磁性载药微球联合反义寡核苷酸对人胰腺癌裸鼠模型的疗效观察

目的 探讨辐射促细胞转染的多药耐药(multidrug resistance,MDR)基因mdr1反义寡核苷酸(ASON)联合5-氟尿嘧啶磁性载药微球(PEG-5-FU-MAMS)治疗裸鼠人胰腺癌的效果.方法 通过构建裸鼠人胰腺癌耐药肿瘤模型基础上,肿瘤局部以2 Gy60 Coγ辐射,瘤内注射阳性脂质体介导的mdr1反义寡核苷酸(ASON),经磁导下利用磁性载药微球(PEG-5-MAMS)联合化疗.结果 联合辐射组与未联合辐射组及对照组肿瘤生长曲线肿瘤生长曲线差异有显著性(P<0.01).联合组能显著抑制肿瘤的生长,联合组肿瘤重量抑制率为85.00%,肿瘤体积抑制率为87.74%.结论 辐射促转染的mdr1ASON联合磁性载药微球对肿瘤细胞具有较好的耐药逆转作用.     

反义MDR寡核苷酸联合化疗药物抑制耐药肿瘤细胞

目的：探讨反义MDR核酸技术联合化疗对耐药肿瘤细胞的生长抑制作用。方法：选用人耐药肿瘤细胞KBv200，插入417bp的反义MDR mRNA片段，构建反义MDR载体，并转染KBv200，形成稳定表达的反义MDRmRNA的KBv200细胞株，加入化疗药物VCR，HCPT并与正义MDR mRNA KBv200及KBv200对比，经MTT，流式细胞仪PI染色法，荧光显微镜HT染色法及Annexin V检测其抑制率及凋亡率。结果：反义MDRmRNA应用VCR，HCPT后与正义组及对照组相比，抑制率和凋亡率均有明显升高。结论：反义MDR寡核苷酸联合化疗药物能有效抑制耐药肿瘤细胞生长，体外实验中证实了基因治疗可逆转肿瘤细胞对VCR，HCPT等化疗药物的多药耐药性。     

人肺腺癌细胞多药耐药逆转的反义策略

目的：探讨反义策略（反义核酸和Ribozyme)对肺腺癌细胞多药耐药的逆转效果。方法：分别以mdrl cDNA-9- 6和mdrl mRNA 880位点的GUC为靶位点,通过脂质体介导将相应的反义核酸（ATC CAT CCC GAC CTC）和anti-mdrl mdrl Ribozyme表达质粒DNA（pHβApr-1 neo/mdrl-Rb)导入肺腺癌耐药细胞株A549／R,分别采用RT－PC,流式细胞仪,罗丹明试验及MTT方法观察细胞的mdrl mRNA,Pgp表达,罗丹明的聚集和对阿霉素的敏感性的变化。结果;经反义核酸和anti-mdrl mdrl Ribozyme处理的细胞mdrl mRNA,Pgp明显降低,细胞内罗丹明聚集,对阿霉素的敏感性分析提高20倍和180倍,结论：反义核酸和anti-mdrl mdrl Ribozyme具有强大的逆转肺癌MDR的作用,其作用水平在mRNA或DNA水平,使Pgp的表达受到强烈抑制,显示了良好的应用情景。     

反义技术逆转多药耐药的现状与展望

多药耐药(multidrug resistance，MDR)是指肿瘤细胞对一种化疗药物产生耐药的同时，对其他结构和作用机制不同的化疗药物也产生交叉耐药的现象，是导致化疗失败的主要原因。因此，如何逆转，特别是在基因水平逆转MDR，已是肿瘤研究的热点。近年来，反义技术(antisense approach)逆转MDR     

Survivin反义寡核苷酸对卵巢癌耐药细胞COC1/DDP抑制的实验研究

背景与目的: Survivin是近年发现的一种细胞凋亡抑制基因, 它与卵巢癌细胞的生长及耐药性密切相关,本研究探讨经脂质体介导的 survivin反义寡核苷酸 (Lip-ASODN)对人卵巢癌耐药细胞 COC1/DDP生长、凋亡及细胞周期的影响.方法:将脂质体介导的 survivin-ASODN转染 COC1/DDP细胞;细胞动力学检测、 MTT法观察细胞生长情况; RT-PCR检测 survivin mRNA的表达;通过 Western杂交检测 caspase-3蛋白及活性;流式细胞仪分析细胞凋亡率及细胞周期变化.结果:与空脂质体及 SODN组相比,经 survivin-ASODN作用后的 COC1/DDP细胞的生长受到明显抑制, 72 h的细胞生长抑制率可达( 68.3± 6.2)%( P< 0.05). Survivin mRNA的表达明显下降,而 caspase-3的活性增加,并呈时间依赖性. ASODN组细胞周期发生了明显变化,细胞被阻滞于 G0/G1期,占 79.21%, G2/M及 S期分别为 4.92%、 15.87%,均明显下降;细胞凋亡率为 33.18%,明显高于 SODN组及空脂质体组( P< 0.05).结论: Survivin ASODN能抑制人卵巢癌耐药细胞 COC1/DDP生长,降低 survivin mRNA的表达并诱导 COC1/DDP细胞凋亡.     

反义MRP3寡核苷酸对卵巢癌拓普替康耐药性的逆转作用

目的:探讨MRP3反义寡核苷酸对人卵巢癌拓普替康(TPT)耐药株SKOV3/TPT细胞的耐药逆转作用。方法:人工合成MRP3反义寡核苷酸(ASODN)及相应的正义寡核苷酸(SODN)片段,用脂质体(LF)构建成ASODN/LF、SODN/LF,分别转染SKOV3/TPT细胞,用MTT法、流式细胞仪(FCM)及半定量RT-PCR检测体外转染后细胞内TPT的荧光强度、耐药指数及MRP3mRNA表达的改变。结果:将MRP3反义及正义寡核苷酸片段分别转染进SKOV3/TPT细胞后,反义组细胞内TPT的荧光强度及耐药指数明显降低(P<0.05),细胞内MRP3mRNA的表达较未转染细胞下降了60.16%(P<0.05);正义组上述指标无明显变化。结论:转染MRP3ASODN/LF可部分逆转MRP3介导的人卵巢癌细胞对TPT耐药。     

单独及联合转染survivin和bcl-2反义寡核苷酸诱导胆囊癌细胞凋亡的研究

目的:探讨单独及联合转染survivin、bcl-2反义寡核苷酸(AsODN)对胆囊癌细胞系GBC-SD的凋亡促进作用.方法:设计并合成特异性靶向survivin及bcl-2的AsODN.免疫组织化学法观察胆囊癌细胞中Survivin及Bcl-2蛋白的表达情况;实验分为4组:空白对照组、survivin AsODN转染组、bcl-2 AsODN转染组、联合survivin及bcl-2 AsODN转染组.转染24 h 后,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测survivin基因表达的变化,电镜下观察细胞形态变化,流式细胞仪技术检测细胞凋亡率,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测AsODN对细胞的生长抑制率.结果:Survivin及Bcl-2蛋白在胆囊癌细胞中均有较高表达;单独及联合转染survivin及bcl-2 AsODN后,胆囊癌细胞内survivin基因mRNA表达下调47.8%;,电镜下胆囊癌细胞呈典型凋亡样改变;凋亡率分别为11.38%±3.91%(survivin AsODN组)、9.26%±4.15%(bcl-2 AsODN组)、28.45%±6.34%(联合转染组);分别与对照组相比差异有显著性(P＜0.01),而联合转染组同单独转染survivin AsODN组及bcl-2 AsODN组相比差异也有显著性(P＜0.05).各转染组相对于空白对照组的AsODN抑制率分别为54.3%,47.6%,76.5%.结论:Survivin及Bcl-2蛋白在胆囊癌细胞中呈高表达,单独及联合转染survivin和bcl-2反义寡核苷酸可促进胆囊癌细胞凋亡,而联合转染更具显著性.     

survivin 反义寡核苷酸逆转顺铂诱导的人肺腺癌细胞凋亡耐受作用

 目的 探讨survivin反义寡核苷酸逆转人肺腺癌细胞对顺铂诱导的细胞凋亡耐受的效应。方法 1.常规体外培养A549/CDDP细胞,以脂质体包裹的survivin反义寡核苷酸（ASODN）体外转染细胞。2.采用二苯胺反应法（DPA）测定DNA片段化、激酶法检测Caspase-3酶活性及流式细胞术检测细胞凋亡率（AI）,评价细胞凋亡程度。3.采用MTT法测定细胞存活率和生长抑制率,计算半效抑制浓度（IC50）及耐药倍数（RI）。结果 1.单用ASODN转染组DNA片段化比率、细胞凋亡率和Caspase-3相对活性分别增高至（43.55±6.07）%、（34.03±2.25）%和1.1298±0.2502,和各对照组相比较,均有显著性变化（P〈0.01）;而ASODN和CDDP联用组上述凋亡指标增高更为明显,分别达（76.73±2.04）%、（65.85±5.47）%和1.6805±0.2758（P〈0.05）。2.转染组A549/CDDP细胞生长抑制显著,单用转染组和联合CDDP组生长抑制率分别增高达59.3%和83.7%（P〈0.05）。3.ASODN转染后CDDP对细胞IC50由（225.03±10.59）μmol/L减低至（158.84±4.256）μmol/L,其RI由11.9减为8.39。结论 survivin反义寡核苷酸体外转染可降低耐顺铂人肺腺癌细胞的凋亡阈值,从而较大程度上逆转其对顺铂诱导的细胞凋亡耐受。     

c-myc反义寡核苷酸对卵巢癌细胞COC1/DDP顺铂耐药的逆转作用

目的：探讨c-myc反义寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotide,ASODN）逆转人卵巢癌细胞顺铂（cisplatin,又称DDP）耐药的可行性。方法：以卵巢癌DDP耐药细胞株COC1/DDP为研究对象,实验组以脂质体为载体分别将c-myc ASODN、c-myc正义寡核苷酸（sense oligodeoxynucleotide,SODN）转染到COC1/DDP细胞内,阴性对照组细胞以同体积的培养液转染。采用计数法检测转染细胞增殖变化,MTT法检测DDP对细胞增殖的抑制率,RT-PCR、免疫组织化学技术分别检测转染细胞及c-myc ASODN治疗后裸鼠移植瘤c-myc mRNA及蛋白的表达,研究c-myc ASODN逆转癌细胞耐药及降低肿瘤恶性表型和成瘤能力的作用。结果：实验组转染ASODN后COC1/DDP细胞增殖被抑制;对DDP的敏感性提高,细胞生长抑制率增高,与SODN组及阴性对照组比较,差异均有统计学意义（P〈0.05）。ASODN转染后COC1/DDP细胞的c-myc mRNA和蛋白表达均明显降低,与相同浓度SODN转染组、阴性对照组的COC1/DDP细胞比较,差异均有统计学意义（P〈0.05）。裸鼠腹水瘤模型中ASODN＋DDP治疗组与单纯DDP治疗组及SODN＋DDP治疗组相比较,腹水少、腹腔内瘤块少且体积小、移植瘤中c-myc mRNA和蛋白的表达均明显降低。结论：体外、体内实验中c-myc ASODN均能有效地逆转卵巢癌细胞DDP耐药性,c-myc反义寡核苷酸可望成为一种有效的卵巢癌治疗方法。     

反义寡核苷酸-萘二酰亚胺偶联物对多药耐药性肿瘤细胞的抑制作用

目的：针对人表皮癌细胞阿霉素耐药株（KB－A－1）的多药耐药性问题,探讨天然反义寡核苷酸与寡核苷酸－萘二酰亚胺偶联物对多药耐工 肿瘤细胞的抑制作用及mdr1基因表达的影响,方法：利用S－烷基化反应成功地合成了反义寡核苷酸－萘二酰亚胺偶联物,并通过MTT法和ELISA法测定天然反义寡核苷酸与寡核苷酸－萘二酰亚胺偶联物对多药耐药物性肿瘤细胞的抑制作用。结果：作用靶点不同的反义寡核苷酸对KB－A－1细胞生长的抑制能力不同。针对mdr1基因翻译起始区的寡核苷酸片段1－4对KB－A－1细胞细胞生长的抑制率分别为13．34％、14．32％、26．00％和25．37％,其中片段3的效果最好（P＜0．01）。与单独使用反义寡核苷酸相比较,萘二酰亚胺对寡核苷酸的共价修饰 提高了反义寡核苷酸对KB－A－1细胞生长的抑制。凝胶电泳实验结果也表明萘二酰亚胺对寡核苷酸的化学修饰能提高寡核苷酸抵逆解的能力。寡核苷酸及寡核苷酸－萘二酰亚胺偶联物专一性地抑制KB－1－A细胞生长,而对非多药耐药性的KB－3－1细胞株无明显影响,是由于寡核苷酸及寡核苷酸－萘二酰亚胺偶联物选择性地抑制mdr1基因表达所致。ELISA法检测结果表明寡核苷酸寡核苷酸－萘二酰亚胺偶联物可使KB－A－1细胞膜表面的mdr1基因表达产物P-gp量降低,并且寡核苷酸－萘二酰亚胺偶联物P－gp表达的程度比天然片段强烈。结论：反义寡核苷酸可专一性地抑制mdr1基因表达,使多药耐性肿瘤细胞生长受到抑制。寡核苷酸与萘二酰亚胺共价偶联能提高天然反义寡核苷酸抑制多药耐性及抵抗核酸酶降解的能力。     

反义LRP寡核苷酸对卵巢癌多药耐药细胞系OVCAR-3顺铂耐药性的影响

目的:探讨针对肺耐药基因(LRP gene)设计的反义寡核苷酸(AsODN)对人卵巢癌多药耐药细胞系OVCAR-3顺铂(DDP)耐药性的逆转作用.方法:采用罗丹明B(SRB)显色法检测LRP AsODN和DDP细胞毒性作用;采用脂质体(1iplfectamine 2000)介导LRP AsODN转染人卵巢癌多药耐药细胞系OVCAR-3;采用逆转录酶链式反应(RT-PCR)和Westem blot法检测LRP AsODN转染前后OVCAR-3细胞中LRP的表达:采用流式细胞仪测定OVCAR-3细胞在顺铂作用后的凋亡率.结果:LRP AsODN浓度低于800nmol/L时,对OVCAR-3细胞无明显细胞毒作用;LRP AsODN能明显减少OVCAR-3细胞中LRP mRNA和蛋白的表达,增加其顺铂敏感性,且与剂量呈正相关;转染LRP AsODN前后的OVCAR-3细胞在DDP作用后,凋亡率分别为(15.43±1.14)%和(27.43±2.05)%,两者间差异有显著性意义(p=0.001).结论:LRP AsODN能有效阻断OVCAR-3细胞内LRP的表达,恢复细胞对DDP的敏感性.     

Non-P-glycoprotein-mediated Atypical Multidrug Resistance in a Human Bladder Cancer Cell Line

A human bladder cancer cell line resistant to adriamycin (ADM), T24/ADM9 has been established in vitro by exposing T24 parent cells to progressively higher concentrations of the drug over a period of 12 months. The T24/ADM9 cells were found to be 9 times more resistant to ADM than the T24 parent, and showed various degrees of cross-resistance to an ADM derivative, vinca alkaloids and a DNA topoisomerase II (Topo ID-targeting agent, etoposide. No significant difference was observed in the cellular accumulation of ADM between the T24/ADM9 and T24 parent cells. A Northern blot analysis showed an overexpression of multidrug resistance-associated protein (MRP) mRNA, but no overexpression of multidrug resistance-1 (MDR1) mRNA was observed in the T24/ADM9 cells. A flow cytometric analysis showed that the MDR1 gene product, P-glycoprotein (Pgp), is not expressed on the T24/ADM9 cells. T24/ADM9 showed approximately the parental level of DNA Topo II catalytic activity. In Western blot and Northern blot analyses, however, the cellular level of DNA topo II was apparently much lower in T24/ADM9 than in the T24 parent. Thus, these results suggest that a decreased cellular level of DNA Topo II and an overexpression of MRP gene may be responsible for the expression of an MDR phenotype in the T24/ADM9 cells and that such non-Pgp-mediated, atypical MDR may develop in bladder cancer treated with chemotherapy including ADM.     

Reversal of P-Glycoprotein-mediated Paclitaxel Resistance by New Synthetic Isoprenoids in Human Bladder Cancer Cell Line

We isolated a paclitaxel‐resistant cell line (KK47/TX30) from a human bladder cancer cell line (KK47/WT) in order to investigate the mechanism of and reversal agents for paclitaxel resistance. KK47/TX30 cells exhibited 700‐fold resistance to paclitaxel and cross‐resistance to vinca alkaloids and topoisomerase II inhibitors. Tubulin polymerization assay showed no significant difference in the ratio of polymerized α‐ and β‐tubulin between KK47/WT and KK47/TX30 cells. Western blot analysis demonstrated overexpression of P‐glycoprotein (P‐gp) and lung resistance‐related protein (LRP) in KK47/TX30 cells. Drug accumulation and efflux studies showed that the decreased paclitaxel accumulation in KK47/TX30 cells was due to enhanced paclitaxel efflux. Cell survival assay revealed that verapamil and cepharanthine, conventional P‐gp modulators, could completely overcome paclitaxel resistance. To investigate whether new synthetic isoprenoids could overcome paclitaxel resistance, we synthesized 31 isoprenoids based on the structure of N‐solanesyl‐N, N′‐bis(3,4‐dimethoxybenzyl)ethylenediamine (SDB), which could reverse multidrug resistance (MDR), as shown previously. Among those examined, trans‐N, N′‐bis(3,4‐dimethoxybenzyl)‐.N‐solanesyl‐l,2‐diaminocyclohexane (N‐5228) could completely reverse paclitaxel resistance in KK47/TX30 cells. N‐5228 inhibited photoaffinity labeling of P‐gp by [³H]azidopine, suggesting that N‐5228 could bind to P‐gp directly and could be a substrate of P‐gp. Next, we investigated structural features of these 31 isoprenoids in order to determine the structural requirements for the reversal of P‐gp‐mediated paclitaxel resistance, suggesting that the following structural features are important for overcoming paclitaxel resistance: (1) a basic structure of 8 to 10 isoprene units, (2) a cyclohexane ring or benzene ring within the framework, (3) two cationic sites in close proximity to each other, and (4) a benzyl group with 3, 4‐dimethoxy functionalities, which have moderate electron‐donating ability. These findings may provide valuable information for the development of P‐gp‐mediated MDR‐reversing agents.     

甲基莲心碱对耐长春新碱人胃癌细胞多药耐药性逆转机制的初步研究

目的探讨新的钙阻断剂甲基莲心碱(Nef)对耐长春新碱人胃癌细胞多药耐药性(MDR)的逆转作用及其机制。方法采用MTT比色法,检测药物的细胞毒作用;应用免疫细胞化学SP法及流式细胞术,检测Nef对人胃癌细胞Bcl-2蛋白表达的影响。结果 10μmol/L Nef对SGC7901及SGC7901/VCR无显著细胞毒作用;2.5、5、10μmol/L Nef能使VCR对SGC7901/VCR细胞的IC50从2.32μg/ml依次下降至0.340、0.128、0.053μg/ml,逆转倍数分别为6.8、18.1、43.8。当Nef浓度为10μmol/L时,逆转SGC7901/VCR多药耐药活性较VRP高(P<0.01);SGC7901/VCR细胞中Bcl-2蛋白表达水平较SGC7901细胞高,经Nef处理后,SGC7901/VCR细胞中Bcl-2蛋白表达水平明显下降,表明Nef能下调SGC7901/VCR细胞中Bcl-2蛋白表达水平。结论甲基莲心碱在体外能逆转耐长春新碱人胃癌细胞(SGC7901/VCR)的多药耐药性,其机制可能与下调Bcl-2蛋白表达水平有关。     

汉防己甲素逆转白血病细胞株K562/ADM多药耐药性机制研究

目的 研究汉防己甲素(TTD)对慢性粒细胞白血病急性变白血病细胞株K562／ADM多药耐药(MDR)逆转的机理。方法 采用流式细胞仪检测细胞内化疗药物的浓度及细胞表面P糖蛋白(P-gp)的表达；荧光定量PCR法检测MDR1 mRNA；通过流式细胞仪检测Anexin—V判断凋亡细胞的数量。结果 10μmol/L的TTD处理K562／ADM细胞后，细胞内阿霉素(ADM)的浓度明显提高；K562／ADM细胞MDR1 mRNA／P-gp的表达下降；TTD能增强ADM致细胞凋亡的作用。结论 汉防己甲素的耐药逆转机制除了下调MDR1 mRNA／P-gp的表达引起细胞内抗癌药物的积聚外，增加抗癌药物致细胞凋亡也是耐药逆转的重要原因。．     

Multidrug Resistance Phenotype in the RMS-GR Human Rhabdomyosarcoma Cell Line Obtained after Polychemotherapy

Classical cytotoxic treatment of rhabdomyosarcoma (RMS), the most common soft tissue malignancy in children, is often accompanied by significant morbidity and poor response. Chemotherapy may induce multidrug resistance (MDR) associated with the expression of P-glycoprotein, a drug efflux pump which modifies the sensitivity of tumoral cells to drugs. To analyze MDR in RMS we used the RMS-GR cell line, obtained from an embryonal rhabdomyosarcoma treated in vivo with polychemotherapy. The RMS-GR cells showed cross-resistance to vincristine, doxorubicin and actinomycin D, the drugs of choice in the conventional treatment of RMS. Polymerase chain reaction (PCR) analysis showed that these RMS cells overexpressed mdr1 /P-glycoprotein. The pattern of resistance and the level of P-glycoprotein expression were similar to those found in the resistant RMS TE.32.7.DAC cell line obtained in vitro . Southern blot analysis showed that mdr1 overexpression was not due to amplification of the gene. Our results showed that the in vivo treatment of embryonal RMS may induce an MDR phenotype mediated by mdr1 /P-glycoprotein in RMS cells.     

阿帕替尼逆转P-gp转运体介导的乳腺癌化疗多药耐药性的作用及其机制

目的 探讨阿帕替尼对人乳腺癌化疗多药耐药性的逆转作用及其机制。方法 不同浓度的阿帕替尼作用于体外培养的人乳腺癌MCF-7及MCF-7/ADR细胞48 h,MTT法检测阿帕替尼对两种细胞的细胞毒性;低毒浓度的阿帕替尼与化疗药物紫杉醇及阿霉素联用,探讨阿帕替尼对两种细胞化疗耐药性的影响;采用流式细胞术检测阿帕替尼对罗丹明123在MCF-7及MCF-7/ADR细胞内蓄积的影响;采用Pgp-Glo? Assay Systems试剂盒观察阿帕替尼对多药耐药相关蛋白P-gp的ATPase活性的影响;采用Western blot法检测阿帕替尼对P-gp表达及AKT磷酸化的影响。结果 阿帕替尼可浓度依赖性地逆转乳腺癌MCF-7/ADR细胞对紫杉醇及阿霉素的多药耐药性（P<0.05）、增加罗丹明123在MCF-7/ADR细胞内的蓄积（P<0.05）及激活P-gp转运体的ATPase活性（P<0.05）,而对P-gp的表达没有影响;此外,阿帕替尼不改变AKT的磷酸化水平。结论 阿帕替尼可能通过抑制P-gp转运体的外排功能逆转P-gp转运体介导的乳腺癌化疗多药耐药性。     

载体表达小干扰RNA逆转卵巢癌的多药耐药

目的:探讨载体表达的小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)逆转卵巢癌细胞多药耐药的可行性。方法:浓度梯度诱导法建立人卵巢癌阿霉素耐药细胞株OVCAR/AR;脂质体介导将MDR1特异性siRNA的表达载体(pSN/mdr1a和pSN/mdr1b)转染OVCAR/AR细胞;实时定量RT-PCR检测MDRlmRNA的表达;流式细胞术检测P-gp的表达,罗丹明试验检测P-gp的药物转运功能;MTT法检测OVCAR/AR细胞对化疗药的抵抗性。结果:转染pSN/mdr1a和pSN/mdr1b后,OVCAR/AR细胞的MDR1mRNA和P-gp的表达均显著下降,P-gp的转运功能减少,OVCAR/AR细胞对阿霉素、泰素的耐药性逆转。结论:载体表达的siRNA可持久有效地抑制卵巢癌耐药细胞MDR1mRNA和P-gp的表达,并逆转其多药耐药。