葎草花粉变应原的纯化及免疫特性分析

目的 纯化葎草花粉变应原并分析其免疫学活性.方法 粗制葎草花粉提取液经Sephadex G-75Sephacryl S-200HR层析柱纯化,分段收集各组份.SDS-PAGE检测各组分蛋白相对分子质量,ELISA抑制实验及免疫印迹实验分析各组分蛋白质对特异性IgG和IgE的抑制率及与患者血清的反应率.结果 浓缩粗制葎草花粉提取液经SephadexG-75层析柱纯化,得到两个峰,第一峰富含蛋白质,第二峰含有大量色素,蛋白含量甚微,弃之;收集第一峰及其谷段洗脱液(P液),经Sephacryl S-200HR层析柱纯化,分离出4个组份,即第一峰(P1)、谷段(V)、第二峰(P2)和末段(E).电泳结果显示纯化后的蓓草花粉含20多种蛋白质条带,相对分子质量区带为5.0×103～97.4×103,P1段主要是相对分子质量为43×103～97.4×103的蛋白质,P2段和V段主要是相对分子质量为5.0X103～43×103的蛋白质,E段主要是相对分子质量为5.0×103以下的蛋白质;ELISA抑制实验结果显示P1、V、P2、E对sIgG抑制率分别为68%、70%、95%,5%,对sIgE抑制率分别为25%、64%、71%、11%;免疫印迹实验结果显示P1、V、P2、E与患者血清sIgG的反应率分别为65.63%、78.13%、87.50%、6.25%,与患者血清sIgE的反应率分别为25.00%、71.88%、84.38%、15.63%.结论 葎草花粉舍20多种蛋白质成分,相对分子质量在5×103～43×103之间的蛋白质变应原性和免疫原性均较强,为主要变应原;相对分子质量在43×103～94.7×103的蛋白质免疫原性强而变应原性弱,为次要变应原.     

重组葎草花粉主要变应原免疫特性研究

目的鉴定重组葎草花粉主要变应原pTSX2的免疫特性,并初步评价其安全性。方法应用Western blotting鉴定pTSX2
的免疫特性;ELISA法检测经pTSX2免疫的小鼠血清sIgE、sIgG水平;pTSX2免疫治疗小鼠哮喘模型后：ELISA法测定小鼠血
清sIgE、sIgG水平;计数小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）中细胞总数及嗜酸性粒细胞（Eos）比值;ELISA法检测小鼠BALF中及
脾组织匀浆中细胞因子（IL-4、IFN-γ）水平;评价小鼠肺组织炎症程度。结果Western blotting结果显示重组表达的pTSX2可与
70%的葎草花粉特异性过敏的变应性哮喘患者血清发生抗原抗体反应;pTSX2免疫正常小鼠后主要诱导产生血清sIgG;pTSX2
免疫治疗小鼠哮喘模型后：血清中sIgE、sIgG的抗体水平分别为（146.74±28.57）和（548.76±11.98）μg/ml,与哮喘模型组的
（603.06±10.00）和（260.32±6.40）μg/ml相比差异有统计学意义（P<0.05）;BALF中细胞总数及Eos百分比与哮喘模型组相比明
显下降（P<0.05）;BALF中IL-4、IFN-γ水平分别为（56.74±28.57）和（49.7±11.98）pg/ml,与哮喘模型组的（89.03±10.00）和
（23.10±6.40）pg/ml相比差异有统计学意义（P<0.05）;脾组织匀浆中IL-4、IFN-γ水平分别为（126.24±37.00）和（1547.72±490.43）
pg/ml,与哮喘模型组的（457.95±70.06）和（720.34±93.96）pg/ml相比差异有统计学意义（P<0.05）;肺组织炎症程度减轻。结论
重组葎草花粉主要变应原pTSX2具有较好的免疫治疗作用,且安全性较高,其机制可能是抑制变应原sIgE抗体、诱导变应原
sIgG抗体产生,降低气道炎症细胞浸润,调节Thl/Ih2平衡。
     

藜草花粉过敏性哮喘诊断试验的研究

目的 比较藜草花粉变应原皮肤挑刺试验（ＳＰＴ），支气管激发试验（ＢＰＴ）、血清特异性ＩｇＥ（ｓＩｇＥ）的关系，并评估上述试验对藜草花粉过敏性哮喘的诊断价值。方法 对４０例秋季哮喘发作的病人同时进行以上试验。     

银杏花粉的部分纯化和变应原性,免疫原性分析

Pollens of Ginkgo biloba L. (G.b.l.p) have been found to be a kind of important allergen which causes pollinosis in Chengdu. The goal of this study is to purify G.b.l.p and to determine the allergenicity and immunogenicity of various fractions. Crude extract was purified by gel filtration with Sephadex G25, then G75. Two elution peaks were observed. On SDS-PAGE, the molecular weights of protein of the 1st peak and the valley were 30-42 kd and 13-18kd, respectively, and that of the 2nd peak was less than 13 kd. 40 patients with allergic rhinitis and/or asthma underwent the skin test with crude extract and various fractions of gel filtration; it revealed that the strongest allergenic activity existed in the 1st peak and there was mild allergenic activity in the 2nd peak. The in vitro allergenic activity and immunogenic activity of various fractions were examined by ELISA inhibition test. It was further confirmed that the allergenic activity and immunogenic activity of the 1st peak were the strongest, and those of the 2nd peak were the lowest. It is suggested that diagnosing reagents can be made satisfactorily by partial purification, i.e. discarding the inactive fractions, since allergenicity exists in various fragments. But fractions of allergen with high IgG immunogenicity should be selected to produce immunotherapy agents so as to enhance the production of blocking antibody and thus improve the therapeutic effect.     

银杏花粉的部分纯化和变应原性、免疫原性分析

作者采用层析法对银杏花粉进行部分纯化。将各组分对40例变应性鼻炎或/和哮喘患者进行皮试,结合ELISA抑制试验测试其对特异性IgE和IgG的抑制率,阐明各组分具有不同的变应原活性和免疫原活性。为临床应用提出了初步意见。     

从葎草花粉cDNA表达文库中筛选过敏性哮喘特异性变应原

目的 从葎草花粉cDNA表达文库中筛选过敏性哮喘特异性变应原.方法 应用葎草花粉过敏性哮喘患者血清对自行构建的葎草花粉cDNA λTripIEx2噬菌体表达文库进行免疫学筛选,提取阳性噬菌体DNA,EeoR I和HindⅢ双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定后进行DNA序列测定、重复序列分析和同源性分析.结果 经过3轮筛选,从cDNA表达文库中筛选获得3个葎草花粉特异性变应原cDNA克隆,其序列大小分别为868、550和592 bp.测序结果表明这3个克隆代表3个不同的cDNA序列,重复序列分析未发现重复序列,同源性分析表明与现有的基因均无高度同源性.结论 所获得的与过敏性哮喘相关的3个葎草花粉特异性变应原cDNA克隆可能为新基因,此发现为进一步制备重组变应原疫苗或核酸疫苗打下了良好基础.     

葎草花粉主要变应原Hum s1的表达、纯化与结构预测

目的 克隆、表达、纯化葎草花粉主要变应原Hum s1,预测、分析其蛋白结构及功能,为评估该重组变应原的诊断及治疗效果奠定基础。方法 采用PCR扩增目的基因Hum s1,并将Hum s1通过Kpn Ⅰ/Xho Ⅰ位点克隆到pET32a表达载体,转化到克隆菌株E.coliDH5α,用PCR验证重组载体,并将表达载体转化至表达菌株E.coliBL-21,IPTG诱导表达目标基因,利用快速蛋白液相色谱技术纯化融合蛋白,并对表达蛋白的结构与功能进行预测分析。结果 成功构建原核表达质粒pET32a-G2,并表达纯化葎草花粉主要变应原Hum s1,纯度达90%以上。分析其结构含有3个潜在的抗原表位,2个EF-手型结构域,成功构建其三维模型。ELESA试验证明重组蛋白能与葎草花粉过敏患者血清结合,具有免疫学活性。 结论 成功构建了葎草花粉变应原Hum s1的原核表达载体,表达并纯化了重组蛋白,并通过生物信息学方法获得了目的蛋白的抗原表位和三维结构模型,为进一步开展重组疫苗研究奠定了基础。     

纯化花粉变应原免疫治疗的疗效观察

目的:观察纯化花粉(黄蒿、葎草、藜草花粉)变应原特异性免疫治疗(SIT)的疗效.方法:采取凝胶过滤方法分别提纯上述花粉变应原.采取随机、对照方法将102例确诊为季节性黄蒿、葎草、藜草花粉过敏性哮喘患者分为观察组(A组)及对照组(B组),应用纯化花粉变应原(PPA)及粗花粉变应原(CPA)分别对两组患者进行季节前SIT,疗程3 mo.临床疗效判断标准为显效、好转及无效.临床不良反应观察包括局部或全身皮疹、哮喘加重等.实验观察指标为两组SIT前后的皮肤试验(ID)风团直径、特异性IgE(sIgE)、A值均值.结果进行组内和组间比较.结果:A组SIT总有效率90%(47/52),B组78%(39/50),前者明显高于后者(P<0.05);A组仅3例轻度副反应,B组有13例(26%)出现副反应;A组及B组SIT后ID风团直径、sIgE, A值均值都较SIT前明显下降(P<0.01);A组SIT后上述指标下降程度较B组更明显(P<0.05).结论:PPA及CPA的SIT疗效均较满意,但用PPA进行SIT的安全性和疗效更好.     

藜草花粉特异性致敏哮喘动物模型的制备

目的:建立藜草花粉粗制变应原诱导的小鼠变态反应气管炎症动物模型。方法:制备藜草花粉粗制变应原,将40只BALB/c小鼠,分为:1空白对照组、2低剂量组、3中剂量组、4高剂量组,每组10只。分别通过HE染色观察小鼠肺部炎症和黏液分泌;观察支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞总数和细胞分类;用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测BALF、脾组织匀浆上清的IL-4、IFN-γ和血清抗原特异的IgE、IgG1抗体。结果:随着抗原浓度的升高肺部病理改变呈明显的变态反应炎症;BALF中的细胞总数、巨噬细胞数、EOS计数、IL-4、血清抗原特异性IgE抗体、IgG1抗体也逐步升高并明显高于空白对照组(P<0.05);BALF、脾组织匀浆上清的IFN-γ与空白对照组相比却反而下降(P<0.05)。结论:藜草花粉成功构建小鼠变态反应气道炎症动物模型。     

藜草花粉特异性IgE和特异性IgG测定在哮喘过敏原诊断中的意义

藜草(又名灰菜)是世界性分布的一种杂草类植物,其花粉含量丰富,属风媒花粉,是一种重要的吸入性致敏原[1]。有关藜草花粉过敏性哮喘国内外均有报道,但对其诊断研究甚少。本文对40例夏秋季节发作的外源性哮喘患者进行了血清总IgE,藜草花粉特异性IgE和特异性IgG测定,结合皮肤挑刺试验及支气管激发试验结果,对以上各项体外实验在藜草花粉过敏原诊断中的意义进行了比较和分析。资料和方法　　一、研究对象　　(一)哮喘组　系1995年在我院哮喘专科门诊确诊的患者[2]。男24例,女16例;年龄21～57(36±11)岁。均具有变态反应家族史及3～10年反复发…     

葎草花粉特异性致敏哮喘动物模型的制备

目的 建立葎草花粉粗浸液诱导的小鼠变态反应气管炎症动物模型.方法 制备葎草花粉粗浸液,将40只清洁级雌性BALB/c小鼠按随机数字表法分为4组,每组10只.①空白对照组:PBS+氢氧化铝致敏激发;②低剂量组:100 μg葎草粗浸液+氢氧化铝致敏激发;③中剂量组:200 μg葎草粗浸液+氢氧化铝致敏激发;④高剂量组:300 μg葎草粗浸液+氢氧化铝致敏激发.通过HE染色观察小鼠肺部炎症和黏液分泌,支气管肺泡灌洗液中细胞总数和细胞分类,酶联免疫吸附试验检测BALF,脾组织匀浆上清的IL- 4、IFN-γ和血清抗原特异的抗体验证哮喘动物模型.结果 随着抗原浓度的升高,肺部病理改变呈明显的变态反应炎症;高剂量组小鼠支气管肺泡灌洗液中的细胞总数为(210.75±78.80)×106/L、巨噬细胞数为(48.65±3.27)%、EOS数为(24.37±4.28)%、IL- 4、血清抗原特异性IgE抗体、IgG1抗体明显高于空白对照组(P<0.05);支气管肺泡灌洗液﹑脾组织匀浆上清的IFN-γ较空白对照组下降(P<0.05).结论 葎草花粉成功构建小鼠变态反应气道炎症动物模型.     

霜天蛾昆虫变应原的变应原性及免疫原性分析

目的 分析霜天蛾主要变应原的变应原性和免疫原性,为进一步制备霜天蛾标准化变应原疫苗和基因工程重组霜天蛾昆虫变应原奠定基础.方法 应用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳对霜天蛾变应原蛋白成分进行分离,对9例霜天蛾过敏患者血清分别进行IgE、IgG免疫印记分析,并对比分析IgE、IgG反应变应原成分.结果 霜天蛾提取液经SDS-PAGE染色后显示出20余种蛋白质成分,相对分子质量12 000～128 000.免疫印迹分析结果显示具有变应原性的蛋白相对分子质量及反应率分别为:74 000(88.9%),66 000(22.2%),49 000(22.2%),36 000(77.8%),25 000(33.3%),具有免疫原性的蛋白相对分子质量及反应率分别为:79 000(33.3%),74 000(66.7%),66 000(22.2%),49 000(22.2%),36 000(44.4%),25 000(55.6%).结论 霜天蛾变应原中具有较强变应原活性的蛋白质相对分子质量为74000和36000,具有较强免疫原活性的蛋白质相对分子质量为74 000和25 000的蛋白质,是霜天蛾过敏患者特异性过敏诊断和治疗的主要成分.     

花粉症的发病特点与大气花粉种属和浓度的关系

目的 调查分析花粉症患者的发病特点以及发病时间与大气花粉浓度的相关关系.方法分析14 426例变应性鼻炎患者皮肤点刺试验结果和患者发病特征,监测每年3至9月北京地区花粉浓度,分析花粉症患者发病时间与花粉播散浓度的相关关系.结果① 14 426例皮肤点刺试验阳性的变应性鼻炎患者中花粉症患者8 127例,平均占55.9%;②花粉症患者患病年龄主要集中在15~18岁以及31~40岁.③ 花粉症患者每年的发病时间与花粉浓度有明显相关.结论 花粉变应原是引起变应性鼻炎的重要变应原;花粉症患者每年的发病时间与花粉浓度显著相关,这样的相关关系为花粉症的发病预报奠定基础.     

悬铃木属花粉的纯化及免疫活性分析

目的对悬铃木属花粉变应原进行初步纯化并对其主要成分进行免疫学活性分析。方法悬铃木属花粉变应原粗制浸液经过凝胶过滤层析，收集主要蛋白质，SDS-PAGE检测各段蛋白质分子量，并用免疫印记法分析7例悬铃木属花粉过敏的支气管哮喘患者血清。结果悬铃木属花粉变应原粗制液经层析柱洗脱得两个洗脱峰，第一峰及第二峰升段富含蛋白，而第二峰降段蛋白含量甚微，收集各段进行SDS—PAGE。出现6条蛋白区带，分子量分别为7、50、35、39、22和16kd。第一峰主要含22-71kd蛋白质，峰2升段以14-16kd之蛋白质为主。对7例花粉过敏的支气管哮喘患者血清免疫印记分析可见4条sIgG反应带，蛋白分子量为50、39、22和16kd，病人血清结合百分比分别为100％、28．57％、57．14％和14．29％。结论悬铃木属花粉变应原含有6种主要蛋白成分，第一峰的50、39和22kd的蛋白质为主要致敏组分，第二峰升段的16kd蛋白质为次要致原。     

二球悬铃木花粉主要变应原蛋白编码基因克隆的制备

目的:构建含二球悬铃木花粉主要变应原蛋白编码基因的重组质粒。方法:用PCR扩增二球悬铃木花粉主要变应原编码基因的cDNA序列,将扩增的目的片段用双酶切法与质粒pET32a连接,CaCl2法转入工程菌DH5α制备基因克隆。碱裂解法提取质粒DNA,测序鉴定目的片段存在。结果:构建了含二球悬铃木花粉主要变应原编码基因的重组质粒。结论:用天然二球悬铃木花粉可成功地制备含有其主要变应原编码基因的重组质粒,用于变应原蛋白诱导表达。     

A study on pollen allergens in China

Objective Allergic disease caused by airborne pollen is a major health problem in China. Intensive study on pollen allergens can be of great help for preventing and treating pollinosis. Four aspects of the study on pollen allergens in China including major allergic pollen in our country, analysis and purification of pollen allergen composition, recombinant pollen allergens and clinical application of pollen allergens are described in this paper.