TA-SOD融合蛋白表达载体的构建

目的:构建pET28a-TAT-SOD原核表达载体,纯化并测定其活性.方法:PCR法扩增TAT-SOD片段,插入载体pET28a后得到pET28a-TAT-SOD重组表达子,转化人肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导TAT-SOD融合蛋白表达.表达产物用SDS-PAGE电泳鉴定,组氨酸亲和层析柱纯化融合蛋白,利用SOD活性测定试剂盒测定其活性.结果:构建了高表达重组子pET28a-TAT-SOD,获得了相对分子质量约为25 000的具有活性的融合蛋白TAT-SOD,纯度达90%.纯化的蛋白浓度为700 mg/L,活性为197.54 U/L.结论:成功构建了具有活性TAT-SOD融合蛋白的表达载体.     

TAT-EGFP融合蛋白的表达及在PC12细胞的转导活性

目的:构建pET28a-TAT-EGFP重组子,观察表达的融合蛋白TAT-EGFP在细胞内的转导活性.方法:人工合成编码TAT蛋白转导区的DNA片段,插入载体pET28a后再连接EGFP基因,组成pET28a-TAT-EGFP重组表达子.转化大肠杆菌,IPTG诱导TAT-EGFP融合蛋白表达,组氨酸亲和层析柱纯化.将融合蛋白加入培养的PC12细胞,观察荧光进入细胞的情况.结果:成功地构建了高表达pET28a-TAT-EGFP重组子,纯化了分子质量约为29 ku的融合蛋白TAT-EGFP,并在体外培养的PC12细胞中证实TAT-EGFP融合蛋白穿透生物膜的能力.结论:通过对TAT-EGFP融合蛋白的表达纯化及活性分析,证实了TAT的蛋白转导作用,为肽类及生物大分子药物进入组织细胞内发挥治疗作用提供了理论基础.     

促红细胞生成素载体的构建、分离纯化及其活性检测

目的 为了进一步考察促红细胞生成素(EPO)的组织保护作用,构建了高效表达人源性EPO (rhEPO)的原核表达载体,并通过小鼠体内实验考察了其捉红细胞生成活性.方法 构建原核表逸载俸pET30b(+)-rhEPO;转化至大肠杆菌BL21(DE3),获得高效表达重组转化子菌株;Ni-NAT亲和层析纯化融合蛋白;利用网织红细胞指数考察融合蛋白在小鼠体内的促红细胞活性.结果 成功构建pET30b(+)-rhEPO重组子;实现了在原核生物中的表达;纯化后的融合蛋白达到了电泳级纯;其相对分子质量与理论值相符,原核表达的融合蛋白能够显著提高小鼠体内网织红细胞数,可溶性融合蛋白和包涵体蛋白比活性分别是应用化学科1 059.63、727.94 U/mg.结论 构建和表达重组载体pET30b(+)-rhEPO,表达的目的蛋白经分离纯化后具有体内生物学活性,为进一步的功能研究奠定基础.     

TAT-EGFP融合蛋白表达载体的构建及表达

目的:构建TAT-EGFP原核表达载体,在E.coli BL21中高效表达并纯化.方法:人工合成编码TAT蛋白转导区的DNA片段,插入载体pET28a后得到pET28a-TAT重组质粒,再连接绿色荧光蛋白(EGFP)基因,组成pET28a-TAT-EGFP重组表达子.转化大肠杆菌,IPTG诱导TAT-EGFP融合蛋白表达.表达产物用十二烷基硫钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,组氨酸亲和层析柱纯化融合蛋白.结果及结论:成功地构建了TAT-EGFP融合蛋白的原核表达载体,在诱导后获得了高效表达并纯化,为进一步研究TAT的蛋白转导作用奠定了基础.     

PTD-Foxp3融合蛋白的表达、纯化及其生物学功能初步研究

目的:构建带HIV-1 TAT转录因子的穿膜序列(Protein transduction domain,PTD)的pET28a-PTD-Foxp3原核表达载体,表达纯化PTD-Foxp3融合蛋白,并研究其生物学作用.方法:利用基因重组技术构建pET28a-PTD-Foxp3融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌Rosetta(DE3)中表达融合蛋白,经Ni2 分离柱纯化pET28a-PTD-Foxp3融合蛋白.流式细胞术检测融合蛋白穿越细胞膜进入小鼠T淋巴细胞瘤株EL-4细胞中的能力,并通过混合淋巴细胞反应初步分析融合蛋白抑制T细胞活化增殖的生物学作用.结果:成功地构建了pET28a-PTD-Foxp3融合蛋白表达载体,表达并纯化了pET28a-PTD-Foxp3融合蛋白.通过流式细胞术分析证实pET28a-PTD-Foxp3融合蛋白能有效地进入细胞内;同时经混合淋巴细胞反应证明该融合蛋白能明显抑制T细胞的活化增殖能力.结论:成功表达具有生物学活性的PTD-Foxp3融合蛋白,为进一步研究PTD-Foxp3融合蛋白免疫抑制功能和构建表达人PTD-Foxp3融合蛋白,最终应用于临床疾病的治疗奠定了基础.     

乙脑病毒 E蛋白的原核表达、纯化及初步鉴定

目的:构建乙脑病毒(JEV)E蛋白重组载体并在原核细胞BL21(DE3)中表达. 方法:采用RT-PCR扩增片段,定向克隆入pET28a( )中;重组载体pET28a-6His-E转化BL21(DE3),通过酶切、SDS-PAGE和Western Blotting检测其载体构建和蛋白表达;表达产物包涵体经Ni-NTA亲和层析纯化. 结果:构建得到原核融合重组载体pET28a-6His-E;诱导后表达得到6His-E融合蛋白,纯化得到表达产物并进行了初步的鉴定. 结论:表达并纯化得到JEV E蛋白原核表达产物.     

人可溶性CD40L表达及其生物学活性初步分析

目的将已构建好的重组表达质粒pET28a -sCD40L进行优化条件表达,并将其目的蛋白纯化,对目的蛋白进行初步的活性分析.方法利用已构建好的重组表达质粒pET28a -sCD40L进行目的蛋白的表达,优化表达的条件,利用Western-blot鉴定目的蛋白,在最适条件下进行目的蛋白的表达,利用Ni2 -NTA柱纯化目的蛋白,MTT法检测重组蛋白对人外周血淋巴细胞增殖活性的影响.结果利用 Ni2 -NTA柱将目的蛋白进行了分离纯化,且纯化的重组蛋白具有刺激人外周血淋巴细胞的增殖.结论成功优化了重组表达质粒pET28a -sCD40L的表达条件,生物学活性的初步分析显示Ni2 -NTA柱纯化的重组蛋白具有刺激人外周血淋巴细胞增殖活性.     

颗粒溶素的表达纯化及生物学活性分析

目的:采用原核表达系统对颗粒溶素(granulysin,GNLY)进行体外表达,纯化及活性鉴定.方法:以体外培养的人外周血单个核细胞(PBMC)为模板,RT-PCR扩增编码GNLY的cDNA片段,插入pMD-18-T 载体,测序正确后再亚克隆到质粒pET28a( ) 中,构建重组表达质粒pET28a( )-GNLY,转化大肠杆菌BL21(DE3) plysS,IPTG诱导表达融合蛋白,包涵体经变复性后用Ni亲和层析纯化,CFU法测定蛋白活性.结果:成功地将GNLY cDNA片段插入载体pET28a( )中,构建了表达质粒pET28a( )-GNLY.经诱导在原核表达系统中以包涵体形式高效表达了相对分子质量为9 000的融合蛋白,变复性纯化后的GNLY蛋白经CFU法检测,发现其具有细胞毒活性且细胞毒作用具有剂量依赖性.结论:本实验利用原核表达系统成功地表达了具有生物学活性的GNLY,为研究其功能、作用机制及临床应用奠定了基础.     

人源胸腺素α原和白介素2融合蛋白的基因克隆与原核表达

目的克隆人胸腺素α原/白介素2融合基因,构建其原核表达载体并在大肠杆菌系统中有效表达。方法采用RT-PCR方法,从人白血病细胞和人T淋巴细胞中分别扩增得到胸腺素α原/白介素2基因,利用基因重组技术将融合基因片段重组于pET42a原核表达载体上,构建成pET42a-PI。经酶切、测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌Rosseta,IPTG诱导蛋白表达。表达产物经离子交换和分子筛纯化后进行Western blot分析,通过人外周血单核细胞玫瑰花结实验对融合蛋白进行了初步的活性测定。结果凝胶电泳显示PCR产物的长度约750 bp,测序结果表明,扩增片段与预期序列一致。重组菌在IPTG诱导下表达相对分子质量为28 kDa的蛋白,纯化后的融合蛋白能提高人外周血单核细胞玫瑰花结形成率,表明具有一定活性。结论成功克隆和构建了人胸腺素α原/白介素2融合基因的原核表达载体,并在原核表达系统中得到有效表达。     

人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶hAPE1融合蛋白的构建、纯化及其功能的初步研究

目的 构建人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶(hAEP1)原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化融合蛋白,对其活性进行初步分析.方法 用PCR法扩增hAEP1基因,克隆入pET28a载体中,获得重组质粒pET28a-hAPE1.将重组质粒转化入E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达并鉴定.用His亲和层析技术进行蛋白纯化,得到hAPE1融合蛋白.用Western blot及电泳迁移率变动分析实验分析hAPE1融合蛋白的抗原性及活性.结果 所构建的重组质粒pET28-hAPE1经双酶切及DNA测序鉴定表明构建正确.IPTG诱导表达后,经SDS-PAGE及Western blot鉴定均在预期位置出现阳性条带,His亲和层析纯化后得到hAPE1融合蛋白经SDS-PAGE及Western blot鉴定正确.Western blot及电泳迁移率变动分析实验证明hAPE1融合蛋白具有抗原性、AP修复及氧化还原活性.结论 成功构建了人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶的原核表达载体pET28a-hAPE1,并在E. coli BL21(DE3)中高效表达和纯化得到有抗原性及活性的hAPE1融合蛋白.     

人TAT-Survivin融合蛋白原核表达载体的构建

目的:构建人TAT-Survivin融合蛋白原核表达载体。方法:以人胸腺细胞瘤cDNA为模板,采用RT-PCR扩增survivin基因成熟蛋白编码的全部序列,克隆入原核表达载体pET28a(+)中,经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因。结果:PCR扩增的特异性片段长度为462bp,以此构建的重组质粒pET28a-TAT-survivin,经HindIII和BamHI双酶切后显示5.9kb和462bp左右的两条片段,测序结果与Genbank中的人survivin基因cDNA(Genbank序列号)序列一致。证明人survivin已成功克隆到了原核细胞表达载体pET28a(+)中。结论:成功构建了pET28a-TAT-survivin重组原核表达载体。     

HSP-沙眼衣原体MOMP T细胞表位基因的重组、原核表达和蛋白质纯化

目的：构建热休克蛋白65（HSP65）与沙眼衣原体（C.trachomatis,Ct）主要外膜蛋白（MOMP）T细胞表位（简称ctm1）融合蛋白（简称H-ctm1）的原核表达载体,并将其表达及纯化。方法：用PCR技术获得HSP65基因和ctm1基因,并分别将其克隆入pMD18-T载体,采用酶切与连接的方法从pMD18-T载体上获得HSP65基因片段,并将其克隆入pET28a表达质粒,再用相同的方法将ctm1基因连接于HSP65基因片段的下游,从而完成H-ctm1的基因重组。用IPTG诱导转化H-ctm1表达载体的大肠杆菌,以镍金属螯合亲和层析法纯化融合蛋白质。结果：构建了HSP65与ctm1的表达载体pET28a-H-ctm1,DNA序列测定结果表明构建正确。以镍金属螯合亲和层析获得纯度为98%的融合蛋白质。结论：用分子克隆技术正确构建HSP65与Ct MOMP T细胞表位融合蛋白的表达载体,并成功表达与纯化出具有生物活性的融合蛋白。     

人单链白细胞介素12的原核表达和生物学活性鉴定

目的构建含人单链白细胞介素12(hscIL-12)基因的原核表达载体,在大肠杆菌中表达具有活性的hscIL-12。方法 PCR法从质粒pCA13-hscIL-12中扩增hscIL-12基因,经酶切、连接构建原核表达载体pET28a(+)-hscIL-12,转入到大肠杆菌BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,收集菌液进行蛋白质印迹分析,经镍柱亲和层析(Ni2+-NTA)纯化,体外增殖实验检测其生物学活性。结果 PCR扩增、双酶切及DNA序列测定证实pET28a(+)载体上成功插入了hscIL-12基因片段。表达产物经SDS-PAGE电泳分析,证明其相对分子质量为70×103;蛋白质印记表明重组蛋白具有hscIL-12抗原活性;表达产物纯化、复性后进行体外生物学活性实验表明,该重组蛋白能刺激外周血单核细胞(PBMC)产生IFN-γ。结论 pET28a(+)-hscIL-12原核表达载体的构建和重组hscIL-12蛋白的制备为进一步研究hscIL-12生物学功能和临床应用奠定了基础。     

甲型流感病毒FM1非结构蛋白(NS1)在大肠杆菌表达及其ELISA检测方法建立

目的:构建流感病毒FM1非结构蛋白NS1全长基因表达载体在大肠杆菌(E.coli)中表达,并将表达蛋白用于病毒感染和疫苗免疫小鼠的血清检测.方法:提取流感病毒鸡胚尿囊液RNA,RT-PCR扩增NS1全长基因,克隆到pET28a,转化E.coliBL21感受态细胞,经酶切鉴定及序列分析,筛选出阳性重组质粒pET28-NS1.异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白,表达蛋白在变性条件下经镍柱亲和层析纯化,并用Western blot法检测其抗原活性.以纯化的NS1蛋白为抗原建立了检测NS1抗体的ELISA(NS1-ELISA)方法分别对7、15和30天灭活疫苗免疫和病毒感染小鼠血清进行检测.统计分析各组吸光度(A)差异,并以灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值等指标对NS1-ELISA进行方法学评价.结果:重组质粒经PCR及酶切鉴定为阳性,核酸序列分析正确.SDS-PAGE和Western blot结果显示表达重组蛋白分子质量约为26 ku.NS1-ELISA法在第15～30天,感染组血清吸光度明显高于疫苗免疫组.结论:成功获得了NSl重组基因表达蛋白,建立的NS1-ELISA法可用于病毒感染和疫苗免疫血清的鉴别检测.     

间日疟原虫MSP1-19基因的克隆与表达

目的:构建间日疟原虫MSP1-19(Plasmodium vivax merozoite surface protein-1-19,Pv MSP1-19)基因克隆及表达的载体.方法:将MSP1-19基因克隆入原核表达载体pET28a中,构建重组表达载体.以重组载体转化大肠埃希菌BL21,在IPTG诱导下表达重组Pv M...     

幽门螺杆菌UreB基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的:为了研制口服幽门螺杆菌疫苗,构建表达幽门螺杆菌的保护性抗原成分UreB蛋白的基因工程菌株.方法:用PCR方法扩增UreB基因片段,将其克隆至pET28a质粒上,转化E.coli BL21(DE3),经IPlG诱导表达,得到rUreB蛋白.结果:经测序,UreB基因片段由1710bp组成,编码569个氨基酸残基.与GenBank报道的脲酶核苷酸序列同源性最高为97%,氨基酸同源性为99%.经SDS-PAGE检测表明,rUreB基因表达的蛋白质相对分子质量约为6.4 kDa,含量占细菌总蛋白的29.5%.经Ni2 柱亲和层析、GSH复性后,rUreB表现了脲酶活性,活性为32.5 U/mg.结论:表达产物确为幽门螺杆菌脲酶B亚基,这为研制幽门螺杆菌口服疫苗打下了基础.     

人TAT—Survivin融合蛋白原核表达载体的构建

目的：构建人TAT—Survivin融合蛋白原核表达载体。方法：以人胸腺细胞瘤cDNA为模板,采用RT--PCR扩增survivin基因成熟蛋白编码的全部序列,克隆入原核表达载体pET28a（＋）中,经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因。结果：PCR扩增的特异性片段长度为462bp,以此构建的重组质粒pET28a—TAT—survivin,经HindIII和BamHI双酶切后显示5．9kb和462bp左右的两条片段,测序结果与Genbank中的人survivin基因cDNA（Genbank序列号）序列一致。证明人survivin已成功克隆到了原核细胞表达载体pET28a（＋）中。结论：成功构建了pET28a—TAT—survivin重组原核表达载体。     

人细小病毒B19 XA株VP1蛋白原核表达及初步鉴定

目的:通过DNA 重组技术,构建B19 病毒XA株VP1全长基因表达载体, 诱导重组VP1融合蛋白表达. 方法:自B19病毒感染患者血清中提取病毒DNA为模板,用PCR法扩增编码VP1蛋白的全长基因片段,以pET28(a)为表达载体,构建重组表达质粒pET28(a)-VP1,转化E. coli. BL21(DE3),获得重组工程菌株.经IPTG诱导培养获得高效表达的VP1融合蛋白,SDS-PAGE、免疫印迹鉴定表达产物;并以该重组融合蛋白为抗原,免疫家兔,ELISA法检测所获抗体效价. 结果:①获得了含重组表达质粒pET28(a)-VP1的正相阳性工程菌株,经IPTG诱导能高效表达VP1融合蛋白.②经ELISA法检测抗VP1多克隆抗体效价为1: 12 800. 结论:重组工程菌可表达VP1融合蛋白,且该蛋白具有良好的免疫原性,对诊断试剂制备及疫苗研制具有重要意义.