bFGF基因修饰的骨髓基质细胞复合多孔矿化Bio-Oss胶原修复下颌骨缺损的实验研究

目的:观察经bFGF基因转染的兔骨髓基质细胞复合多孔矿化Bio-Oss骨胶原修复下颌骨缺损的效果.方法:标准成年新西兰白兔12 只随机分3 组,单纯Bio-Oss骨胶原组,BMSCs 凝胶 Bio-Oss骨胶原组,bFGF基因转染BMSCs 胶原 Bio-Oss骨胶原组于术后8 周取材,行肉眼、组织学观察骨缺损的修复情况.结果:单纯Bio-Oss骨胶原材料组:缺损区大量的未吸收的支架材料周围可见有类骨样组织;BMSCs 凝胶 Bio-Oss骨胶原材料组:缺损区大量的未吸收的支架材料周围可见有大量间充质细胞聚集、分化,有较幼稚的编织骨形成;bFGF基因转染BMSCs 凝胶 Bio-Oss骨胶原材料组:支架材料周围,大量新骨形成,新骨表面可见活跃的成骨细胞,部分区域有成熟骨组织形成,并有新生的毛细血管形成.结论:Bio-Oss骨胶原有较强的诱导成骨能力;Bio-Oss骨胶原为载体的自体骨髓基质细胞移植能有效修复骨缺损,是骨组织工程良好的支架材料;兔骨髓基质细胞体外表达人bFGF基因,并且经基因修饰的组织工程骨修复骨缺损效果最佳.     

应用兔骨髓基质细胞膜片与珊瑚支架构建组织工程骨

目的：探讨应用富血小板血浆与骨髓基质细胞（BMSCs）构建骨髓基质细胞膜片，以及应用骨髓基质细胞膜片与珊瑚支架构建组织工程骨的可行性。方法：将取自同一供体兔的BMSCs与富血小板血浆复合后，共同在体外培养10天，构建出BMSCs膜片，用其包裹珊瑚支架后植入裸鼠背部皮下，另以单纯BMSCs种植到珊瑚支架及以单一珊瑚植入作为对照。术后4周和8周取材，通过组织学观察和组织形态测量分析，评价其成骨情况。采用SPSS11．0软件，对所得数据进行统计学分析。结果：BMSCs与富血小板血浆共同在体外培养10d，可构建出厚约2mm的BMSCs膜片。用其包裹珊瑚支架后植入裸鼠背部皮下4周和8周，在珊瑚表面及其孔洞内有大量软骨和骨质形成．其成骨量明显大于单纯BMSCs种植组。单一珊瑚植入组未见骨或软骨形成。结论：将富血小板血浆与BMSCs复合后共同在体外培养，可构建出具有一定厚度的BMSCs膜片，将此膜片包裹珊瑚支架所形成的膜片一支架复合体具有良好的成骨活性.     

bFGF重组慢病毒对羊骨髓间充质干细胞成骨功能影响的研究

目的:探讨碱性成纤维生长因子(basic Fibroblast Growth Factor,bFGF)基因转染对体外培养的骨髓间充质干细胞(Bone Marrow mesenchymal Stem Cells, BMSCs)的增殖和骨向分化的影响,为构建组织工程骨的种子细胞做理论依据。方法:构建携带人bFGF基因的慢病毒载体,转染诱导后羊的BMSCs,得到bFGF转染组,选择未转染的BMSCs为对照组。两组细胞采用实时定量PCR技术和蛋白质印迹法技术检测Collagen-Ⅰ、OC、OPN等成骨相关基因的mRNA水平及蛋白水平相对表达量的变化情况。结果:bFGF组OPN和Collagen-Ⅰ基因mRNA水平表达量较对照组增高,差异有统计学意义(P<0.05),两组细胞在OC基因mRNA水平表达量上差异无统计学意义;bFGF组细胞在OPN、OC和Collagen-Ⅰ基因蛋白水平上表达量均高于对照组,且差异有统计学意义。结论:bFGF基因转染能增强羊BMSCs增殖和骨向分化的能力,可作为组织工程骨的种子细胞。     

载辛伐他汀PLGA/CPC复合骨髓基质干细胞构建组织工程骨的实验研究

目的：探讨载辛伐他汀PLGA/CPC复合骨髓基质干细胞(bone marrow stromal stem cells)构建组织工程骨的可行性,并筛选辛伐他汀的有效载药量。方法：采用溶剂浇铸—粒子沥滤技术结合相分离法,制备不同浓度(辛伐他汀质量分别为0.1、0.5、1 mg)的载辛伐他汀PLGA/CPC复合支架材料,扫描电镜观察孔隙率,绘制药物释放曲线;茜素红染色、I型胶原染色观察成骨诱导液和辛伐他汀对骨髓基质干细胞向成骨分化的作用;将第3代BMSCs经dil染色后,接种于不同浓度的复合支架材料上,扫描电镜、激光共聚焦显微镜观察细胞在支架上的黏附情况,CCK-8和碱性磷酸酶(ALP)检测对其增殖和分化作用;采用SPSS 18.0软件包对数据进行统计学分析。结果：支架材料孔隙率达90%以上,孔径平均200~300 μm,载药组药物持续缓慢释放,未见药物突释现象;经辛伐他汀和成骨诱导组I型胶原表达阳性,茜素红染色可见明显钙结节;4组支架材料与细胞黏附性较好,0.5 mg组细胞生长状态最佳。CCK-8和ALP检测0.5 mg组能够明显促进细胞的增殖和分化。结论：辛伐他汀和成骨诱导液联合利用,能够更有效地促进BMSCs向成骨分化;载辛伐他汀PLGA/CPC复合支架材料是理想的组织工程支架材料;载0.5 mg辛伐他汀PLGA/CPC支架材料能够有效促进BMSCs的增殖和分化。     

牙齿组织工程无机和复合型支架材料的优选

目的：优选应用于牙齿组织工程的无机和复合型支架材料。方法：将生长因子诱导后的人牙源性间充质细胞与天然珊瑚、陶瓷化骨以及Collagraft复合材料相复合进行体外培养，采用扫描电镜和细胞计数法观察和比较细胞在各种三维支架中的生长、增殖情况。结果：细胞在陶瓷化骨和Collagraft复合材料表面伸展充分，生长良好，增殖活跃，细胞表面可见多数分泌颗粒，而天然珊瑚表面附着细胞很少，伸展不够充分，增殖也不明显。结论：陶瓷化骨和Collagraft复合材料适宜牙源性间充质细胞的生长，可以作为构建组织工程牙齿样结构的支架材料．     

无机诱导因子骨组织工程支架材料体外细胞相容性的实验研究

目的：细胞毒性和细胞相容性是生物材料应用于临床首先必须面对的问题.通过对无机诱导因子骨组织工程支架材料的体外实验,来研究其细胞毒性和细胞相容性,为其临床应用作前期准备.方法：将生长状态良好的人骨髓基质细胞与无机诱导因子支架材料浸提液共同培养,通过镜下观察细胞形态、MTT比色法、流式细胞仪检测法评价生物材料浸提液对人骨髓基质细胞生长和增殖的影响;并将人骨髓基质细胞接种于无机诱导因子支架材料上,扫描电镜观察材料细胞复合物生长状况.结果：人骨髓基质细胞能够在无机诱导因子支架材料上生长,支架材料对体外培养的人骨髓基质细胞的形态不构成损害,对细胞的生长和增殖无明显抑制作用.结论：无机诱导因子支架材料具有良好的细胞生物学相容性,是一良好的组织工程骨构建支架材料.     

新型多孔纳米双相磷酸钙陶瓷支架体外细胞相容性的实验研究

目的　评价新型多孔纳米双相磷酸钙陶瓷支架材料的体外细胞相容性。方法　SD大鼠骨髓基质细胞 (BMSCs)经矿化诱导培养、扩增并检测证实其已具成骨细胞表型后,分别与多孔纳米双相磷酸钙陶瓷支架(实验组)、普通多孔羟基磷灰石陶瓷支架(对照组)体外复合培养。扫描电镜观察BMSCs在材料上的生长及生理功能表达情况;测定细胞碱性磷酸酶活性及骨钙素的含量;流式细胞仪检测细胞的凋亡及周期、倍体,比较细胞的粘附能力、增殖活力及成骨活性。结果　BMSCs经体外诱导形成钙结节,Ⅰ型胶原和碱性磷酸酶免疫染色结果阳性。两组材料上皆有细胞附着生长,但实验组细胞的粘附能力、增殖活力及成骨活性均强于对照组。结论　SD大鼠BM- SCs与新型多孔纳米双相磷酸钙陶瓷支架材料有良好的细胞相容性。     

小肠黏膜下层组织膜与骨髓基质干细胞联合培养的实验研究

目的:检测骨髓基质干细胞(BMSCs)与小肠黏膜下层(SIS)复合培养的生物相容性及成骨能力。方法:山羊BMSCs体外成骨诱导至第3代,接种到预湿的SIS上复合培养,以单纯BMSCs相同条件下培养作为对照。通过相差显微镜、扫描电镜及改进的HE染色等方法观察细胞在材料中的生长情况。MTT法检测BMSCs在材料上的增殖活性,碱性磷酸酶(ALP)活性测定及裸鼠皮下异位成骨实验评价其成骨能力,采用配对资料t检验进行统计学处理。结果:扫描电镜及组织学观察发现,细胞材料复合后,BMSCs在SIS上能够良好地粘附和增殖;定量法检测碱性磷酸酶活性显示,细胞加材料组OD值为0.683±0.044,单纯细胞组OD值为0.696±0.039,ALP及MTT测定结果均证实,BMSCs细胞活性及成骨性能不受SIS的影响,与对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。体内异位成骨实验表明,BMSCs/SIS复合物植入体内后成骨良好,以软骨内成骨方式为主。结论:SIS对BMSCs的生长和成骨功能无影响,具有良好的细胞相容性,且作为一种脱细胞基质的天然膜性材料,SIS具有构建组织工程化骨膜的可行性。     

组织工程化骨髓基质细胞与新型多孔支架材料复合体的体外研究

目的 探讨新型多孔支架材料3-羟基丁酸-co-3-羟基戊酸共聚物/溶胶-凝胶生物活性玻璃(PHBV/SGBG)对狗骨髓基质细胞(BMSCs)生物学功能的影响.方法 采用体外培养技术,将狗BMSCs与PHBV/SGBG支架材料在体外复合培养,通过扫描电镜观察狗BMSCs在PHBV/SGBG材料中的生长情况,用MTT法、碱性磷酸酶活性检测法检测PHBV/SGBG对狗BMSCs增殖、分化的影响.结果 狗BMSCs可紧密附着于材料表面,黏附生长、增殖,并有突起向材料的连通微孔内伸展.复合培养3、6 d,PHBV/SGBG对狗BMSCs的增殖、分化表现出一定的促进作用.结论 BMSCs与PHBV/SGBG支架材料复合体具有良好的生物学功能,有望应用于牙周组织工程学.     

富血小板血浆对珊瑚支架上骨髓基质细胞增殖和成骨分化的影响

目的：评价富血小板血浆（plateletrichplasma，PRP）对珊瑚支架上骨髓基质细胞（marrowstromalcells，MSCs）增殖和成骨分化的影响。方法：将体外培养、扩增和诱导的兔MSCs悬液与同一供体来源的PRP混合，滴加到珊瑚圆片上，再滴加牛凝血酶溶液，形成珊瑚／MSCs／PRP复合物，继续在体外培养。以珊瑚／MSCs复合物和珊瑚／PRP复合物作对照。8d和14d，通过MTT法检测MSCs增殖情况；通过组织化学方法检测培养液中碱性磷酸酶活性和骨钙素含量；通过扫描电镜观察MSCs在珊瑚支架上附着、生长和增殖情况。结果：珊瑚／MSCs／PRP组的光密度值明显大于珊瑚／MSCs组（P〈0．05）；珊瑚／MSCs／PRP组培养液中的ALP活性和OC含量明显大于珊瑚／MSCs组（P〈0．05）；扫描电镜显示：珊瑚／MSCs／PRP组，大量MSCs附着于珊瑚表面和孔洞壁，可见孔洞内有血小板和纤维网格样结构存在；珊瑚／MSCs组，珊瑚表面和孔洞壁有少量MSCs附着；珊瑚／PRP组，珊瑚表面及其孔洞内有大量的血小板和纤维网格样结构存在。结论：PRP促进了珊瑚支架上MSCs的增殖、成骨分化和粘附。     

bFGF真核表达载体的构建及骨髓基质细胞转染

目的：探讨bFGF基因转染骨髓基质干细胞的方法及可行性。方法：构建bFGF基因真核表达质粒,用脂质体法介导转染骨髓基质细胞,通过免疫组织化学、RT-PCR及Western blot方法检测bFGF基因转染骨髓基质细胞的成功性。结果：bFGF基因成功转染大鼠骨髓基质细胞,并能持续稳定地分泌bFGF蛋白。结论：bFGF基因可以转染骨髓基质细胞,并能在骨髓基质细胞内稳定表达。     

bFGF基因转染对骨髓基质细胞生物学特性的影响

目的:研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)基因转染对骨髓基质细胞(BMSCs)生物学特性的影响,探讨细胞因子在骨缺损基因治疗的可行性,为进一步体内实验奠定基础。方法:利用脂质体将bFGF-pcDNA3重组真核表达载体导入体外培养的BMSCs中,对稳定表达bFGF的BMSCs从形态、增殖特性(MTT法)和细胞周期、碱性磷酸酶活性等生物学特性方面进行观察。采用SPSS10.0统计软件包进行t检验、方差分析,以P<0.05为差异有显著性。结果:转染bFGF-pcDNA3后,细胞生长曲线上移,倍增时间缩短,与未转染细胞相比,两者有显著差异(P<0.05),表明转染bFGF-pcDNA3后,细胞生长加快;细胞周期中增殖期细胞比例明显增大;而细胞形态和碱性磷酸酶活性无明显改变。结论:表达bFGF的BMSCs能促进自身的增殖,并不抑制细胞向成骨细胞方向分化。     

bFGF基因修饰的BMSCs促进大鼠下颌牵引成骨的研究

目的：探讨碱性成纤维生长因子（bFGF）基因修饰的自体骨髓间充质干细胞（BMSCs）促进大鼠下颌牵引成骨的作用。方法：36只雄性SD大鼠,随机分为实验组和对照组,同时对两组大鼠右下颌骨进行牵引成骨,牵引期最后1 d,实验组大鼠牵引间隙内注射转染重组质粒pcDNA-bFGF的BMSCs,对照组注射转染pcDNA空质粒的BMSCs。分别于固定期第2,4,8周分3批处死,并进行放射学检查、组织学检查及骨密度检测。结果：两组牵引间隙内均有新骨形成。各时间点实验组牵引间隙内新骨的形成和骨质密度均较对照组高（P〈0.05）。结论：bFGF基因修饰的BMSCs可有效促进DO新骨形成,为颌面部骨缺损的重建提供了一个新的修复方法。     

hbFGF基因及hBMP-7基因修饰的组织工程化复合物联合应用促进牙槽骨再生动物实验研究

目的 观察人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF)基因及人骨形成蛋白-7(hBMP-7)基因修饰的组织工程化复合物联合应用对牙槽骨缺损再生的影响.方法 利用hbFGF基因转染Beagle犬牙龈成纤维细胞(GFs),并将其接种于脱细胞真皮基质(ADM)形成组织工程化复合物,同时以hBMP-7基因转染Beagle犬骨髓基质细胞(BMSCs),将其与胶原膜BME-10X复合,共同植入Beagle犬的人工牙周组织缺损区,通过组织学观察和测量分析,评价其对牙槽骨再生的影响.结果 术后6、12周,光镜下观察可见转染GFs复合ADM组和未转染GFs复合ADM组均较单纯BMSCs复合BME-10X组有更多的新生牙槽骨、新生牙周膜和新生牙骨质样组织生长;术后12周各组相对于术后6周的各组有更多的新生牙槽骨、新生牙周膜和新生牙骨质样组织.新生牙骨质与新生牙槽骨测量显示,转染hbFGF的GFs/ADM复合物的联合应用能显著提高hBMP-7基因修饰的组织工程化复合物修复牙周组织缺损的程度.结论 转染bFGF的GFs/ADM复合物有助于促进hBMP-7基因修饰的组织工程化复合物对牙周组织缺损的修复.     

生物吸收性多孔碳酸化羟基磷灰石支架的骨传导性体外研究

目的:通过体外实验对新型生物吸收性多孔碳酸化羟基磷灰石(CAP)支架材料的骨传导性进行评价。方法:体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,向成骨诱导后,定植于不同孔隙率及不同碳酸根含量的CAP支架材料上共同培养,通过扫描电镜、细胞黏附及增殖检测(MTT法)、碱性磷酸酶(ALP)定量检测、骨钙素(OCN)定量检测,评价成骨细胞在支架材料上的附着、增殖和分化情况。结果:成骨细胞定植于不同孔隙率及碳酸根含量的支架材料上,4 h均已开始黏附、且增殖情况良好。分化实验中,ALP和OCN在各组支架材料分化良好。不同孔隙率支架材料组间比较,40%孔隙率的实验组对ALP分化的促进作用有明显优势。结论:CAP支架材料有良好的生物相容性和骨传导性,是一种良好的组织工程支架材料。     

两种多孔生物玻璃支架材料的体外细胞相容性研究

目的 对比研究采用同样原料但以不同方法制备的两种多孔生物玻璃支架材料的体外细胞相容性。方法 溶胶－凝胶法制备A/W生物活性微晶玻璃（4006材料）,熔融法制备多孔生物活性玻璃（45S5材料）。体外诱导分离培养及鉴定兔骨髓基质细胞（BMSCs）,通过材料浸提液细胞毒性实验（MTT法）、细胞黏附实验、倒置相差显微镜、扫描电镜和环境扫描电镜比较4006材料和45S5材料对BMSCs细胞黏附和生长的影响,并探索与材料复合的最佳BMSCs细胞悬液浓度。结果 4006材料浸提液培养1 d时,其细胞活力与纯培养液间无统计学差异（P>0.05）;但培养3 d后,其细胞活力低于纯培养液（P<0.01）。45S5材料浸提液培养的细胞活力明显低于纯培养液（P<0.01）。细胞与材料复合培养后,镜下见BMSCs在4006材料孔隙内贴壁生长良好,分泌基质活跃;而在45S5材料上细胞黏附生长较差。BMSCs与4006材料的黏附量随接种细胞浓度升高而升高,细胞悬液浓度为2×10⁷个•mL^-1时的细胞黏附量最高。结论 溶胶－凝胶法制备的A/W生物活性微晶玻璃具有良好的生物活性和细胞相容性,具有作为骨组织工程支架材料的潜能。与其复合的细胞悬液浓度需要2×107 个•mL-1或以上。     

PLGA/PCL/nHA生物支架复合兔BMSCs体外培养的实验研究

目的:研究新型复合支架聚乳酸-聚乙醇酸/聚己内酯/纳米羟基磷灰石(PLGA/PCL/nHA)的生物相容性,探讨其作为细胞培养材料和骨组织工程支架的可行性.方法:将兔骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)接种于PLGA/PCL/nHA复合支架上,体外共同培养后,MTT法检测BMSC...     

静电纺聚己内酯/壳聚糖纳米纤维膜诱导骨髓间充质细胞成骨分化的研究

目的：观察静电纺聚己内酯/壳聚糖纳米纤维膜对骨髓间充质细胞（BMSCs）粘附、增殖和成骨分化的影响。方法：通过静电纺丝技术制备聚己内酯/壳聚糖纳米纤维膜,将第4代BMSCs接种于纤维膜,扫描电镜、碱性磷酸酶（ALP）和茜素红染色、MTT检测BMSCs粘附、分化及增殖能力。结果：在静电纺丝技术制备的聚己内酯/壳聚糖纳米纤维膜表面,BMSCs的黏附和增殖增强,呈现明显升高的ALP活性,并形成矿化结节,提示具有向成骨细胞方向分化的倾向。结论：静电纺聚己内酯/壳聚糖纳米纤维膜对BMSCs的细胞相容性较好,适合BMSCs的黏附生长,具有诱导其向成骨细胞分化的潜能,有望成为一种新型牙周组织工程支架材料。     

Satb2过表达慢病毒载体构建及其对骨髓基质细胞的转染及表达

目的：构建大鼠特殊富含AT序列结合蛋白2（special AT-rich binding protein 2,Satb2）基因过表达的慢病毒载体,转染大鼠骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）后观察Satb2的表达。方法：采用DNA重组技术将Satb2基因插入到含有绿色荧光蛋白（GFP）基因的慢病毒表达载体质粒GV208中,获得重组慢病毒载体GV208-Satb2。重组慢病毒载体经过测序鉴定后转染293T细胞生产病毒液,用得到的病毒液转染大鼠BMSCs,Western blot分析转染前后Satb2表达情况。结果：测序结果证实Satb2基因正确插入载体中,成功构建大鼠Satb2基因过表达载体。Western blot检测显示转染后Satb2蛋白表达显著上调。结论：针对大鼠Satb2基因过表达慢病毒载体构建成功,并能有效增强BMSCs中Satb2基因的表达。