流感病毒在MDCK细胞上培养条件的优化分析

摘要:目的　优化甲、乙型流感病毒在MDCK细胞上的培养条件,提高流感病毒的分离效果。方法　将5种流感病毒液（甲型流感病毒:甲型H1N1、季节性H1N1、季节性H3N2和乙型流感病毒:Victoria、Yamagata）分别接种于MDCK细胞,通过比较不同的病毒接种量（30 μl/cm2、60 μl/cm2、90 μl/cm2、120 μl/cm2、150 μl/cm2）、不同的病毒孵育时间（0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h）、不同的TPCK-胰酶添加浓度（1.0 μg/ml、2.0 μg/ml、3.0 μg/ml、4.0 μg/ml、5/0 μg/ml）以及不同的MDCK细胞增毒代次（连续盲传5代）对5种流感病毒易感性的影响,确定其最佳分离效果;对分离后的病毒以红细胞凝集（HA）方法检测病毒滴度,结果　通过对比病毒HA滴度结果,5种流感病毒（甲型H1N1、季节性H1N1、季节性H3N2、Victoria和Yamagata）的最佳病毒接种量分别为:90 μl/cm2、90 μl/cm2、60 μl/cm2、120 μl/cm2、120 μl/cm2;最佳病毒孵育时间:甲型流感病毒为1.0～1.5 h,乙型流感病毒为2.0～2.5 h;胰酶最佳使用浓度分别是:2.0 μg/ml、2.0 μg/ml、2.0 μg/ml、3.0 μg/ml、3.0 μg/ml;最适宜的细胞增毒传代次数为:1代、3代、2代、2代、2代;甲型流感病毒经培养后病毒的HA滴度低于乙型流感,甲型H1N1流感病毒经培养后HA滴度较低。结论　甲型流感病毒对MDCK细胞的易感性低于乙型流感病毒;甲型H1N1流感病毒的分离效果低于季节性H1N1和季节性H3N2;Victoria与Yamagata的分离条件基本相同。     

鱼腥草提取液抗流感、腮腺炎病毒效果观察

为了解中草药鱼腥草抗甲、乙型流感病毒和流行性腮腺炎病毒的效果;将鱼腥的3种提取物分别在体外细胞上进行抗病毒实验。以抑制细胞病变作为实验药物对病毒起作用的判断标准,实验：鱼腥草挥发油对甲,乙型流感病毒和腮腺炎病毒均呈现一定的抑制效果,最低有效浓度（相当于含生药）分别为4．5mg/ml,2.25mg/ml和14mg/ml;鱼腥草乙酸乙酯提取物抑制甲,乙型流感病毒的最低有效浓度分别为3mg/ml和0．75mg/ml,但该提取物对腮腺炎病毒无抑制作用,鱼腥草水提取物对3种实验病毒均不起作用,此结果表明,鱼腥草中含有至少两种以上抗病毒活性因子,且其作用机制可能不同。     

鱼腥草提取液抗流感、腮腺炎病毒效果观察

为了解中草药鱼腥草抗甲、乙型流感病毒和流行性腮腺炎病毒的效果,将鱼腥草的3种提取物分别在体外细胞上进行抗病毒实验.以抑制细胞病变作为实验药物对病毒起作用的判断标准.实验结果:鱼腥草挥发油对甲、乙型流感病毒和腮腺炎病毒均呈现一定的抑制效果,最低有效浓度(相当于含生药)分别为4.5mg/ml、2.25mg/ml和14mg/ml;鱼腥草乙酸乙酯提取物抑制甲、乙型流感病毒的最低有效浓度分别为3mg/ml和0.75mg/ml,但该提取物对腮腺炎病毒无抑制作用.鱼腥草水提取物对3种实验病毒均不起作用.此结果表明,鱼腥草中含有至少两种以上抗病毒活性因子,且其作用机制可能不同.     

液相芯片技术在新冠病毒和流感病毒检测中的应用

目的 建立一种液相芯片检测方法，用于检测新冠病毒和流感病毒。方法 从NCBI数据库分别下载新冠病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒全基因组序列，在保守区域分别设计扩增引物和检测探针，以各病毒标准品质粒为模板，建立多重PCR扩增体系；将核酸探针偶联至荧光编码微球，建立液相芯片检测体系，并对方法进行评价。结果 基于多重PCR和液相芯片技术建立的新冠病毒和流感病毒的检测方法能够同时检测新冠病毒N基因、ORF1ab基因和S基因，甲型流感病毒M基因和乙型流感病毒NS基因及人类看家基因ACTB基因。检测新冠病毒N基因、ORF1ab基因、S基因的灵敏度为1×10⁴拷贝/反应，甲型流感病毒M基因、乙型流感病毒NS基因的灵敏度为1×10³拷贝/反应；可准确检测新冠病毒N基因、ORF1ab基因和S基因，甲型流感病毒M基因和乙型流感病毒NS基因及人类看家基因ACTB基因片段，没有出现相互干扰的现象。结论 建立的方法能同时检测新冠病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒，可作为新冠病毒及流感病毒感染的诊断及流行病学调查的方法。     

RT-PCR对青岛市小学生乙型流感病毒Victoria系暴发的检测

目的分析青岛地区乙型流感暴发的流行病学特征,探讨RT-PCR方法对乙型流感病毒暴发的诊断价值,并对疫情控制措施做出评价。方法采集暴发性疫情流感样病例的咽拭子,采用QIAGEN试剂盒提取病毒RNA,RT-PCR方法分别扩增甲型和乙型流感病毒核酸的特异片段,然后,对核酸检测阳性标本采用狗肾传代细胞(MDCK)细胞培养,红细胞凝集抑制试验对培养的病毒进行鉴定和分型。结果采集的18份咽拭子中15份乙型流感病毒核酸检测呈阳性,但甲型流感病毒未检出;15份乙型流感病毒核酸阳性标本经MDCK细胞培养,9份标本发生细胞病变,经鉴定和分型,毒株均属于乙型流感病毒Victoria系。结论 RT-PCR方法对乙型流感病毒暴发的检测具有快速、敏感和高度特异性的特点,WHO推荐的2008-2009年流感疫苗成分中乙型流感病毒株(B/Florida/4/2006)为Yamagata系,而青岛地区暴发的流感为乙型流感病毒Victoria系,提示在今后决定我国疫苗成分时是否应考虑地区流行的特点。     

甲型流感病毒在MDCK细胞上培养条件的优化

目的优化甲型流感病毒在MDCK细胞上的培养条件,提高甲型流感病毒的分离率和监测效果。方法将三种甲型流感病毒液(甲型H1N1、季节性H1N1、季节性H3N2)分别接种于MDCK细胞,通过比较不同的病毒接种量(25、50、75、100、125和150μl/cm2)、不同的TPCK-胰酶添加浓度(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0和3.5μg/ml)以及不同的MDCK细胞增毒代次(连续盲传四代),对三种甲型流感病毒易感性的影响,确定其最佳分离效果。结果三种甲型流感病毒:甲型H1N1、季节性H1N1、季节性H3N2的最佳病毒接种量分别为:100、75和75μl/cm2;胰酶最佳使用浓度分别为2.5、2.0和2.0μg/ml;最适宜的细胞增毒传代次数为:一代、二代、二代;低代次的MDCK细胞对甲型H1N1流感病毒的易感性高于季节性H1N1和季节性H3N2;甲型H1N1流感在培养后病毒的HA滴度低于季节性H1N1与季节性H3N2。结论甲型H1N1流感病毒在MDCK细胞上的分离效果低于季节性H1N1与季节性H3N2;季节性H1N1流感病毒和季节性H3N2流感病毒的分离条件基本相同。     

一种快速检测甲型流感病毒方法的建立

目的 建立一种用于甲型流感病毒抗原检测的基于胶体金免疫层析法的快速、简便试剂盒。方法 以柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记一种抗甲型流感病毒单克隆抗体。硝酸纤维素膜上包被另一种抗甲型流感病毒单克隆抗体,制成免疫层析试纸。待测样品中的甲型流感病毒首先与胶体金标记抗体结合,然后移动至硝酸纤维素膜上与固定的单克隆抗体发生反应,形成肉眼可见的红色带。结果 本试纸与不同浓度甲型流感病毒培养液均能发生特异性反应,与乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒等16种病原体无交叉反应。用甲型流感病毒培养液不同浓度标本与美国同类产品比较,灵敏度相同。稳定性检测显示42 ℃和37 ℃热破坏放置结果均优于美国同类产品。临床比对结果评价kappa值为0.976,一致性非常高。结论 试纸条灵敏度和特异性能够达到临床使用的要求,并具有简便快速、无需特殊仪器设备等优点,对甲型流感的诊断和流行病学调查具有十分重要的应用价值。     

中药体外防治甲型H1N1流感病毒实验研究

目的研究中药防治流感的体外效果。方法采用鸡红细胞凝集实验以及MTT法观察三种常见的代表性预防流感的方药("扶正"预防类-玉屏风制剂;祛邪预防类-银翘散制剂;外用芳香辟秽类制剂-冰香散)对流感病毒A/FM/1/47(H1N1)鼠肺适应株的预防作用。结果冰香散在最小无毒浓度15.6μg/ml时对流感病毒A/FM/1/47(H1N1)鼠肺适应株有良好的预防作用。银翘散和玉屏风散仅在毒性浓度下对流感有预防作用,无毒浓度下均不能抑制病毒。阳性对照药利巴韦林在0.25～2 mg/ml浓度内均有较好的抑制流感病毒作用。冰香散提前加药,冰香散对病毒的半数抑制浓度(IC50)为5.89μg/ml,治疗指数(TI)为3.28;冰香散与病毒同时加药,冰香散挥发油对流感病毒的直接抑制作用的IC50为9.56μg/ml,TI为2.02。而先加流感病毒吸附后再加冰香散,则未能对流感病毒有抑制作用,其治疗指数TI小于0.05。结论冰香散体外对甲型流感病毒FM1有预防作用。玉屏风散制剂和银翘散制剂仅在毒性浓度下对流感有预防作用,无毒浓度下均不能抑制病毒。其防治流感病毒的作用可能通过体内免疫机制而实现。     

麻杏石甘汤体外抗A型流感病毒作用的实验研究

目的研究麻杏石甘汤体外抗A型流感病毒的作用。方法运用鸡胚培养法和微量血凝试验检测麻杏石甘汤对A型流感病毒增殖的抑制作用;运用细胞培养技术和MTT法检测麻杏石甘汤对A型流感病毒感染的宿主细胞活性的影响。结果在治疗给药和预防给药两种方式中,麻杏石甘汤在250、125mg/ml时对鸡胚中流感病毒的血凝滴度的抑制倍数在4以上。在这两种给药方式中,麻杏石甘汤对A型流感病毒感染的MDCK细胞的治疗指数(TI)分别为2.78、1.71。结论麻杏石甘汤能通过抑制病毒增殖和保护宿主细胞而发挥较强的抗流感病毒作用。     

2357例流感样患儿甲乙型流感病毒检测结果及病毒载量分析

目的分析流感流行季节杭州地区儿童甲乙型流感的流行特征及病毒载量值(copies/ml),为儿童流感诊断治疗提供指导。方法纳入2017年12月-2018年3月就诊于杭州市儿童医院符合流感样病例的患者共2 357例,采集血液进行实验室常规指标检测,同时采用实时荧光定量聚合酶链式反应进行鼻咽拭子标本核酸检测,确诊甲乙型流感病毒类型及其病毒载量。分析高病毒载量与低病毒载量患儿实验室常规指标差异。比较上呼吸道感染与合并下呼吸道感染患儿病毒载量差异。结果共检测到1 026例甲乙型流感阳性病例,阳性率43.36%。其中甲型流感663例(64.62%),乙型流感363例(35.38%),两组中位年龄具有显著性差异(P<0.001)。0～5月龄患儿甲型流感病毒载量最高为(5.25±1.74)log10(copies/ml),随年龄增长病毒载量逐渐下降,不同年龄段病毒载量差异有统计学意义(t=3.748,P=0.011)。乙型流感阳性患儿不同年龄段病毒载量未见统计学差异(t=0.468,P=0.705)。甲流感染患儿高病毒载量组淋巴细胞比例为(28.99±15.23)%低于低病毒载量组的(32.03±18.37)%,比较差异有统计学意义(t=2.318,P=0.021);乙流感染患者高病毒载量组与低病毒载量组之间各常规指标均未见统计学差异。合并下呼吸道感染患儿病毒载量均显著高于上呼吸道感染患儿(P<0.001)。结论本地区本次流感流行期间甲型和乙型流感病毒具有不同的流行病学特征,合并下呼吸道感染患儿具有较高的病毒载量,病毒载量可作为评估流感患儿病情轻重程度的参考指标。     

粗壮女贞提取物抗甲型流感病毒的作用及机制初探

目的 探讨粗壮女贞提取物体外不同作用方式下抗甲型流感病毒的作用及机制。方法 以狗肾上皮（Madin-Darby Canine Kidney,MDCK）细胞建立甲型H1N1流感病毒感染模型,采用粗壮女贞提取物对MDCK细胞最大无毒浓度（0.8mg/ml）进行实验,CCK-8法测定提取物预防式、治疗式和共同式干预下MDCK细胞存活率;荧光定量PCR法、间接免疫荧光法检测预防式干预下细胞内病毒核蛋白（nucleoprotein, NP）基因表达、蛋白定位;荧光法检测病毒神经氨酸酶（neuraminidase, NA）荧光强度;ELISA法测定细胞内炎症因子IL-6、IL-8、IFN-γ、IP-10表达水平。结果 与病毒对照组相比,治疗式、共同式干预下实验组细胞存活率差异无统计学意义（ q =2.658, P >0.05; Z =1.547, P >0.05）;预防式干预下,实验组中细胞存活率上升（ Z = 4.195, P <0.001）,病毒NP多定位于细胞核内,且基因表达下降（ Z =-2.662, P< 0.05）;NA活性降低（ Z =-2.405, P< 0.05）;IL-6（ Z =-2.772, P <0.05）、IL-8（ q =8.493, P <0.001）和IFN-γ（ Z =-2.863, P <0.05）蛋白表达量下降。结论 预防式干预下粗壮女贞提取物具有抗甲型H1N1流感病毒作用,其机制可能与干扰病毒NP功能、抑制NA活性以及减轻炎症反应有关。     

小檗碱对流感病毒感染小鼠免疫功能的影响

目的探究小檗碱对流感病毒感染小鼠免疫功能及炎症反应的调节作用。方法选取60只小鼠分为正常对照组、流感病毒组和小檗碱组,20只/组;除正常对照组外各组使用流感病毒滴鼻制成流感病毒小鼠模型;使用1 mg/ml小檗碱给小鼠灌胃0.4 ml/d。检测肺泡灌洗液中白细胞总数及各类白细胞数;苏木精-伊红(HE)染色观察小鼠肺组织病理改变情况;采用流式法检测辅助性T细胞(Th)1/Th2及Th17/调节性T细胞(Treg)比例;检测血清中白细胞介素(IL)-6、IL-4和肿瘤坏死因子(TNF)-α水平;使用蛋白质免疫印迹法检测视黄酸诱导基因蛋白-1(RIG-1)、线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)及核因子(NF)-κB蛋白表达情况。结果HE染色显示,流感病毒组肺组织炎性细胞增多、肺泡结构被破坏,小檗碱组小鼠炎性细胞数目减少。相比正常对照组,流感病毒组小鼠肺泡灌洗液中白细胞总数及各类白细胞数、Th1/Th2、Th17/Treg、IL-6、TNF-α、RIG-1蛋白、MAVS蛋白及NF-κB蛋白水平均升高,IL-4水平降低(P<0.05);相比流感病毒组,小檗碱组小鼠肺泡灌洗液中白细胞总数及各类白细胞数、Th1/Th2、Th17/Treg、IL-6、TNF-α、RIG-1蛋白、MAVS蛋白及NF-κB蛋白水平均降低,IL-4水平升高(P<0.05)。结论小檗碱可以通过影响RLH信号传导通路的活化,调节T淋巴细胞亚群比例,同时抑制炎症反应来实现抗流感病毒的作用。     

抗病毒1号中药对流感病毒A3的抑制作用

目的了解抗病毒1号单味中草药对流感病毒A3的抑制作用.方法采用细胞培养技术,以病毒唑为阳性对照药,观察抗病毒1号对流感病毒的抑制作用.结果抗病毒1号半数中毒浓度(TC50)为60.53mg·ml     

玉溪市2009年流感监测分析

目的了解玉溪市流感流行动态,揭示玉溪市流感流行及病原学的变化,为更好地做好流感预防控制工作。方法按全国流感监测方案,对暴发疫情和哨点医院采集流感样病例咽拭子标本,用Real-time RT-PCR方法检测。结果 2009年玉溪市流感网络实验室共检测流感样病例标本980份,甲型H1N1核酸阳性143份,阳性率14.59%,甲型H1阳性11份,阳性率1.33%;甲型H3阳性80份,阳性率8.16%;B型核酸阳性6份,阳性率0.61%。结论玉溪市的流感病原,季节性H1、H3、B型和甲型H1N1流感同时存在,但甲型H1N1逐步成为流行的优势毒株。     

Significant circulation of influenza B viruses mismatching the recommended vaccine-lineage in South Korea, 2007–2014

We aimed to characterize the lineages of influenza B viruses obtained from clinical specimens during the 2007–2014 seasons in South Korea. RT-PCR for the partial hemagglutinin gene of influenza B virus was performed on laboratory-confirmed influenza B samples from the 2007–2008 season to 2013–2014 season. A phylogenetic tree was generated, and current influenza vaccine strains for the Northern Hemisphere were used as representative strains of Victoria and Yamagata lineages.A total of 571 influenza B virus sequences were analyzed. During the 2009–2010 season, most of the circulating influenza B viruses matched the vaccine strain; 91.0% (91/100) of viruses belonged to the Victoria lineage. In the 2007–2008, 2011–2012, and 2013–2014 seasons, co-circulation of each influenza B lineage was found with a match ratio to the vaccine strain of 53.2% (42/79), 40.9% (63/154), and 58.3% (134/230), respectively. Overall, 41.7% (238/571) of the circulating influenza B viruses belonged to the lineage mismatching the vaccine strain.During the seven influenza seasons, influenza B epidemics were substantial in four seasons in South Korea. Significant mismatches of the vaccine and lineage of the circulating influenza B viruses were found. The current trivalent influenza vaccine may not be fully suitable for effective protection against influenza B.     

清热五号合剂抗流感病毒作用的研究

目的 探讨中药“清热五号合剂”抑制流感病毒的效果。方法 用MDCK(狗肾细胞)组织培养技术和血凝试验方法。结果 清热五号合剂抑制流感病毒的最低浓度为5mg/ml。结论 清热五号合剂有明显的抑制流感病毒致细胞病变作用,通过血凝试验也证实了该药可以阻断流感病毒在细胞内复制。     

Declining responsiveness to influenza vaccination with progression of human pregnancy

BackgroundInfluenza immunization is universally recommended during pregnancy to protect mothers and their offspring. However, pregnancy-induced shifts in vaccine responsiveness remain poorly defined.MethodsQuantitative and qualitative shifts in the serological response to influenza vaccination were evaluated in healthy women throughout the course of pregnancy. Serum was obtained before and after vaccination among 71 pregnant and 67 non-pregnant women during the 2011–12 and 2012–13 influenza seasons. Serum hemagglutination inhibition (HAI) assay was used to investigate anti-influenza antibody responses by comparing pre-vaccine and post-vaccine geometric mean titers (GMTs) between groups for each antigen. IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4 anti-influenza titers were also evaluated by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Pregnancy induced shifts in HAI titers and levels of each anti-influenza antibody isotype were evaluated using linear regression models.ResultsPost-vaccine GMTs at day 28 were significantly reduced for women vaccinated during pregnancy for A/California (H1N1) in 2011 (p = 0.027), A/Perth (H3N2) in 2011 (p = 0.037), and B/Wisconsin in 2012 (p = 0.039). Vaccine responses progressively declined with the initiation of vaccination later in pregnancy. Anti-H1N1 IgG1, IgG2, and IgG3 titers were reduced in pregnant women compared to non-pregnant controls, and these titers declined with pregnancy progression. The most striking differences were found for anti-H1N1 IgG1, where titers decreased by approximately 7% each week throughout pregnancy.ConclusionsHAI responses elicited by immunization were significantly reduced during pregnancy for three different influenza vaccine antigens. Anti-H1N1 IgG1 was significantly lower in pregnant women and decreased throughout the course of pregnancy. Waning serological responsiveness to influenza vaccination with the progression of human pregnancy has important translational implications for when immunization should be optimally administered during pregnancy.     

上海市浦东地区2007年流感病原学特征分析

[目的]了解上海浦东地区流感病原学特征,为流感防治提供科学依据。[方法]选择浦东2个流感监测点医院,采集类流感病人呼吸道咽拭子,利用病原学、血清学结合流行病学资料进行分析。[结果]2007年采集类流感病人呼吸道咽拭子标本210份,分离到98株流感病毒,总检出率为46.7%。未分离到A(H1N1)亚型。分离到A(H3N2)亚型、B/Y亚型、B/V亚型62、32、4株,分别占总检出数的63.3%、32.6%、4.1%。呈现1—3月和7—9月2个活动高峰。[结论]2007年浦东地区流感病毒优势株亚型不断发生变化,从年初的A(H3N2)优势株亚型逐渐过渡为A(H3N2)亚型与乙型共存,到年末则优势株亚型全部为乙型流感(B/Y,B/V)。流感发病人群在各年龄段均有分布并且与性别无明显相关。     

Onjisaponins, from the root of Polygala tenuifolia Willdenow, as effective adjuvants for nasal influenza and diphtheria-pertussis-tetanus vaccines

Active substances from hot water extracts from 267 different Chinese and Japanese medicinal herbs were screened for mucosal adjuvant activity with influenza HA vaccine in mice. The extract from the root of Polygala tenuifolia was found to contain potent mucosal adjuvant activity. The active substances were purified and identified as onjisaponins A, E, F, and G. When each onjisaponin (10 μg) was intranasally (i.n.) inoculated with influenza vaccine (10 μg) in mice, serum hemagglutination-inhibiting (HI) antibody titers increased 3–14 times over control mice administered vaccine alone after 4 weeks. When each onjisaponin (10 μg) was i.n. inoculated with the vaccine (10 μg) followed by i.n. vaccination of the vaccine alone after 3 weeks, serum HI antibody titers increased 27–50 fold over those mice given i.n. vaccinations without onjisaponins. These same conditions also significantly increased nasal anti-influenza virus IgA antibody titers. Two inoculations with onjisaponin F (1 μg) and influenza HA vaccine (1 μg) at 3 weeks intervals, significantly increased serum HI antibody and nasal anti-influenza virus IgA and IgG antibody titers after only 1 week over mice given HA vaccine alone after the secondary vaccination. Intranasal vaccination with onjisaponin F inhibited proliferation of mouse adapted influenza virus A/PR/8/34 in bronchoalveolar lavages of infected mice. Separate intranasal vaccinations with onjisaponins A, E, F, and G (10 μg) each and diphtheria–pertussis–tetanus (DPT) vaccine (10 μg) of mice followed by i.n. vaccination with DPT vaccine alone after 4 weeks showed significant increases in serum IgG and nasal IgA antibody titers after 2 weeks following secondary vaccination over mice vaccinated with DPT vaccine alone. All onjisaponins showed little hemolytic activity at concentrations up to 100 μg/ml. The results of this study suggest that onjisaponins may provide safe and potent adjuvants for intranasal inoculation of influenza HA and DPT vaccines.