恒温扩增技术在分子诊断中的应用

聚合酶链反应(PCR)技术是近年来广泛应用于科学研究和临床检验的一项技术。目前传统的PCR技术中核酸的扩增存在效率不高且需要专用的仪器设备等缺陷,而恒温扩增技术由于引物种类多样,检测方法多变,从而克服了传统PCR核酸扩增技术的缺点,使其越来越多地被应用于分子诊断中。经国内外学者的研究证实,恒温扩增技术有着广泛的应用前景,现着重对恒温扩增技术予以综述。     

滚环扩增原理及其在医药领域的应用

滚环扩增(rolling circle amplification,RCA)是新近发展起来的一种恒温核酸扩增方法。这种方法不仅可以直接扩增DNA和RNA,还可以实现对靶核酸的信号放大,灵敏度达到一个拷贝的核酸分子,因此在核酸检测中具有很大的应用价值和潜力。本文结合了滚环扩增技术在医药领域中的最新研究进展,介绍了滚环扩增的原理及其在医药领域中的应用。     

等温扩增技术在疟原虫及巴贝虫检测中的应用

近年来,等温扩增技术（isothermal amplification technology）凭借恒温条件下对核酸高效率扩增的优势在病原体检测领域展现出了巨大的潜力。疟疾与巴贝虫病作为两类严重危害人类健康的寄生虫病在临床表现与诊断方式上相似,存在误诊的风险。同时,这两类寄生虫病可通过血液传播。因此,高效、快速的检测技术对疟疾与巴贝虫病的诊断和保证血液制品安全有重要的意义。本文对现有针对疟原虫与巴贝虫的环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）、重组酶聚合酶扩增技术（recombinase polymerase amplification, RPA）、重组酶介导等温扩增技术（recombinase-aided amplification,RAA）以及依赖解旋酶等温扩增技术(helicase-dependent amplification, HDA)等四类等温扩增技术的原理、特点及检测方式进行综述并对其应用前景进行展望。     

重组酶聚合酶扩增技术在寄生虫快速检测中的应用

重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)是一种新型核酸等温扩增技术,具有特异性强、灵敏度高、恒温反应、操作简单和耗时短等优点.该技术自2006年面世以来,被逐渐应用于医学、食品安全、公共卫生和农业生产等领域.寄生虫病不仅会影响人畜健康,还阻碍经济发展,带来严重...     

国内基因扩增技术的进展

聚合酶链反应实验的开展 聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)为一种体外酶促基因扩增反应,它模拟核酸分子体内复制过程,在聚合酶作用下,进行特定核酸片断的体外复制。PCR技术做为现代分子生物学检测和研究的先进手段之一,为多种疾病提供了核酸的诊断和研究依据,在许多分子生物学实验室已广泛使用。在本专栏中,专题介绍我国新药评审专家对国产试剂盒所必须配备的质量要求做了规定,它们是必须使用探针技术、必须使用UNG防污染技术;还有将耒会逐步重视质控而开展内标技术。这些新技术的制定,为分子生物学实验室开展PCR实验研究指出了科学发展方向。下面就PCR技术的进展和相关技术分别予以介绍。     

埃博拉病毒核酸快速检测技术应用及展望

埃博拉病毒(EBOV)是引起人类及哺乳动物高致死性出血热的病原体,2013~2014年已引起了严重的西非埃博拉出血热。快速检测确证病原对于防止疾病的进一步扩散至关重要。目前,实时荧光定量PCR技术及环介导等温扩增技术(LAMP)已经应用于EBOV的核酸快速检测,依赖核酸序列的扩增技术(NASBA)及重组聚合酶扩增技术(RPA)有望成为EBOV新型核酸快速现场检测技术。本文对几种核酸快速检测方法进行综述。     

全球等温扩增技术发展态势研究

目的：研究等温扩增技术发展态势,为我国开展相关研究提供数据参考。方法：通过文献计量方法、科学知识图谱等方法对等温扩增技术及新型冠状病毒（SARS-CoV-2）等温扩增检测相关的研究论文进行数据分析和知识挖掘,研究技术发展脉络、研究热点和发展趋势。结果：中国在等温扩增技术研究上具有较强的研究基础,SARS-CoV-2等温扩增检测技术研究处于全球领先水平。中国科学院等国内机构成为全球等温扩增技术的重要研究力量。研究较多的等温扩增技术主要为环介导等温扩增(LAMP)、滚环扩增(RCA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)和依赖核酸序列的扩增(NASBA)。主要的研究对象为SARS-CoV-2、HIV、HPV、Salmonella和Malaria等病毒和细菌及癌症标记物。重点关注的技术工具为CRISPR/Cas基因编辑、生物传感器、微流控芯片等。结论：2000年以前,等温扩增技术主要集中于NASBA和链替代扩增（SDA）技术;2000年以后,LAMP、RCA等新技术出现,LAMP迅速成为主流技术。新型冠状病毒肺炎疫情发生以来,等温扩增技术广泛应用于SARS-CoV-2的快速性和便捷性检测。     

新型等温扩增技术应用于疟原虫等寄生虫快速诊断的研究进展

当前常用基于PCR原理的核酸检测技术来检测疟原虫,疟原虫检测方法主要包括镜检法、抗原免疫检测法和核酸检测法等。但由于存在检测时间长、人员和设备要求高等缺点,限制了其在基层的推广应用。特别是基层普遍缺乏经验丰富的专业技术人员和高端仪器设备,此外在极端环境下快速检测大规模样品的需求等对现存疟原虫检测方法造成了挑战。近年来发展起来的等温扩增技术由于具有简便、快速、灵敏性和特异性高等优点,具有潜在的应用前景。本综述介绍了试对各类等温扩增技术的原理、特点和前景等,并在此基础上重点综述重组酶聚合酶扩增技术（recombinase polymerase amplification, RPA）与重组酶介导的等温扩增技术（recombinase-aided isothermal amplification assay, RAA）,并提出利用这类重组酶扩增技术,实现常见疟原虫种快速、精确诊断的可能。     

应用恒温扩增微流控芯片技术快速菌种筛查可疑关节结核

目的探讨恒温扩增微流控芯片(isothermal amplification microfluidic chip,IAMC)技术快速筛查关节结核感染的应用价值。方法应用恒温扩增(isothermal amplification,IA)法和罗氏培养法对19例疑似关节结核感染患者标本行菌群鉴定,应用共焦滤波技术、荧光染料技术将标本的核酸通过恒温扩增法使结果量化,同时将标本核酸结果比对阴性对照、阳性对照的核酸结果以此鉴定结果准确性。结果恒温扩增法检测出13例阳性样品,阳性率为68.42%(13/19);罗氏培养法检测出7例阳性样品,阳性率为36.84%(7/19);对比差异有统计学意义(χ2=5.115,P<0.05)。Kappa值为0.424,一致性好。结论恒温扩增微流控芯片荧光检测核酸技术可快速、准确、简便地检测可疑关节结核中结核分枝杆菌复合群,可作为筛查诊断。     

实时荧光核酸恒温扩增技术在淋球菌检测中的应用分析

目的采用统计学方法评价实时荧光核酸恒温扩增技术(SAT)在临床淋球菌检测中的应用。方法以淋球菌培养法为标准对照,采用实时荧光核酸恒温扩增技术同时对150例疑似患者的生殖道拭子标本和尿液标本进行检测,对结果进行统计学分析比较,并用PCR法进行验证。结果使用SAT检测的生殖道拭子和尿液阳性检出均为110例,培养法阳性检出为108例,其中培养法检出阴性的2例通过PCR验证为阳性。两种取样方式的SAT检测法和培养法三者阳性率差异均无统计学意义(P0.05);以培养法为金标准,SAT检测拭子的敏感度为100.0%,特异度为95.2%;SAT检测尿液标本的敏感度为100.0%,特异度为95.2%。结论采用实时荧光核酸恒温扩增技术对生殖道拭子和尿道标本的检测效果与培养法相比,阳性率高,敏感度较高,且尿道标本收集方法比较简便,患者依从性好,可代替拭子道取样方法,此方法可在临床推广应用。     

新型冠状病毒实验室检测方法及应用

随着新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus?2,SRAS?CoV?2）分离培养与基因组测序的完成,新型冠状病毒肺炎（corona virus disease,COVID?19）的确诊主要依靠RT?PCR 法检测SARS?CoV?2 核酸基因,重组酶介导等温核酸扩增技术（recombinase aided amplification,RAA）等新型常温核酸扩增技术也得到进一步应用。免疫学诊断包括胶体金和ELISA IgM 和IgG 抗体检测技术,主要用于人群的筛查和辅助诊断。基于CRISPR技术的新型诊断技术等也在进一步完善过程中。     

以核酸序列为基础的扩增

核酸扩增技术已迅速成为分子生物学家研究中所使用的重要手段之一。它以聚合酶链反应(PCR)为基础,可在3～4小时内使DNA扩增一百多万倍,但此方法需样品温度迅速改变,为此通常需使用特殊的热循环装置。本文作者报道了一种用于核酸扩增的快捷方法——以核酸序列为基础的扩增(NASBA)法。此法可在约2小时内使RNA扩增十亿倍。此外,由于NASBA是一种连续恒温过程,所以无需专门的设备。     

核酸恒温扩增-免疫层析技术在布鲁菌病诊断中的应用

目的：探讨核酸恒温扩增-免疫层析检测方法对布鲁菌病（布病）诊断的应用价值,为核酸检测标准化推广应用提供实验室参考依据。方法：分别以全血和血清为样本提取布鲁菌核酸,应用恒温扩增技术进行核酸扩增,以免疫层析检测装置直接判读核酸扩增结果;免疫学检测应用试管凝集试验（SAT）;数据处理应用配对校正χ2检验。结果： 29例就诊者全血核酸扩增阳性率为55.2%,血清核酸扩增阳性率为23.1%,二者比较差异有统计学意义（P＜0.05）;以全血为核酸提取样本,190例不同病程SAT诊断为阳性和阴性的就诊者核酸检测结果与SAT检测结果符合率为57.9%;93例首诊SAT诊断为阳性和阴性的急性早期就诊者核酸
检测结果与SAT检测结果符合率为63.4%。结论：核酸恒温扩增-免疫层析检测方法作为一项实验室辅助诊断和治疗的参考依据,对急性早期的布病患者具有较高的临床应用价值,在鉴别诊断布病患者和非患者方面无参考价值。     

恒温核酸扩增芯片法在下呼吸道病原体检测中的应用

目的探究恒温核酸扩增芯片法在下呼吸道病原体检测中的应用价值。方法 2018年10月至2019年3月,本院收集下呼吸道感染患者的病原体样本244例,分别给予恒温核酸扩增芯片法、病原体分离和培养、荧光定量PCR技术进行病原体检测,分析244例病原体样本的检测结果。结果 244例病原体标本检出126例下呼吸道病原体,其中痰液病原体检出率比肺泡灌洗液检出率高(P0.05)。共检出12种病原菌,种类以流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌为主。60岁以上患者的铜绿假单胞菌检出率较高18岁以下患者的流感嗜血杆菌检出率较高(P0.05)。恒温核酸扩增芯片法的检出率高于病原体分离、培养阳性检出率(P0.05)。结论下呼吸道病原体检测应用恒温核酸扩增芯片法检测,高效快速,值得应用。     

PCR技术在新冠病毒核酸检测中的应用

自2019年12月底以来,由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染引起的新冠肺炎(COVID-19)疫情在全世界范围内暴发.新冠病毒具有较强的传染性,因此快速、准确地检测新冠病毒是阻断疾病传播、防控新冠疫情的关键.目前国内外已经出现了多种新冠病毒核酸检测方法,其中聚合酶链式反应(PCR)是主流的方法.文章总结了新冠病...     

恒温扩增技术在儿童下呼吸道感染中的临床应用

目的 评估恒温扩增快速检测技术在儿童下呼吸道感染中的临床应用价值。方法 选取收集的300例儿童下呼吸道感染患者，收集其痰液(包含吸取痰)样本，采用恒温扩增快速核酸检测技术和培养法同时进行病原学检测，统计两种检测方法的病原体检出情况。结果 恒温扩增技术阳性检出率为75%,高于病原分离培养的检出率25.87%,两种方法检出结果不具一致性，且恒温扩增技术对混合感染样本检出率49.33%,高于传统培养法检出率5.97%。结论 相较于传统培养法，恒温扩增芯片法检测技术灵敏，阳性率更高，可以辅助临床快速、准确判断下呼吸道感染的致病原，从而采取有针对性地用药和治疗。     

赖解旋酶恒温基因扩增技术的研究进展

随着分子生物学研究领域的发展,赖解旋酶恒温基因扩增技术(HDA)作为一种简便、快速、高效的体外恒温基因扩增技术出现。HDA依靠解旋酶解开双链DNA、结合蛋白维持单链DNA状态、DNA聚合酶催化靶片段的扩增。可以用于微生物基因组DNA、病原菌DNA、质粒DNA和cDNA等的扩增,该法具有广阔的实用前景。     

环介导恒温扩增技术快速检测大肠杆菌O157特异基因的建立

目的 建立环介导的恒温扩增快速检测大肠杆菌O157的方法。方法 采用环介导的恒温扩增反应（LAMP）技术扩增大肠杆菌O157特异性基因,并与传统PCR比较。结果与传统的PCR技术相比,LAMP法更加简便快速、且在等温条件下进行,具有更高的灵敏性;特异性100%。结论 该方法具有灵敏度高,特异性强,操作简便快速,不需要复杂仪器设备、为临床检测大肠杆菌O157提供了一个快速简便的新方法。     

环介导等温扩增过程监测与结果分析技术研究进展

2000年,Notomi等[1]建立了一种新颖的核酸扩增方法—环介导等温扩增(loop-mediated isothermalamplification,LAMP)。该技术利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域,在恒温条件进行反应,不需要模板的热变性和长时间温度循环。较之于传统的PCR方法,其不但简便、快速、不需要昂贵     

环介导等温扩增技术的研究进展

<正>随着检验医学的发展,一些分子生物学技术,如PCR[1]、链置换扩增(strand displacement amplifica-tion,SDA)[2]、依赖核酸序列扩增(nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)及再生式序列复制反应(self-sustained sequence replication reaction,3SR)[3]、等,在医学检验与诊断方面发挥了重要的作用。