一种简化的分离与培养小鼠原代肝细胞的方法

目的 建立一种简单的能获得高纯度小鼠原代肝细胞的分离与培养方法。方法 将经典的两步灌流法简化为经下腔静脉逆向脉冲式灌注,利用低速离心法对肝细胞分离液进行纯化;利用锥虫蓝染色法鉴定细胞活率;培养瓶预先用鼠尾胶原铺备,利用倒置显微镜观察细胞形态。结果 此法得到了足够数量的肝细胞,细胞活率大于90%;细胞可稳定贴壁1周。结论 成功建立了一种简单的分离与培养小鼠原代肝细胞的方法。     

小鼠子宫内膜基质细胞分离培养及鉴定

目的寻求一种简便有效的早孕小鼠子宫内膜基质细胞的培养方法。方法采用胰蛋白酶消化与机械振荡相结合分离小鼠子宫内膜基质细胞,接种后通过光镜观察其形态学特征,并采用免疫细胞化学进行细胞鉴定。结果接种24h后大部分细胞已贴壁,培养3d后细胞排列紧密、形态为长梭形。经过免疫细胞化学鉴定,成功获得了小鼠子宫内膜基质细胞。结论胰蛋白酶消化与机械振荡相结合可成功分离并原代培养小鼠子宫内膜基质细胞。     

高活力原代小鼠肝细胞的分离与纯化

目的建立一种稳定的能获得高活力和高纯度原代小鼠肝细胞的分离和纯化方法。方法对传统的两步原位胶原酶灌注法进行4个方面的优化,主要包括选择逆向灌流、将持续灌注法改为间断灌注后夹闭门静脉法、严格控制胶原酶消化时间和将分离的肝细胞悬液进行低速Percoll单密度离心纯化。分离后的肝细胞进行体外培养。肝细胞活力和得率用台盼蓝染色法检测。结果新鲜分离的小鼠原代肝细胞活力能稳定达到87%±3%,平均活细胞总数为8×105每克小鼠体重,绝大部分细胞在体外培养2h后贴壁生长。结论优化后的肝细胞分离方法更为稳定、有效,分离到的肝细胞具有高活力的优点。     

小鼠肝细胞的分离与原代培养

目的：探求一种简易、经济的小鼠原代肝细胞的分离与培养方法。方法：采用非灌注法分离小鼠肝脏,利用0.2%Ⅳ型胶原酶对肝脏消化来获取肝细胞,以DMEM培养基对肝细胞进行单层培养。结果：比较成功地进行了原代肝细胞培养,并进行了形态学观察。结论：此方法适合一般实验室开展小鼠原代肝细胞的分离与培养,为进一步的实验研究提供了基础。     

胰蛋白酶和胶原酶灌注法分离提取小鼠原代肝细胞的比较

目的：胰蛋白酶和胶原酶灌注法分离提取小鼠原代肝细胞的比较。方法：改良Seglen两步灌注法,选用胰蛋白酶和胶原酶D分别对同批生长的10～16周C57BL/6J雄性小鼠进行在体灌注分离肝实质细胞,比较分离肝细胞的存活率、纯度、形态、活性、获取数量等。结果：两种方法分离得到的小鼠原代肝细胞的存活率和纯度均达到90%以上,且在形态学上无明显差异,不同培养时间的细胞活性基本一致。胶原酶灌注法所得到的细胞数量多于胰蛋白酶灌注法。结论：胰蛋白酶和胶原酶灌注法均适用于分离提取小鼠原代肝细胞,可根据实验条件选择不同的灌注方法。     

长爪沙鼠肝细胞体外分离培养体系的建立

目的：建立长爪沙鼠原代肝细胞分离培养体系。方法：以雄性长爪沙鼠肝细胞为供体,采用组织消化法和Seglen两步灌流法分离肝细胞,以台盼蓝染色检测细胞得率和活率,PAS法鉴定肝细胞,倒置显微镜观察肝细胞形态变化,并使用含有多种细胞因子的培养基维持培养。结果：组织消化法和Seglen两步灌流法平均每只长爪沙鼠肝脏分离获得肝细胞分别为(1.33?.34)?07个、(3.97?.15)?07个,细胞活率分别为(29.4?.05)%、(80.3?.56)%,这两种方法在细胞得率及活率方面存在显著差异。肝细胞内因有大量的糖原颗粒,经PAS法染色后被染成红色。结果表明肝细胞在贴壁后72h内,肝细胞形态发生显著变化。结论：采用胶原酶经肝门静脉灌流分离肝细胞是一种高效获得肝细胞的方法。各种细胞因子有利于维持肝细胞在体外的生长分化,长爪沙鼠原代肝细胞分离培养体系的建立将为肝脏相关疾病研究和防治药物的开发提供技术支持。     

分离日本血吸虫感染小鼠模型肝星状细胞的改良方法

目的提供适用于日本血吸虫感染小鼠模型活化后肝星状细胞分离的新方法,并确定最适宜的密度分离液浓度。方法构建日本血吸虫感染BALB/c小鼠模型,对小鼠模型分别进行经下腔静脉逆行灌注和门静脉顺行灌注,充分完全消化小鼠肝脏,获得肝脏细胞悬液。利用Optiprep密度梯度离心法逐步纯化获得活化的原代肝星状细胞。通过流式分选法和Real-time PCR验证实验结果,统计分析通过不同浓度分离液密度获得的肝星状细胞数量和纯度。结果当分离液密度分别为13.5%、15.0%、16.5%和18.0%时,富集到的肝星状细胞数量依次升高,肝星状细胞的纯度分别可达56.1%、90.3%、75.9%和71.1%。比较流式分选法得到的细胞与本实验得到的原代肝星状细胞纯度,二者间差异无统计学意义(P0.05)。结论改良后的实验方法可在日本血吸虫感染小鼠模型中高产量地分离出活化的高纯度原代肝星状细胞,且更加经济便捷、实验结果稳定。     

人胚肝细胞分离培养研究

目的　探讨体外优化培养人胚肝细胞的方法。方法　采用胰蛋白酶和聚乙烯吡咯烷酮(pvp) ,胶原酶,胶原酶和pvp消化法分离人胚肝细胞,并比较3种方法对分离人胚肝细胞的效果。结果　运用这三种方法均能成功地培养出原代肝细胞,并能够传代;但胶原酶和pvp消化法分离细胞效果最好,细胞贴壁生长能力强。三种消化方法其细胞存活率从高到低依次为胶原酶和pvp消化法、胶原酶消化法、胰蛋白酶和pvp消化法。结论　人胚肝细胞的分离首选胶原酶和pvp消化法,使用该法在体外培养的人胚肝细胞生长良好,可用于肝细胞移植和生物人工肝等方面的研究。     

改良的小鼠原代肝细胞分离纯化方法

目的:建立一种简便、经济、高效的小鼠肝细胞分离和纯化方法。方法:对传统的两步原位胶原酶灌流法进行改进,缩短消化时间和改变灌注方式;分离的小鼠肝细胞,采用低速离心(300 r/min,1min,3～5次)纯化,台盼兰染色检测活率,糖原染色鉴定肝细胞,并与单密度梯度离心纯化法进行比较。结果:原代肝细胞经低速离心纯化后,活率达到90%左右,纯度达95%以上,与密度梯度离心法效果相近。结论:建立了一种新的小鼠原代肝细胞的分离纯化方法。     

一种新的小胶质细胞分离纯化方法

目的 建立一种高效率的原代小胶质细胞体外分离纯化方法.方法 以McCarthy等经典的小胶质细胞原代培养培养方法为基础,并进行改进,使用低浓度胰酶消化法帮助小胶质细胞从混合培养的胶质细胞分离下来,用OX42抗体免疫组化染色鉴定.结果 获得了高纯度的小胶质细胞.结论 低浓度胰酶消化法分离小胶质细胞与经典的振摇分离法所获得的纯度相当,但提高了细胞的分离效率.     

大鼠股动脉血管原代内皮细胞的分离与培养

目的 体外分离、培养并鉴定大鼠股动脉血管原代内皮细胞,为相对较小血管来源的原代内皮细胞功能研究提供细胞模型.方法 无菌取大鼠股动脉血管,胶原酶消化大鼠股动脉血管内皮细胞使其分离,流式细胞术检测内皮细胞纯度;流式分选出CD31阳性细胞,并用激光共聚焦鉴定内皮细胞;以CCK-8法、高内涵细胞成像法检测内皮细胞增殖能力,以Transwell法、Matrigel胶法检测其迁移和成管功能.结果 胶原酶消化分离所得股动脉血管原代内皮细胞在14～16 d细胞覆盖培养瓶面积的2/3以上,细胞呈现典型铺路石状.流式检测其纯度为38.34％,分选后利用CD31进行荧光染色鉴定,细胞均为CD31阳性;PGE2可显著上调CD31阳性内皮细胞增殖、迁移、成管功能.结论 该研究采用简便的方法成功分离得到股动脉血管原代内皮细胞,为研究相对较小血管来源的原代内皮细胞功能提供体外细胞模型.     

经心脏逆行置管灌注法在小鼠原代肝细胞分离中的应用

目的 观察采用经心脏逆行置管灌注肝脏的方法分离小鼠原代肝细胞的效果。方法 对传统的分离原代肝细胞方法(Seglen两步胶原酶灌注法)进行改良,即从小鼠右心房的裂口处经肝上下腔静脉向下方置管,并以输液器滴注含体积分数10%胎牛血清的胶原酶灌注液进行肝脏灌注。评价此法与传统方法的置管成功率及所得肝原代细胞的数量及活力。结果 改良组总的置管操作成功率高达95%,且在一次置管成功率上改良组高于传统组（94.7% vs. 68.8%,P<0.05）。改良组小鼠肝脏灌注均匀,肝细胞产量高达1.07×106/g小鼠体质量,细胞活力平均为92.16%,两者均高于传统组（分别为0.99×106/g小鼠体质量及86.44%,P<0.05或P＜0.01）。结论 经心脏逆行置管灌注法分离小鼠原代肝细胞简便易学,重复性高,且能保证分离所得的肝细胞产量和质量。     

人肝细胞,窦状间隙内皮细胞的分离,培养

从创伤意外死亡的病人中获取肝组织，应用离体胶原酶Ⅳ灌注和消化的方法获得肝组织细胞悬液。根据差速离心将肝细胞和其它细胞进行分离，并根据枯否氏细胞和内皮细胞贴附时间的不同，分离出肝窦间隙内皮细胞，其存活率可达９０％以上。肝细胞纯度可达９５％。肝窦间隙内皮细胞经一周培养纯度可达９０％以上。同时描述了人肝组织中肝细胞和肝窦间隙内皮细胞原代培养过程的形态特征，并对肝窦间隙内皮细胞进行了鉴定。     

小鼠成体心脏干细胞的分离和鉴定

目的：建立稳定的心脏干细胞提取方法,为进一步研究心脏干细胞生物学特性及临床应用奠定基础。方法通过机械法剪碎组织,利用胶原酶Ⅱ消化后过细胞筛,再经流式细胞术根据细胞表面标志以及免疫荧光染色法进行鉴定,无菌分选得到细胞,体外培养。结果通过酶消化过筛法获得单细胞悬液,经流式细胞术细胞表面标志鉴定出Lin-CD45-Sca-1+细胞,无菌分选获得高纯度细胞可进行体外培养。结论本实验建立的小鼠成体心脏干细胞提取方法,可获得足够量的Lin-CD45-Sca-1+细胞用于实验研究,为心脏疾病的干细胞治疗提供技术支持。     

新生小鼠肝细胞的体外培养

目的：探讨体外培养新生小鼠肝细胞的方法。方法：采用肝组织块外植培养和肝组织块胶原酶消化法培养新生小鼠肝细胞，并比较两种方法，结果：运用这两种方法成功地培养出原代肝细胞，并能够传代，光镜证实培养细胞为肝细胞，结论：这两种方法为广泛开展肝细胞培养奠定了基础。     

受体相互作用蛋白140在小鼠原代小胶质细胞中的表达分析

目的:分离、纯化和原代培养小鼠的小胶质细胞并检测该细胞中受体相互作用蛋白140(RIPl40)的表达模式.方法:以McCarthy等的经典培养方法为基础进行小鼠小胶质细胞的分离,以不换液营养缺失法、机械振摇法纯化和培养小鼠小胶质细胞;用CD11b(MAC-1)对分离的小鼠小胶质细胞进行鉴定;采用实时-聚合酶链反应和western免疫印迹法检测RIP140 mRNA和蛋白质在小鼠原代小胶质细胞中的表达模式:用免疫细胞化学确定RIP140在小胶质细胞中的定位表达模式.结果:成功对小鼠小胶质细胞进行了分离、纯化和培养;mRNA和蛋白表达分析显示,RIP140在小鼠原代小胶质细胞中确有表达,免疫组化结果提示RIP140主要在小鼠小胶质细胞的细胞核中表达.结论:利用McCarthy经典改良方法可成功分离纯化出高纯度小鼠原代小胶质细胞;小鼠原代小胶质细胞确实表达RIP140,以细胞核表达为主.     

大鼠睾丸的Sertoli细胞的分离纯化及体外培养

目的 为了深入研究大鼠睾丸支持细胞(Sertoli细胞)的作用及其调控因素,分离纯化大鼠睾丸Sertoli细胞并进行体外培养.方法 利用多重酶消化法,获取睾丸Sertoli细胞,进行体外原代培养以维持其良好的活性.结果 利用多重酶消化法,可以获得较高纯度的Sertoli细胞,并进行体外原代培养,最终获得大量活性良好的Sertoli细胞.结论 采用多重酶消化法和体外原代培养可以分离纯化并保持良好活性的大鼠睾丸Sertoli细胞.     

Isolation and cultivation of porcine hepatocytes for extracorporeal artificial liver support system

目的　开发从屠宰器官进行高活性猪肝细胞规模分离的优化程序。方法　采用部分肝叶逆行灌注、机械及组酶肝消化并经密度梯度离心获取高产量、高纯度肝实质性细胞。结果　部分肝叶经消化可获取 1 39× 10 9肝细胞的平均产量 (9 9× 10 6肝细胞 /克组织 )及 92 5 %的平均细胞存活率。经组合性dispase/胶原酶的消化处理肝细胞的收获量及存活率明显增加。对细胞灌流及分离液进行氧化处理能阻止泡状细胞的发生。分离的猪肝细胞经原代培养其活性及机能保持着与鼠肝细胞一致的水平 ,且随时间的推移而减退。结论　通过我们改良的方法可收获高产量成年猪肝细胞 ,并保持良好的活性与分化机能。因此 ,成年猪肝细胞被证实是人工肝脏辅助支持系统中生物组的一个很有价值的肝细胞来源。     

高效分离屠宰成年猪肝细胞用于生物人工肝方法的建立

【目的】探讨氧合dispase及胶原酶组酶消化法从屠宰成年猪肝脏高效分离肝细胞的方法及分离肝细胞的生物活性。【方法】部分肝叶逆行灌注、氧合组酶dispase及胶原酶消化、密度梯度离心法分离、纯化肝细胞 ,并对其生物活性进行检测。【结果】肝组织细胞的收获量达10× 10 6 个 / g ,细胞平均存活率可达 92 5 % ,且无泡状变性的发生 ,原代培养生物活性与原代培养鼠肝细胞一致 ,随时间的延长而减退。【结论】氧合组酶dispase及胶原酶消化、密浓度梯度离心法自屠宰成年猪分离肝细胞产量高、且保持着良好的生物活性 ,可作为生物人工肝的理想肝细胞源用于肝脏终末性疾患的治疗。     

兔软骨细胞的体外分离、培养及鉴定

目的探讨体外软骨细胞的分离培养方法。方法采用机械-双酶消化法对兔软骨组织进行消化,以获得软骨细胞,经过体外培养传代后,通过观察显微形态学、细胞增殖生长曲线及Ⅱ型胶原蛋白免疫组织化学染色对软骨细胞进行鉴定。结果成功建立体外培养兔软骨细胞的培养体系。显微镜显示原代培养的软骨细胞呈多角形或三角形贴壁生长,传代5次后出现"纤维样分化"。物理形态及免疫组织化学染色显示5代以内的细胞可以保持稳定的生物学特征。结论本研究建立的软骨细胞分离方法简单、方便。