PER1与RACK1蛋白作用位点分析

目的 筛选人下丘脑视交叉上核(SCN)区域内与PERIOD1(PER1)相互作用的新蛋白,研究RACK1与PER1的作用特点,明确其结合的关键结构域.方法 采用酵母双杂交方法,筛选得到人SCN区域内与PER1-PAS结构域相互作用的新蛋白,并构建5种表达不同长度RACK1片段的酵母文库质粒与PER1诱饵质粒共转染酵母AH109进行杂交,通过营养缺陷筛选、报告基因检测获得阳性克隆,并采用体外转录、免疫共沉淀实验证实阳性克隆蛋白间的相互作用.结果 酵母双杂交筛选得到人SCN区域内表达RACK1蛋白的克隆,重组RACK1表达质粒与PER-PAS诱饵质粒进行酵母双杂交筛选后得到三个阳性克隆:RACK1(WD1-7)、RACK1(WD4-7)和RACK1 (WD5-7),β-半乳糖苷酶测试阳性证实报告基因表达,免疫共沉淀结果显示阳性克隆与PER1蛋白间存在相互作用.结论 RACK1与PER1存在直接相互作用,RACK1含有7个WD40结构域,本研究发现与PER1结合的最小区域位于Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ三个WD40结构域,提示其碳端序列为其结合的关键部位.     

人巨细胞病毒UL135蛋白结合蛋白的酵母双杂交筛选

目的 利用酵母双杂交系统从人胎脑cDNA文库中筛选与人巨细胞病毒(HCMV)UL135编码蛋白相互作用的蛋白.方法 将成功构建的酵母诱饵表达载体pGBKT7-UL135转化到酵母菌AH109中,再将人胎脑文库DNA转化到含有pGBKT7-UL135的酵母细胞中,筛选与HCMV UL135编码蛋白相互作用的细胞蛋白,并对阳性克隆进行测序和生物信息学分析.结果 最终确认60个克隆与HCMV UL135编码蛋白相互作用,其中2个克隆与Thy-1高度同源.结论 成功应用酵母双杂交系统筛选出与HCMV UL135编码蛋白相互作用的蛋白,其中Thy-1在HCMV感染致病过程中可能起重要作用.     

脆性X智力低下蛋白与NDK／Nm23—H2的相互作用

目的筛选与脆性X智力低下蛋白(FMRP)相互作用的蛋白,为FMRP生理功能的阐释提供新线索.方法以5月龄人胚海马mRNA为模板制备cDNA,重组于DNA激活结构域载体pGAD10,构建酵母双杂交文库,从中筛选与FMRP相互作用的蛋白.应用酵母双杂交体系对FMRP的相互作用区域进行定位.结果 (1)所构建的5月龄人胚海马cDNA酵母双杂交文库含1×106克隆,插入片段平均长度约1.5 kb,有效克隆90%;(2)在该文库中筛选到一个与FMRP相互作用的阳性克隆.序列分析表明该克隆为人的核苷酸二磷酸激酶亚基B(NDK/Nm23-H2)cDNA;(3)NDK/Nm23-H2与缺少外显子12、14-17的FMRP异构体,以及含FMRP外显子1-12的克隆相互作用,而与FMRP外显子1-6、外显子2-7不能直接结合.结论人Nm23-H2在酵母细胞内能与FMRP结合,其相互作用区域定位于FMRP的前1-11个外显子.Nm23-H2具反式调控因子特性,FMRP与Nm23-H2的相互作用提示FMRP参与基因表达调控.这一发现有助于进一步研究FMRP在细胞核内的生物学功能.     

酵母双杂交技术筛选与HCMV-UL146编码产物相互作用蛋白

目的 应用酵母双杂交技术,在人胎脑文库中筛选与人类巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV) UL146基因编码蛋白相互作用蛋白,以探讨HCMV-UL146的生物功能.方法 应用酵母双杂交系统,构建pGBKT7-UL146诱饵质粒,转化酵母AH109,与含人胎脑cDNA文库质粒的酵母相互作用,于涂有X-α-gal营养缺陷型培养基上筛选生长.挑选蓝色克隆,提取此酵母克隆的质粒转化大肠杆菌,提取质粒DNA进行测序分析.结果 pGBKT7-UL146构建成功.经严格筛选,共有200余个阳性克隆,分离测序80个克隆,成功筛选出30个与HCMV-UL146特异性相互作用的蛋白.结论 HCMV-UL146与多种蛋白有相互作用,提示其生物学功能复杂.此结果为进一步研究HCMV-UL146基因功能提供依据.     

ERBIN蛋白PDZ结构域结合蛋白的筛选和鉴定

目的 筛选和鉴定ERBIN蛋白的PDZ结构域结合蛋白。方法 以ERBIN蛋白的PDZ结构域为诱饵,采用酵母双杂交系统从人淋巴细胞白血病细胞系的MATCHMAKERcDNA文库中筛选ERBINPDZ结合蛋白,使用β-半乳糖苷酶（LacZ）活性的定性分析和免疫共沉淀技术鉴定所获结合蛋白识别和结合ERBINPDZ结构域的结合特性。结果 TAX1蛋白能选择性与ERBIN蛋白的PDZ结构域发生特异性结合。结论 TAX1蛋白是ERBIN结合蛋白家族中的一个新成员。     

运用酵母双杂交系统筛选肌营养不良相关蛋白2(DRP2)相互作用蛋白

目的应用酵母双杂交系统筛选小鼠、大鼠、人类大脑文库中与DRP2相互作用的蛋白,分析中枢神经系统中DRP2分子复合体的组成成分。方法设计3个含有DRP2不同蛋白结构域的诱饵质粒,在完成诱饵质粒的自激活性的鉴定后,对小鼠、大鼠、人类脑MATCHMAKER cDNA文库进行筛选。结果运用DRP2蛋白N-Bait筛选大鼠脑MATCHMAKER cDNA文库,笔者获得了一个阳性文库质粒。该质粒的插入子编码一种SNAP25相互作用的蛋白质Scoilin。Scoilin又被命名为Zwint-1蛋白。同时笔者还确定了这两种相互作用蛋白质的精确结构域:DRP2蛋白以其含有两个Spectrin重复和一个WW蛋白结构域的氨基端与Scoilin(Zwint-1)全蛋白相互作用。结论应用酵母双杂交,笔者于大鼠大脑中找到了DRP2的相互作用的蛋白质Scoilin(Zwint-1),并且确定了这两种相互作用蛋白质的精确结构域。     

应用酵母双杂交筛选与FAM172A相互作用蛋白的研究

目的 应用酵母双杂交技术（蛋白与蛋白的相互作用）,筛选人胎脑cDNA文库中与FAM172A蛋白相互作用的蛋白,为深入研究新发现的蛋白质FAM172A生物学功能及在疾病中的作用奠定基础.方法 构建pGB-FAM172A诱饵质粒,转化酵母菌株Y190.人胎脑cDNA转化诱饵酵母菌,于营养缺陷型培养基（SD/-Leu/-Trp/-His）上生长,从中筛选到35个单克隆进行β-半乳糖苷酶克隆转移滤纸实验,对蓝色克隆者进行质粒抽提,转入大肠杆菌DH/OB,进行抗性筛选,从中提取质粒,一对一与诱饵质粒pGB-FAM172A共转酵母细胞Y190,进行验证鉴定,提取质粒DNA进行测序并进行BLAST比对分析.结果 成功构建pGB-FAM172A质粒,经严格筛选,共有10个阳性克隆,分别进行测序、序列比对,成功筛选出6个与FAM172A存在相互作用的蛋白：RTCD1、MOCS2、A2M、KCNIP1、BTBD2和TOX2.结论 利用酵母双杂交系统筛选出6个可能与FAM172A相互作用的蛋白,为进一步研究FAM172A蛋白的生物学功能提供了线索.     

与杜氏盐藻驱动蛋白Ⅱ动力亚基C端相互作用的新蛋白的酵母双杂交筛选

目的:用酵母双杂交的方法筛选与杜氏盐藻驱动蛋白Ⅱ动力亚基(FLA8)C端相互作用的蛋白。方法:设计特异性引物(上下游分别引入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点),扩增FLA8C端(433个氨基酸)cDNA,与穿梭载体pGBKT7连接以构建诱饵表达载体,然后转化酵母菌株Y187和AH109,Westernblot法检测诱饵蛋白在转化酵母菌株内的表达。通过自激活实验和毒性实验检测诱饵表达载体是否适合利用酵母双杂交的方法筛选相互作用蛋白。转化诱饵质粒的酵母菌株Y187与AH109(文库菌)杂交,待三叶形合子形成后用营养缺陷型培养基和α-半乳糖苷酶活性实验筛选阳性克隆,并对阳性克隆进行测序。结果:成功构建了pGBKT7-FLA8-C双杂交诱饵载体;经检测该载体的表达产物对Y187和AH109均无自激活和毒性作用,可用于酵母双杂交实验;杂交后筛选得到2个阳性克隆,测序结果显示为鞭毛结合蛋白107(FAP107)和含蛋白结合结构域的预测蛋白。结论:成功筛选得到了与杜氏盐藻驱动蛋白Ⅱ动力亚基C端相互作用的蛋白,分别为FAP107和预测蛋白。     

酵母双杂交筛选雄激素受体辅助调节因子267-α(ARA267-α)的相互作用蛋白

目的:通过酵母双杂交系统筛选与雄激素受体辅助调节因子267-α(androgen receptor-associated coregulator 267-α,ARA267-α)有相互作用的蛋白质,为研究ARA267-α的生理功能寻找证据和方向.方法:以能表达ARA267-α中4个PHD(p1ant homeodomain)和1个SET[Su(var)3-9,Enhancer-of-zeste,Trithorax]结构域的pGBKT7-PHD-SET重组质粒为"诱饵",采用酵母融合(yeast mating)方法筛选预转化的人脑cDNA文库.挑选阳性酵母菌落进行质粒提取、限制性内切酶分析和DNA测序.将测序结果在GenBank中进行核苷酸序列同源性比对,确定它们所对应的基因.通过再次酵母双杂交排除假阳性相互作用.结果:筛选cDNA文库共获得约600个阳性酵母菌落,随机挑选其中的65个菌落提取混合质粒.经过在氨苄青霉素培养盘中筛选,共得到43个文库pACT2-cDNA质粒.选取35个酶切片段不同的文库pACT2-cDNA质粒进行测序,测序结果比对揭示,35个cDNA插入片段来源于16种不同的基因.酵母双杂交证实其中RanBPM是ARA267-d的假阳性作用蛋白.结论:通过筛选cDNA文库发现ARA267-α可以与多个不同的蛋白质相互作用,这提示ARA267-α可能是一个具有多种生理功能的蛋白分子,而RanBPM极可能是一个转录因子.     

应用酵母双杂交系统筛选LKB1相互作用蛋白

目的 应用酵母双杂交技术研究与抑癌基因LKB1发生相互作用的蛋白.方法 应用酵母双杂交系统,以人 LKB1为诱饵,筛选人类全基因组开放阅读框酵母双杂交文库,寻找能与之相互作用的蛋白,并且通过免疫共沉淀和 GST-Pull down实验证实其之间的相互作用.结果 经过酵母双杂交共获得17个克隆,经过验证分析,最终确定1个无重复阳性克隆.结论 获得的1个基因编码的蛋白可能揭示LKB1新的作用机制.     

甲型H3N2流感病毒截短型PB1-F2蛋白与宿主蛋白的相互作用的初步研究

目的利用酵母双杂交技术研究甲型H3N2流感病毒截短型PB1-F2蛋白与人类宿主蛋白的相互作用,为该病毒蛋白的功能研究和致病机制提供理论依据。方法以本实验室分离和鉴定的甲型H3N2流感病毒A/Guangdong/7028/2010为模版,构建pGBKT7-PB1-F2重组载体,利用Y2HGold酵母双杂交系统,从人类通用cDNA文库中筛选与其相互作用的蛋白。结果成功构建含诱饵蛋白基因的pGBKT7-PB1-F2重组载体,转化酵母自激活和毒性实验显示为阴性;酵母双杂交实验显示Y2HGold和Y187酵母的结合率为5.22%,符合实验要求;经筛选和验证后,得到3个与截短型PB1-F2蛋白有相互作用的阳性克隆,分别为钾/钠ATP酶β1亚基、热休克蛋白40和白介素-2受体γ亚基。结论初步推断截短型H3N2流感病毒PB1-F2蛋白可能影响流感病毒在宿主细胞中的复制功能和凋亡调控。     

LMO4调节肿瘤发生过程中的上皮-间质转化

LIM-only factor 4(LMO4)作为哺乳动物LMO蛋白家族成员之一,是调节细胞增殖的重要转录调节因子,其在哺乳动物正常发育和肿瘤的形成过程中起着重要的调控作用。LMO4在上皮-间质相互作用活跃的区域呈高表达,其表达的失调可以导致肿瘤的发生。现就LMO4与TGF-β信号通路的作用机制及其在细胞生命过程中所起的作用作一综述。     

应用酵母双杂交系统筛选新基因AngRem104相关蛋白

目的：应用酵母双杂交系统筛选与新基因AngRem104相互作用的蛋白，为该基因的功能研究提供线索。方法：构建AngRem104的真核表达载体AngRem104-pGBKT7／c—myc，转化酵母菌AH109，Western blot证实蛋白表达，进行毒性和自激活检验，与转化了成人肾脏cDNA文库的酵母菌Y187接合，筛选与AngRem104相互作用的蛋白。结果：AngRem104蛋白能在酵母中正常表达，对酵母细胞无毒性，不存在自激活现象。筛选出的蛋白包括真核翻译延伸因子1α1、糖皮质激素受体AF-1特异延伸因子、β2-微球蛋白、巴戴-比德尔综合征2蛋白及4个与细胞代谢有关的蛋白。结论：AngRem104可能影响细胞内某些转录因子活性和细胞代谢，并与某些免疫相关疾病和遗传病发病有关。酵母双杂交结果为AngRem104的功能研究提供了重要线索。     

CytoTrap酵母双杂交筛选与乙型肝炎病毒HBx 蛋白相互作用的肝细胞蛋白

目的筛选与乙型肝炎病毒HBx蛋白发生相互作用的肝细胞蛋白。方法构建诱饵重组载体pSos-HBx,经测序正确后将
其转化酵母菌cdc25Hα中,检测其在酵母中的表达及有无自激活作用,并利用CytoTrap酵母双杂交的方法筛选与诱饵蛋白HBx
相互作用的肝细胞蛋白。结果获得重组诱饵质粒pSos-HBx,验证可以在酵母中表达诱饵蛋白Sos-HBx,且诱饵质粒在此系统
中没有自激活作用。利用此系统筛选出6个能与HBx相互作用的肝细胞蛋白,分别为纤连蛋白1、翻译调控肿瘤蛋白1、核受体
结合蛋白IQ-WD1、软泡抑素、血清类粘蛋白1、二硫化物异构酶家族A3。结论成功克隆出乙型肝炎病毒HBx蛋白的结合蛋白,
为进一步研究HBx蛋白在肝炎或肝癌过程中发挥的作用提供了新线索。
     

FasL相互作用蛋白的筛选及其在大肠癌研究中的意义

目的建立FasL相互作用蛋白的酵母双杂交系统，筛选与FasL相互作用的蛋白质，探讨FasL及其相互作用蛋白在大肠癌发生与发展中的意义，为筛选大肠癌早期诊断标志物和治疗靶标提供理论依据。方法以FasL作为诱饵蛋白，在人胎肝cDNA文库中筛选与FasL相互作用的蛋白质；将FasL相互作用蛋白的基因转染人直肠癌HR-8348细胞，通过细胞学实验（四唑蓝比色法），研究FasL及相互作用蛋白对直肠癌细胞耐药性的影响；应用免疫组织化学方法检测FasL及相互作用蛋白在大肠癌标本中表达情况，比较在大肠癌不同分期中这些蛋白的表达差异，研究他们在大肠癌发生与发展中的作用机制。结果筛选出10个与FasL特异性相互作用的蛋白，包括金属硫蛋白1K、1G、2A，组织蛋白酶B，脂肪酸合成酶，干扰素d诱导蛋白27，磷脂清除酶，丝氨酸／苏氨酸样激酶，锚着黏附蛋白以及纤维微丝蛋白一5等。细胞耐药实验证实，FasL与金属硫蛋白和组织蛋白酶之间的相互作用能够增强人直肠癌HR-8348细胞的耐药能力。免疫组织化学结果表明，癌变的大肠癌组织中FasL、组织蛋白酶、金属硫蛋白表达明显增高，高于正常大肠黏膜（P〈O．05）。结论FasL与组织蛋白酶、金属硫蛋白、锚着黏附蛋白等之间的相互作用与大肠癌的侵袭力及癌细胞产生耐药性密切相关：FasL、组织蛋白酶、金属硫蛋白可能为大肠癌诊断的标志物；FasL及其相互作用蛋白可作为治疗大肠癌新的分子标靶。     

基于RNA聚合酶靶点的抗流感病毒药物筛选系统的鉴定

目的鉴定基于聚合酶亚基间相互作用的靶点特异性抗流感病毒药物筛选酵母双杂交体系。方法挑取筛选平板SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal阳性单菌落（共转化质粒PB1-pGBKT7与PA-pGADT7的AH109酵母细胞）接种培养,PCR验证重组质粒共转是否成功;glass-beads法提取酵母总蛋白,Western-blot验证融合蛋白在酵母细胞中是否表达;将PB1-pGBKT7质粒PB1基因克隆至载体pAcGFP1-C,PA-pGADT7质粒PA基因克隆至载体pProLabel-C,将构建的重组质粒PB1-pAcGFP1、PA-pProLabel共转染人胚肾GP2-293细胞,Co-IP验证在哺乳动物细胞中流感病毒聚合酶亚基PB1、PA具有相互作用。结果 PB1、PA基因PCR结果均为阳性;PB1-Myc融合蛋白Western-blot结果为阴性,PA-HA融合蛋白Western-blot结果为阳性;PB1-pAcGFP1、PA-pProLabel重组质粒PCR验证结果 PB1、PA基因阳性;Western-blot检测PB1-GFP融合蛋白阳性;Co-IP结果表明流感病毒RNA聚合酶亚基PB1与PA在哺乳动物细胞内具有相互作用。结论基于RNA聚合酶亚基间相互作用的抗流感病毒药物筛选系统构建成功,可以用于抗流感病毒靶点特异性的高通量药物的筛选。     

CLN3编码蛋白Battenin的N-端是与蛋白结合的功能域

Battendisease(BD,MIM204200),thejuvenileformofneuronalceroidlipofuscinosis(NCLs),isamongthemostcommonpediatricneurodegenerative disorders[1].ThegeneunderlyingBD,designatedCLN3andconsistingof15exons,hasbeenmappedto16p12.1.Ittranscribesa1.7kbmRNAthatiswidely…     

乙型肝炎病毒核心抗原肝细胞结合新蛋白的功能研究

目的为探讨乙型肝炎病毒(HBV)核心抗原(HBcAg)在乙型肝炎发病机制中的作用,筛选、克隆出人肝细胞中与HBcAg相互作用的未知蛋白基因C12并进一步对其功能作初步研究.方法应用酵母双杂交系统-3筛选到与肝细胞蛋白结合的蛋白编码基因C12,克隆该基因并用再次用重回交实验证实作用可靠后,将基因与荧光蛋白基因融合表达,分析该基因表达产物在哺乳动物细胞中的定位;用MTT代谢实验了解C12表达对哺乳动物细胞生长代谢的影响作用;酵母双杂交实验寻找肝细胞中与之相互作用的蛋白;基因芯片技术了解C12基因表达对其他基因表达的影响.结果成功地筛选并克隆出HBcAg的肝细胞结合蛋白C12基因,经回交实验再次证实C12基因的表达产物C12蛋白与HBcAg确切的结合作用.该基因与荧光蛋白基因融合表达转染293细胞、L02细胞后48 h细胞呈现均匀分布的强绿色荧光信号,提示C12蛋白可能主要定位在细胞质内;通过在Bel7402、L02细胞系中进行MTT检测,发现C12在上述细胞中表达没有对细胞的生长繁殖产生明显影响;用酵母双杂交系统-3筛选出肝细胞中与C12蛋白相互作用的蛋白基因16种;基因芯片技术在1 152个基因中筛选出17个差异表达的基因.结论 C12蛋白主要定位在细胞质内,对哺乳动物细胞生长繁殖无明显影响,能与肝细胞中多种蛋白结合,在细胞内的过表达引起的生物过程涉及许多不同基因表达的变化.     

HBV表面抗原大蛋白与人胰腺CDK5RAP3蛋白的亚细胞定位研究

目的 运用激光共聚焦显微技术对CDK5RAP3与LHBs进行亚细胞定位研究,为进一步研究HBV影响糖、脂类代谢的分子生物学机制提供一定的思路和方向.方法 应用酵母双杂交系统筛选人胰腺cDNA文库中的LHBs结合蛋白基因,构建真核表达质粒pDsRed1-N1-CDK5RAP3,应用激光共聚焦显微技术对CDK5RAP3与LHBs进行亚细胞定位研究.结果 成功构建真核表达质粒pDsRed1-N1-CDK5RAP3,转染了pDsRed1-N1-CDK5RAP3质粒的细胞,红色荧光信号较集中分布于细胞浆中,与经DAPI染色的细胞核无重叠.结论 证实LHBs基因和CDK5RAP3基因在体内可以表达蛋白,并提示LHBs蛋白和CDK5RAP3蛋白均主要定位在细胞浆内.