培养基中再次复氧培养24h,然后利用MTT来检测细胞存活率,并对其进行分组,分为正常组、缺血再灌注组(A组)、缺血再灌注+溶剂对照组(B组)、缺血再灌注+LPA2激动剂组(C组)、缺血再灌注+LPA2抑制剂组(D组)。先进行缺氧培养一定时间后再复氧培养24h,并采用MTT检测细胞存活率,同时,检测LPA2受体与P-akt蛋白的表达情况。结果经糖氧剥夺培养6h后,缺血再灌注的细胞存活率较正常组明显下降,差异有统计学意义(P0.05),且缺血再灌注损伤糖氧剥脱处理最适时间为12h。A组LPA2表达水平明显低于B组;C组与B组相比较,LPA2表达水平显著增高,且P-akt表达水平显著增高,差异有统计学意义(P0.05)。结论 LPA2受体在PC12细胞缺血再灌注损伤致细胞凋亡中起着重要的保护作用,且升高LPA2受体表达水平有助于提高细胞生存率。     

替吉奥单药治疗晚期非小细胞肺癌的疗效和安全性分析

目的观察替吉奥胶囊单药治疗晚期非小细胞肺癌（NSCLC）的临床疗效及安全性。方法回顾性分析2011年8月至2014年10月本科43例经病理学确诊的二线或二线以上治疗失败的晚期NSCLC患者的临床资料,患者据体表面积（BSA）口服替吉奥胶囊80～120 mg／d ,即BSA＜1．25 m2予80 mg／d ,1．25 m2≤BSA＜1．5 m2时予100 mg／d ,BSA≥1．5 m2时予120 mg／d ,分2次口服,d1～d14,21 d为l周期。2个周期后评价疗效,疗效稳定或有效患者每6周接受一次CT和其它影像学检查进行疗效评价,记录最好疗效。计算有效率（RR）、疾病控制率（DCR）、总生存期（OS）、无进展生存期（PFS）以及不良反应。结果既往接受化疗方案的中位周期数为3（2～5）,接受替吉奥胶囊治疗的中位周期数为4（1～8）。38例患者可评价疗效,无CR病例,PR 5例（11．6％）,SD 11例（25．6％）,PD 22例（51．2％）,有效率（CR＋ PR）为11．6％,疾病控制率（CR＋ PR＋SD）为37．2％;OS为5．5个月（95％ CI：4．9～6．1）,PFS为3．0个月（95％ CI：2．6～3．4）。主要不良反应是消化道反应及骨髓抑制,多为1～2级;无Ⅳ度血液学毒性,无治疗相关性死亡。结论替吉奥胶囊单药治疗三线及以上晚期NSCLC有一定的疗效,且不良反应可以耐受。     

活性氧在荆花牡荆素诱导人肺癌A549细胞凋亡中的作用

目的 探讨紫花牡荆素(CAS)诱导人肺腺癌A549细胞凋亡及其机制.方法 体外培养A549细胞.MTT法测定CAS对A549细胞增殖的抑制;Annexin V/PI双染色分析细胞凋亡率;H2DCFH-DA探针流式细胞术分析活性氧(ROS)生成.结果 CAS能抑制人肺癌A549细胞增殖,呈浓度依赖性.Annexin V/PI法检测结果显示10 μmol/L的CAS作用A549细胞12 h、24 h、48 h后,其凋亡率分别为22.39%、38.66%、64.82%.H2DCFH-DA探针流式细胞术分析表明,完全培养基组、溶媒(0.1% DMSO)组对A459细胞作用0 h;CAS(10 μmol/L)对A549细胞作用3 h、6 h、12 h;N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC,10 mmol/L)+CAS(10 μmol/L)组对A549细胞作用6 h的ROS生成水平分别为8.47、15.26、66.2、74.1、82.2、67.3,随着CAS作用时间延长,细胞内ROS水平增加.NAC对细胞凋亡有抑制作用.结论 CAS可诱导A549细胞凋亡,其作用机制可能与提高细胞内ROS产生增加有关.     

脑益康药物血清对谷氨酸和过氧化氢诱导的PC12细胞损伤的保护作用

目的:运用血清药理学方法观察脑益康药物血清对谷氨酸和过氧化氢诱导的PC12细胞损伤的保护作用。方法:①实验于2004-10/12在南通大学基础医学院病理生理实验室完成。采用12月龄SD大鼠24只,随机分为2组:对照组和脑益康灌胃组,每组12只,脑益康组以人等效剂量的1.5倍连续10d灌胃,末次灌胃后1h采血,收集脑益康药物血清。收集对照组(灌胃等量生理盐水)血清为对照。②PC12细胞经神经生长因子诱导7d后,用DMEM基础培养基洗2次,DMEM培养基中分别加入100,300,500g/L脑益康中药血清,于37℃培养1h,后加入0.2mmol/L谷氨酸,0.5mmol/L过氧化氢继续培养30min。同时设模型组(造成谷氨酸和过氧化氢诱导PC12细胞损伤模型)及对照组(对照组大鼠血清,不加谷氨酸和过氧化氢)。③采用四唑盐比色法测定PC12细胞存活率;按由南京建成生物工程公司提供测试盒说明书进行乳酸脱氢酶释放量、丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性测定。④计量资料差异比较采用ANOVA法。结果:①谷氨酸和过氧化氢模型组的PC12细胞存活率明显低于对照组(P<0.05,0.01);而乳酸脱氢酶释放量明显高于对照组(P<0.01);谷氨酸和过氧化氢模型组的PC12细胞丙二醛含量明显高于对照组(P<0.01);而超氧化物歧化酶活性明显低于对照组(P<0.01)。②脑益康药物血清组PC12细胞存活率明显高于谷氨酸模型组和过氧化氢模型组(P<0.05～0.01);而细胞的乳酸脱氢酶释放量明显低于谷氨酸模型组和过氧化氢模型组(P<0.05～0.01)。③脑益康药物血清组丙二醛含量明显低于谷氨酸模型组和过氧化氢模型组(P<0.05,0.01);而超氧化物歧化酶活性明显高于谷氨酸模型组和过氧化氢模型组(P<0.05)。结论:脑益康药物血清能明显减轻谷氨酸和过氧化氢诱导的PC12细胞的损伤,其机制可能与减少膜脂质过氧化物生成,提高抗氧化酶活性有关。     

补阳还五汤及拆方影响脑缺血再灌注大鼠细胞凋亡与Bcl-2、Bax蛋白的表达

背景:补阳还五汤是一种临床上常用的治疗缺血性脑血管疾病的中药,其作用机制还有许多不明之处。目的:观察补阳还五汤及拆方对脑缺血再灌注SD大鼠模型细胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表达的影响及其作用机制,并研究方剂配伍的意义。设计:随机对照的动物实验。单位:河南中医学院第一附属医院神经内科。材料:实验在河南省中医药研究院国家中医管理局三级实验室进行。选择上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供的清洁级SD大鼠60只,月龄4～5个月;雌雄各半,雌性260～310g,雄性280～330g。活血组药物选用当归120g,桃仁60g,川芎60g,加水1440mL,提取挥发油,备用。药渣及提取液加入赤芍120g,地龙60g,红花60g,再加入1440mL水,煎煮1h,滤过,药渣再加入2880mL水,煎煮1h,滤过,合并两次煎液,浓缩至1200mL,加入挥发油及吐温-803mL,混匀,即得。黄芪组药物选用黄芪1200g,加水7200mL,煎煮两次,每次1h,滤过,合并煎液,浓缩至600mL,加入吐温-802mL,即得。补阳还五汤组选用当归60g,桃仁30g,川芎30g,加水720mL,提取挥发油,备用。药渣及提取液加入黄芪1200g,赤芍60g,地龙30g,红花30g,再加入920mL水,煎煮1h,滤过,药渣再加入8640mL水,煎煮1h,滤过,合并两次煎液,浓缩至600mL,加入挥发油及吐温-803mL,混匀,即得。(黄芪组和补血组药物为补阳还五汤的拆方。)活血组药物每毫升相当生药0.4g,黄芪组药物每毫升相当于生药2g,全方组药物相当于生药2.4g。方法:将60只清洁级SD大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、活血组、黄芪组、总方组,每组分别为12只。每只SD大鼠分别通过灌胃给药:活血组8g/kg、黄芪组40g/kg、总方组48g/kg,假手术组及模型组分别给予生理盐水20mL/kg。通过四血管结扎法制作脑缺血再灌注模型。采用缺口末端标记法原位检测凋亡细胞(TUNEL),应用免疫组化法测定Bcl-2蛋白、Bax蛋白的表达。主要观察指标:①各组SD大鼠脑组织神经元细胞凋亡水平的比较;②各组SD大鼠脑组织神经元Bcl-2、Bax阳性细胞表达水平的比较。结果:①各组SD大鼠脑组织神经元细胞凋亡水平比较:与假手术组相比,其他各组细胞凋亡明显增加(t=6.07～11.70,P<0.01);与模型组相比,活血组、黄芪组细胞凋亡减少(t=2.71,2.06,P<0.05),总方组减少明显(t=5.34,P<0.01)。②各组SD大鼠脑组织神经元Bcl-2、Bax阳性细胞表达水平的比较:与假手术组相比,活血组、黄芪组、总方组Bcl-2染色阳性细胞的表达增多(t=4.59～8.82,P<0.01),Bax阳性细胞表达更加明显(t=4.59～8.55,P<0.01);与模型组相比,活血组、黄芪组、总方组Bcl-2染色阳性细胞的表达增多(t=3.48～7.75,P<0.01),Bax阳性细胞的表达降低(t=3.83～5.88,P<0.01)。活血组药物作用与黄芪组差异无显著性(P>0.05),总方组药物作用与黄芪组、活血组差异极具显著性(P<0.01)。结论:补阳还五汤及拆方通过抑制细胞凋亡的作用,达到抗脑缺血再灌注损伤的作用。黄芪组和活血组即拆方的协同作用,使总方组发挥最大的疗效。     

细胞凋亡的线粒体信号通路在大鼠缺血延迟预适应抗心肌细胞凋亡机制中的作用

目的：以细胞凋亡的线粒体途径为切入点,探讨心肌缺血延迟预适应抑制心缺血再灌注（MI/R）后细胞凋亡的可能机制.方法：SD大鼠分为正常对照组、假手术组、缺血再灌注组、延迟缺血预处理组.缺血再灌注组采用经典大鼠冠脉结扎,缺血1h,再灌1h.延迟缺血预处理组采用缺血5min,再灌5min,反复循环3次,24h后缺血1h,再灌1h.流式细胞仪测定心肌细胞凋亡率,进行细胞色素C（CytC）和凋亡诱导因子（AIF）的Western blotting分析及Caspase-3活性测定,并利用免疫组织化学染色法检测大鼠心肌HSP70的表达.结果：与缺血再灌注组相比较,心肌缺血预处理24h后可以减少MI/R后心肌细胞凋亡率,抑制CytC和AIF自线粒体向胞浆的释放及caspase-3的活化,上调HSP70蛋白表达.结论：心肌缺血延迟预适应可以减少MI/R造成的细胞凋亡,机制与其诱导HSP70的生成,抑制细胞凋亡的线粒体信号转导途径有关.     

动脉粥样硬化兔自体血清在树突状细胞体外培养中的作用

目的:采取球囊损伤加高胆固醇饮食的方式建立兔动脉粥样硬化模型,观察模型兔自体血清对外周血源性树突状细胞的作用.方法:8只雄性新西兰白兔球囊损伤腹主动脉后给予高胆固醇饲料喂养8周,培养模型兔外周血源性的树突状细胞,随机分为4组,空白组加入PBS液,对照组及实验组分别加入制模前后两次提取的自体血清培养(10%),ox-LDL组加入ox-LDL(10μg/mL).流式细胞学检测细胞表面标记物CD14、CD86、MHCⅡ的表达,观察不同浓度的同种异体混合淋巴细胞反应.结果:球囊损伤后高胆固醇饮食8周兔动脉粥样硬化模型形成,实验组自体血清共培养后的DCs表面CD86和MHCⅡ的表达明显升高,并且由CD14+转化为CD14-,空白组及对照组DC表型无明显变化.且实验组DCs诱导的T淋巴细胞增值反应明显高于空白及对照组.ox-LDL组则产生和实验组同样的效应,且更加强烈.结论:通过球囊损伤加高胆固醇饮食的方式可以在短时间内建立兔动脉粥样硬化模型,模型兔体内存在诱导DCs成熟的抗原,DCs成熟与该动物模型AS发生发展可能有相关关系.     

当归多糖在体外抑制HCMV感染所致巨核系细胞凋亡中的作用探讨

本研究探讨当归多糖（angelica polysaccharide,APS）在体外抑制HCMV感染致人巨核系细胞凋亡中的作用。HCMV AD169体外感染巨核系细胞CHRF-288-11,在病毒感染后第3天向试验体系中加入APS。用PCR扩增检测HCMV DNA,用形态学、DNA片段化、细胞表面标志检测APS对HCMV感染所致巨核系细胞凋亡的影响。结果表明：APS在一定程度上能抑制HCMV体外感染诱导的巨核系细胞CHRF-288-11凋亡,且呈剂量依赖性。感染的巨核系细胞CHRF-288-11中有hCMV IEA的表达,形态学和DNA片段化分析证实了细胞凋亡的存在,Annexin V／PI双染流式细胞仪分析显示受感染的CHRF细胞中随着加入APS剂量的减少,凋亡率呈上升趋势。结论：HC—MVAD169株在体外可直接感染巨核系细胞并降低其存活率;HCMVAD169株在体外感染巨核系细胞后可诱导其加重凋亡,凋亡率与时间呈正相关。在HCMVAD169株体外感染巨核系细胞后,向培养细胞中加入APS,可以提高受染细胞的存活率,表明APS对HCMV感染的巨核系细胞有一定的保护作用;APS在一定程度上能抑制HCMV体外感染诱导的巨核系细胞凋亡,且呈剂量依赖性。     

藻黄合剂含药血清体外培养人肾小球系膜细胞结缔组织生长因子的表达

背景:结缔组织生长因子是转化生长因子β1的下游效应因子,其异常表达在肾小球硬化及纤维化发生、发展中起重要作用。目的:观察藻黄合剂含药血清对肾小球系膜细胞结缔组织生长因子表达的影响。方法:血清药理学方法制备藻黄合剂低、中、高剂量,空白对照及海昆肾喜阳性对照大鼠含药血清,分别用体积分数10%各含药血清培养基孵育高糖作用下肾小球系膜细胞48h,另设低糖组为对照。免疫细胞化学和RT-PCR方法检测各组系膜细胞结缔组织生长因子蛋白及mRNA的表达。结果与结论:结缔组织生长因子蛋白及mRNA表达在高糖组较低糖组明显升高(P<0.01);藻黄合剂各剂量组结缔组织生长因子蛋白及mRNA表达均低于高糖组,且具有剂量依赖性;藻黄合剂高剂量组与海昆肾喜组比较结缔组织生长因子蛋白及mRNA表达差异无显著性意义(P>0.05)。提示高糖可诱导肾小球系膜细胞中结缔组织生长因子的表达,而藻黄合剂可抑制高糖条件下肾小球系膜细胞中结缔组织生长因子蛋白及mRNA的表达。     

藻黄合剂含药血清体外培养人肾小球系膜细胞结缔组织生长因子的表达

背景：结缔组织生长因子是转化生长因子β1的下游效应因子,其异常表达在肾小球硬化及纤维化发生、发展中起重要作用。目的：观察藻黄合剂含药血清对肾小球系膜细胞结缔组织生长因子表达的影响。方法：血清药理学方法制备藻黄合剂低、中、高剂量,空白对照及海昆肾喜阳性对照大鼠含药血清．分别用体积分数10％各含约曲l清培养基孵育高糖作用下肾小球系膜细胞48h,另设低糖组为对照。免疫细胞化学和RT．PCR方法检测各组系膜细胞结缔组织生长因子蛋白及mRNA的表达。结果与结论：结缔组织生长因子蛋白及mRNA表达在高糖组较低糖组明显升高（P〈O.01）：藻黄合剂各剂量组结缔组织生长因子蛋白及mRNA表达均低于高糖组,且具有剂量依赖性：藻黄合剂高剂量组与海昆肾喜组比较结缔组织生长因子蛋白及mRNA表达差异无疑著性意义（P〉0.05）。提示高糖可诱导肾小球系膜细胞中结缔组织生长因子的表达,而藻黄合剂可抑制高糖条件下肾小球系膜细胞中结缔组织生长因子蛋白及mRNA的表达。     

脑微血管内皮细胞对体外培养神经干细胞分化影响的量效关系

目的:观察不同比例的脑微血管内皮细胞对体外培养的神经干细胞向神经元分化的影响。方法:实验于2005-12/2006-10在佳木斯大学神经病学研究所完成。①实验动物:取新生6h内Wistar小鼠4只用于神经干细胞的培养。另取新生1～7d Wistar大鼠4只用于脑微血管内皮细胞的培养。②实验方法:取新生神经球按5×108L-1接种于预先置有盖玻片的6孔板中,2mL/孔,并加入含表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12条件培养基,于24h后行巢蛋白免疫组化鉴定。取脑微血管内皮细胞按3×107L-1密度接种于铺有盖玻片的6孔板中,2mL/孔,采用Ⅷ因子相关抗原进行鉴定。神经干细胞与脑微血管内皮细胞共同接种于6孔板,接种密度分别为100∶1,10∶1,1∶1,1∶10,1∶100,每种密度均设6孔,以单纯神经干细胞作为对照。培养液为不含胎牛血清的神经干细胞培养液,2mL/孔,每2～3d全量换液,共培养14d,密切观察细胞的生长情况。③实验评估:利用免疫组化法计数神经微管相关蛋白2阳性细胞数,观察神经干细胞定向分化为神经元的情况。结果:①细胞形态观察:神经干细胞聚集成球状,细胞团呈棕黄色,神经球呈悬浮生长,细胞排列紧密;脑微血管内皮细胞呈“鹅卵石样”或“铺路石样”排列生长,细胞呈多角形或扁平梭形,核卵圆形,可见核仁。②神经干细胞与脑微血管内皮细胞鉴定结果:新生神经球巢蛋白免疫组化染色阳性,细胞胞浆深染呈棕黄色,胞核不着色。脑微血管内皮细胞Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色胞浆显示棕黄色或褐色颗粒。③神经微管相关蛋白2免疫化学检测:培养14d与单纯神经干细胞对照组比较,神经干细胞与脑微血管内皮细胞100∶1,10∶1,1∶1,1∶10,1∶100接种密度共培养组神经微管相关蛋白2阳性细胞数均明显升高(19.00±5.12),(34.46±11.57),(72.83±7.54),(60.71±10.45),(43.08±7.46),(31.08±4.60)个,F=35.59,P均<0.05);且共培养组神经干细胞与脑微血管内皮细胞比例为10∶1时升高幅度显著高于其他接种密度(F=29.35,P均<0.05)。结论:脑微血管内皮细胞可以促进神经干细胞向神经元定向分化,神经干细胞与脑微血管内皮细胞为10∶1比例共培养时效果最佳。     

醒脑启智胶囊药物血清对PC12细胞缺糖损伤的保护作用

目的:探讨缺糖对PC12细胞的影响以及醒脑启智胶囊药物血清对其的保护作用。方法:采用血清药理学方法,体外培养PC12细胞,用无糖Earle's液产生缺糖损伤,观察PC12细胞形态学、MTT法细胞活力、乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,LDH)活性的变化。结果:PC12细胞在缺糖作用下有明显的损伤,镜下可见细胞肿胀圆缩,折光性下降,贴壁功能下降,部分细胞裂解成碎片;给予醒脑启智胶囊药物血清均能明显减轻缺糖对PC12细胞形态学变化的影响,表现为细胞折光性较好,细胞碎片形成减少。缺糖损伤后的PC12细胞活力降低0.20±0.03,LDH活性升高犤(1.85±0.23)kU/L,加入醒脑启智胶囊犦血清后,细胞活力明显增高,LDH活性明显降低。结论:醒脑启智胶囊药物血清能明显减轻PC12细胞的缺糖损伤,并呈现一定的剂量依赖关系。     

葛根总黄酮对过氧化氢所致PC12胞氧化损伤的防护

背景：葛根具有防治高血压、心脏病、糖尿病和血液病等多种生物学功效，其提取物对S180肉瘤及Lewis肺癌的增殖有一定抑制作用。目的：观察葛根总黄酮对嗜铬细胞瘤细胞PC12细胞生长的影响和抗过氧化氢所致细胞氧化损伤的防护作用。设计：完全随机分组设计，对照实验。单位：解放军总医院生化科和老年病研究所。材料：葛根购自同仁堂药店，由本实验室用乙醇、乙酸乙酯按常规提取分离提纯葛根总黄酮，用理化方法和薄层色谱进行鉴定，定量测定提取物中葛根素含量为31．79％。四甲基偶氮唑盐（Sigma公司）。鲁米诺购自Sigma公司。抗氧化活性试剂用黄嘌呤氧化酶（Sigma公司）。PC12细胞为解放军总医院老年病研究所惠赠。方法：实验于2001—01／07在解放军总医院老年病研究所完成。①以20g／LDMEM细胞培养液（pH7、1～7.2）培养细胞。将培养细胞按随机抽签法分为2组：葛根总黄酮组和过氧化氢损伤＋葛根总黄酮组，其中每组又根据葛根总黄酮的浓度平行分为5个质量浓度进行观察（0，1．0mg／L，10．100mg／L，1．0g／L），每组平行培养8孔，每孔100mL培养液（细胞数为1&;#215;10^9 L^-1），葛根总黄酮组于37℃条件下，加入葛根总黄酮培养72h；过氧化氢＋葛根总黄酮组：在37℃条件下，加入葛根总黄酮培养48h后，再加入500mmol／L过氧化氢，继续培养24h。②用四甲基偶氮唑盐比色法检测细胞活性；用Gfiess方法测定培养液中亚硝酸盐含量，用次黄嘌呤／黄嘌呤氧化酶测定培养液中的超氧化物歧化酶活性，以观察葛根总黄酮对PCI：细胞生长活性的调控；并外源性加入过氧化氢，观察葛根总黄酮对过氧化氢所致培养PC12细胞氧化损伤的防护作用；结果以抑制率表示[（空白A值-测定A值）／空白A值&;#215;100％]，抑制率越高，说明培养液中清除0f的能力越强。③数据间差异比较采用单因素方差分析。主要观察指标：葛根总黄酮对PC12：细胞培养液中亚硝酸盐含量、超氧化物歧化酶活性、及细胞活性的影响。结果：①葛根总黄酮对PC12细胞活力的影响：1～10mg／L的葛根总黄酮对PC12：细胞的生长无明显影响，100mg／L葛根总黄酮可促进PC12细胞的生长（P〈0．05），当葛根总黄酮在培养液中的浓度增加至1．0g／L时，则表现出明显地抑制细胞生长效能（P〈0．01）。培养液中葛根总黄酮浓度在1～100mg／L内可有效提高过氧化氢损伤组细胞的活力（P〈0．05）。②葛根总黄酮对PC12细胞培养液清除O2^-的影响：葛根总黄酮组和过氧化氢损伤＋葛根总黄酮组清除O2^-的能力均随着葛根总黄酮质量浓度的增加而逐渐升高（除外过氧化氢＋葛根总黄酮组加入葛根总黄酮1mg／L时），具有明显量效关系。两组均在加入100mg／L和1g／L葛根总黄酮时PC12细胞培养液中超氧化物歧化酶活性明显高于未加入葛根总黄酮时（P〈0．05～0．01）。③葛根总黄酮对PC12细胞亚硝酸盐的调控：低浓度（1～100mg／L）的葛根总黄酮使培养细胞亚硝酸盐生成减少，但培养液中葛根总黄酮浓度达1g／L时，亚硝酸盐生成量则增加。结论：①葛根总黄酮对培养的PC12细胞具有一定生长调控作用，低质量浓度（1—100mg／L）时促进细胞生长，高质量浓度（1g／L）时抑制细胞生长，但抗氧化能力最强。②在培养液中加入1～100mg／L的葛根总黄酮对讨氧化氧所致PC12氧化搠伤具有明昂防护效能。     

葛根总黄酮对过氧化氢所致PC12细胞氧化损伤的防护

背景:葛根具有防治高血压、心脏病、糖尿病和血液病等多种生物学功效,其提取物对S180肉瘤及Lewis肺癌的增殖有一定抑制作用。目的:观察葛根总黄酮对嗜铬细胞瘤细胞PC12细胞生长的影响和抗过氧化氢所致细胞氧化损伤的防护作用。设计:完全随机分组设计,对照实验。单位:解放军总医院生化科和老年病研究所。材料:葛根购自同仁堂药店,由本实验室用乙醇、乙酸乙酯按常规提取分离提纯葛根总黄酮,用理化方法和薄层色谱进行鉴定,定量测定提取物中葛根素含量为31.79%。四甲基偶氮唑盐(Sigma公司)。鲁米诺购自Sigma公司。抗氧化活性试剂用黄嘌呤氧化酶(Sigma公司)。PC12细胞为解放军总医院老年病研究所惠赠。方法:实验于2001-01/07在解放军总医院老年病研究所完成。①以20g/LDMEM细胞培养液(pH7.1～7.2)培养细胞。将培养细胞按随机抽签法分为2组:葛根总黄酮组和过氧化氢损伤 葛根总黄酮组,其中每组又根据葛根总黄酮的浓度平行分为5个质量浓度进行观察(0,1.0mg/L,10,100mg/L,1.0g/L),每组平行培养8孔,每孔100mL培养液(细胞数为1×109L-1),葛根总黄酮组于37℃条件下,加入葛根总黄酮培养72h;过氧化氢 葛根总黄酮组:在37℃条件下,加入葛根总黄酮培养48h后,再加入500mmol/L过氧化氢,继续培养24h。②用四甲基偶氮唑盐比色法检测细胞活性;用Griess方法测定培养液中亚硝酸盐含量,用次黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶测定培养液中的超氧化物歧化酶活性,以观察葛根总黄酮对PC12细胞生长活性的调控;并外源性加入过氧化氢,观察葛根总黄酮对过氧化氢所致培养PC12细胞氧化损伤的防护作用;结果以抑制率表示[(空白A值-测定A值)/空白A值×100%],抑制率越高,说明培养液中清除O2-的能力越强。③数据间差异比较采用单因素方差分析。主要观察指标:葛根总黄酮对PC12细胞培养液中亚硝酸盐含量、超氧化物歧化酶活性、及细胞活性的影响。结果:①葛根总黄酮对PC12细胞活力的影响:1～10mg/L的葛根总黄酮对PC12细胞的生长无明显影响,100mg/L葛根总黄酮可促进PC12细胞的生长(P<0.05),当葛根总黄酮在培养液中的浓度增加至1.0g/L时,则表现出明显地抑制细胞生长效能(P<0.01)。培养液中葛根总黄酮浓度在1～100mg/L内可有效提高过氧化氢损伤组细胞的活力(P<0.05)。②葛根总黄酮对PC12细胞培养液清除O2-的影响:葛根总黄酮组和过氧化氢损伤 葛根总黄酮组清除O2-的能力均随着葛根总黄酮质量浓度的增加而逐渐升高(除外过氧化氢 葛根总黄酮组加入葛根总黄酮1mg/L时),具有明显量效关系。两组均在加入100mg/L和1g/L葛根总黄酮时PC12细胞培养液中超氧化物歧化酶活性明显高于未加入葛根总黄酮时(P<0.05～0.01)。③葛根总黄酮对PC12细胞亚硝酸盐的调控:低浓度(1～100mg/L)的葛根总黄酮使培养细胞亚硝酸盐生成减少,但培养液中葛根总黄酮浓度达1g/L时,亚硝酸盐生成量则增加。结论:①葛根总黄酮对培养的PC12细胞具有一定生长调控作用,低质量浓度(1～100mg/L)时促进细胞生长,高质量浓度(1g/L)时抑制细胞生长,但抗氧化能力最强。②在培养液中加入1～100mg/L的葛根总黄酮对过氧化氢所致PC12氧化损伤具有明显防护效能。     

星形神经胶质细胞对PC12神经元突起生长发育的影响

背景星形细胞对神经元有提供营养、支持及调节突触活性作用,但它对神经元发育的影响还尚不清楚.目的探讨体外培养的Sprague Dawley大鼠大脑皮质星形细胞对PC12神经元突起生长发育的作用.设计完全随机设计,对照实验研究.方法以培养的星形细胞与PC12神经元按不同细胞数目比例(501～11)共同培养,并用其制备的条件培养液培养PG12细胞.主要观察指标用快速灵敏的MTT'比色法测定PC12神经元的细胞活力,用光学相差显微镜观察PC12细胞形态学变化.结果①星形细胞条件培养液可增强PG12细胞活力(MTT测定的A值由0.255±0.012提高到0.510±0.036,P＜0.001),却不能促使PC12神经元突起的生出.②当将星形细胞与PC12细胞按301～11的比例共同培养时,既可提高PC12细胞折光性和光晕又可促使其突起的生长;但按501～401的比例共同培养时,只观察到提高PC12细胞折光性和光晕,而无促使其突起生长发育的作用.结论PC12神经元细胞活力的提高与星形细胞分泌到条件培养液中的可溶性因子有关,而PC12神经元突起生长发育可能是和与星形细胞的直接接触以及二者的细胞数目比有关.     

Reactive oxygen species-induced apoptosis in PC12 cells and protective effect of bilobalide

Although clinical studies have demonstrated that EGb 761, a standard extract of Ginkgo biloba, was effective in mild-to-moderate dementia of the Alzheimer's disease patients, the mechanism underlying its neuroprotective effect remains unclear. In this study, effects of bilobalide, the main constituent of the nonflavone fraction of EGb 761, on reactive oxygen species (ROS)-induced apoptosis in PC12 cells was studied. Exposure of cells to xanthine (100 microM)/xanthine oxidase (150 mU/ml) (ROS producer) resulted in a characteristic DNA fragmentation and an increase in the apoptosis rate. When p53, c-Myc, Bcl-2, Bcl-x(L), and Bax were measured by flow cytometry and the activities of caspase-1- and caspase-3-like protease determined with Ac-YVAD-AMC or Ac-DEVD-AMC as substrates, the profile of ROS-induced changes in these apoptosis regulatory and effector proteins suggests that elevation of c-Myc, p53, and Bax and activation of caspase-3 play an important role in the apoptosis. When cells were treated with ROS and bilobalide (25-100 microM) simultaneously, a dose-dependent reduction in the apoptotic rate was found. The percentage of cells with positive staining for c-Myc and p53 decreased from 27.8 and 50.1% to 16.7 and 23.2%, respectively, when bilobalide (25 microM) was present. Bilobalide also reduced ROS-induced elevation of Bax and activation of caspase-3 effectively. Our results provide the first direct evidence that bilobalide can protect neurons against oxidative stress. Bilobalide may block the apoptosis in the early stage and then attenuate the elevation of c-Myc, p53, and Bax and activation of caspase-3 in cells.