脊髓灰质炎病毒嵌合体诱生广泛反应性HIV-1中和抗体

1型人类免疫缺陷症病毒(HIV-1)包膜蛋白(env)具有广泛的序列异质性和抗原变异性,也存在着抗原性保守位点.理想的疫苗应含有此保守位点,以便诱生能与许多病毒分离株起反应的抗体.作者选用HIV-1跨膜糖蛋白gp41(组特异性抗原决定簇),以Ⅰ型脊髓灰质炎病毒Sabin疫苗株为表达载体(pCASl),用DNA重组技术构建成脊髓灰质炎病毒/HIV-1抗原嵌合体Sl/env/3.     

抗HIV-1 gp120单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备抗HIV-1 gp120单克隆抗体,鉴定其特性,为进一步研制HIV治疗性抗体提供贮备。方法将HIV-1 gp120基因片段连接到经酶切的原核表达载体PEGX-4T-2中,利用大肠杆菌XL1-blue表达GST-HIV蛋白。表达的蛋白纯化后免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,间接ELISA筛选阳性克隆。重组免疫印迹分析(RIBA)和Western blot检测抗体特异性。结果构建的重组质粒的外源基因片段经测序与预期HIV-1 gp120抗原基因片段大小一致。纯化蛋白SDS-PAGE可见1条相对分子质量(Mr)32 000的表达蛋白条带。获得6株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其细胞培养上清效价为10-3,小鼠腹水效价为10-5,抗体亚型均为IgG1。RIBA结果显示6株单抗皆只与HIV-1 gp120抗原反应。Western blot结果显示在Mr32 000处可见1条单一目的条带。结论获得6株稳定分泌抗HIV-1 gp120单克隆抗体的杂交瘤细胞株,为进一步研制抗HIV治疗性抗体奠定了基础。     

HIV-1 gp120真核表达载体的构建及表达

目的模拟HIV-1包膜糖蛋白天然构象,在真核细胞中高效表达三聚体包膜糖蛋白。方法本研究以原代HIV-1分离株06044包膜为研究对象,将不含信号肽序列的包膜gp120基因克隆至含有人类组织型纤溶酶原激活物（tPA）的信号肽序列的真核表达载体上,构建单体形式gp120蛋白表达载体;或将其克隆至含有tPA信号肽序列和蛋白质三聚化模序MTQ的真核细胞表达载体上,构建三聚体形式gp120蛋白表达载体。gp120重组表达载体体外瞬时转染293T细胞,westernblot检测表达情况。结果获得gp120蛋白单体和三聚体的真核细胞表达载体peT．06044gp120m／co和pcT-06044gp120T／co;重组质粒瞬时转染293T细胞后westernblot分析,在变性条件下,两组细胞培养上清均检测到单体形式gp120蛋白;非还原条件下,peT．06044gp120T／co转染组的细胞培养上清中检测到三聚体、二聚体和单体三种形式gp120蛋白,其百分比分别为76％、14％和10％。结论本研究成功构建了HIV-1原代06044株包膜gp120单体和三聚体表达载体,并在哺乳细胞中成功表达了gp120单体和三聚体蛋白。     

人白介素24基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的构建含有人白介素24(hIL-24)基因的重组腺病毒载体,为下一步病理性瘢痕的基因治疗研究奠定实验基础。方法采用基因工程技术将hIL-24基因的cDNA亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,鉴定正确后在PAdEasy系统中进行细菌内同源重组,通过脂质体将正确重组体包裹并转染293A细胞以包装并扩增病毒。采用酶切及PCR方法对重组腺病毒进行鉴定。结果酶切和PCR结果证实hIL-24基因重组腺病毒载体构建成功并可在293A细胞中表达,病毒滴度达107pfu/ml。结论成功构建了有较强感染能力的含hIL-24基因的重组腺病毒载体。     

人miR-378慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的构建人miR-378慢病毒表达载体。方法酶切法从已构建的质粒获得pri-miR-378,克隆于含绿色荧光蛋白(GFP)编码基因的PGCSIL载体,转化感受态细胞,产生重组慢病毒质粒PGCSIL-miR-378,并进行PCR及测序鉴定。将PGCSIL-miR-378、pHelper 1.0和pHelper 2.0三种质粒DNA共转染293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平用逐孔稀释滴度法测定病毒滴度。结果成功构建miR-378的慢病毒表达载体,测序证实所插入基因序列完全正确。荧光显微镜检测证实PGCSIL-miR-378携有正确的miR-378基因,并能在293T细胞中表达。检测病毒滴度为8×108 TU/ml。结论成功建立了miR-378慢病毒表达系统。     

多药耐药基因-腺病毒重组表达载体的构建及鉴定

目的构建多药耐药(multidrug resistance,MDR)基因-腺病毒重组表达载体。方法将MDR1基因插入到腺病毒载体,用磷酸钙沉淀法将此重组载体转染到293细胞,制备重组病毒悬液并感染靶细胞进行鉴定。结果构建的MDR1-腺病毒载体在293细胞中大量产生,病毒滴度达109PFU/ml,此病毒感染靶细胞后,在靶细胞中有MDR1基因的表达。结论成功构建了MDR1-腺病毒重组表达载体。     

构建含绿色荧光蛋白和潮霉素抗性基因重组逆转录病毒载体的实验研究

目的 构建含增强绿色荧光蛋白(EGFP)和潮霉素抗性(Hyg)重组逆转录病毒载体.方法 将Hyg和EGFP基因片段分别插入逆病毒载体质粒pCMV-LL-SA-2中,构建重组的逆病毒质粒pCMV-EGFP-hyg与质粒pCMV-G和pCMV-GP共转染293T细胞产生重组逆病毒,感染白血病细胞株K562.结果 成功构建重组逆病毒载体质粒pCMV-EGFP-hyg,与质粒pCMV-G和pCMV-GP共转染293T细胞后24 h和48 h,细胞培养上清中的病毒滴度分别为7.5×105CFU/ml和1.5×106 CFU/ml.K562细胞经与产毒293T细胞协同培养感染重组逆病毒后,表达EGFP的阳性细胞比率为59.6%.经Hyg筛选后,98%以上的K562细胞为EGFP表达细胞.结论 成功构建了含EGFP和Hyg的重组逆转录病毒载体,可以产生较高滴度的目的 病毒;并且建立了稳定持久表达EGFP的K562白血病细胞系.     

ABCC2基因过表达细胞株的建立及鉴定

目的 构建携带ABCC2基因的慢病毒载体,转染HEK293细胞,筛选出稳定过表达ABCC2基因的细胞株并进行鉴定,为体外实验确定与多药耐药相关蛋白2(MRP2)外排转运相关的底物药物及其转运机制提供细胞模型。方法 根据GenBank提供的ABCC2基因cDNA序列设计引物,PCR扩增该基因并将其连接至慢病毒载体PZE-LV105,包装病毒并感染HEK293细胞。用嘌呤霉素进行筛选得到过表达ABCC2基因的稳转细胞株,通过基因测序、实时荧光定量PCR(RTQ-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)对稳转细胞进行鉴定。结果 测序结果证明重组慢病毒过表达载体所携带的ABCC2基因序列与GenBank提供的ABCC2序列一致;RTQ-PCR分析结果显示转染了ABCC2基因的HEK293细胞中MRP2 的mRNA相对表达比正常HEK293细胞和空白载体对照HEK293细胞高出约320倍;蛋白免疫印迹试验显示,转染了ABCC2基因的HEK293细胞中MRP2蛋白表达水平比正常HEK293细胞和空白载体对照HEK293细胞高出约150倍。结论 该实验成功构建了稳定过表达ABCC2基因的细胞株,该细胞株可用于初步筛选确定MRP2的特异性外排转运底物及其转运机制。     

SP-D基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的构建并鉴定含肺表面活性蛋白D(SP-D)基因的重组真核表达质粒。方法提取A549细胞的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增含SP-D基因的cDNA,将产物克隆进真核载体pGEFP-N1内,构建含SP-D基因的重组真核表达质粒。将pGEFP-N1-SP-D重组质粒和pGEFP-N1空载体分别转染293T细胞,Western blot法检测SP-D的蛋白表达。结果双酶切鉴定及核酸序列分析证实,SP-D已成功插入真核载体pGEFP-N1内。转染pGEFP-N1-SP-D的293T细胞中检测到高表达的SP-D蛋白。结论成功构建含SP-D基因的重组真核表达质粒,并能在293T细胞中高表达。     

HIV-1 Gag-gp120嵌合基因在重组杆状病毒系统中的嵌合表达

将中国株HIV-1B亚型gag基因序列克隆到杆状病毒表达载体pFASTBAC1中,将gp120基因以相同的读框克隆到gag基因的3／端下游,构建了重组表达质粒pFge,利用大肠杆菌埃希菌杆状病毒表达系统筛选重组杆状病毒,在昆虫细胞sf9中表达了HIV-1的Gag-gp120嵌合蛋白。     

重组HIV-2金丝雀痘(ALVAC)疫苗在食蟹猴中的免疫原性和保护力

作者在26只食蟹猴中对其组建的两种携带2型人类免疫缺陷症病毒(HIV-2)基因的重组金丝雀痘病毒的免疫效果进行了研究.一种是vCP188,表达全部HIV-2env基因产物;另一种是vCP206,表达HIV-2gag和pcl基因产物以及HIV-2env基因产物gp120(TM).用纯化的天然HIV-2gp125或     

用重组禽痘病毒表达HIV-1包膜基因

1型人免疫缺陷症病毒(HIV-1)env基因编码糖基化蛋白前体,其在细胞中被蛋白酶水解成精蛋白(gp)120及gp41.已在gp41氨基末端发现高度免疫显性表位,后者能使健康的血清阳性个体产生体液免疫,在体外能特异性地抑制淋巴细胞增生.此区与Ⅰ型和Ⅱ型人嗜T淋巴细胞病毒的gp21E跨膜蛋白和多种逆转录病毒的免疫抑制(IS)区具有同源序列.作者通过基因重组获得了表达HIV-1SF2株包膜基因的重组金丝雀痘(CP)病毒和禽痘(FP)病毒,并将它的表达情况在鸡胚成纤维细胞(CEF)、猴肾细胞(Vero)及     

人脂联素基因慢病毒载体在293 T细胞中的表达及意义

目的构建携带人脂联素(human apM1,hapM1)基因的慢病毒载体,并观察其在293 T细胞中的表达及意义。方法将hapM1的编码区(CDS区)从克隆载体上亚克隆到慢病毒载体上,构建重组慢病毒载体质粒。在脂质体介导下与包装质粒HELPER、包膜质粒VSVG共转染293 T细胞包装生产慢病毒。慢病毒感染293 T细胞后,RT-PCR和Westernblot法检测在293 T细胞中hapM1基因的表达。采用抑制血管平滑肌细胞增殖实验,检测表达产物的生物学活性。结果hapM1基因经测序后与GenBank报道序列完全一致。重组慢病毒载体质粒PNL-hapM1-IRES2-EGFP经鉴定正确。三质粒共转染293 T细胞成功,收集、浓缩病毒后测定其滴度为2.0×105TU·L-1。感染293 T细胞后RT-PCR、Western blot检测hapM1组细胞有hapM1蛋白表达,其余两组(Mock-293 T组、293 T组)均无表达。表达产物hapM1蛋白能够抑制血管平滑肌细胞的增殖。结论成功构建带有hapM1基因慢病毒载体,并且能够在293 T细胞中表达具有生物学活性的hapM1蛋白。     

携带人生存素基因短发夹RNA表达载体重组腺病毒的构建及其生物学作用

目的构建携带人生存素(survivin)基因短发夹RNA(shRNA)表达载体的重组腺病毒。方法构建并筛选重组质粒pShuttles-urvivin,将其与腺病毒骨架质粒共转染HEK-293细胞,经同源重组产生腺病毒;PCR鉴定并测定病毒滴度;β-半乳糖染色检测病毒对人乳腺癌细胞MCF-7的感染效率;流式细胞术、RT-PCR和W estern免疫印迹法检测其生物学功能。结果经PCR鉴定重组腺病毒构建成功;48 h后感染率达75%以上;腺病毒感染MCF-7细胞后48 h,生存素mRNA和蛋白的表达均受到抑制;腺病毒感染MCF-7细胞后,细胞分裂受阻于G2/M期,在48和72 h有凋亡峰出现。结论成功构建人生存素基因shRNA表达载体的重组腺病毒。     

肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体表达载体的制备

目的构建一种携带肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体（TRAIL）基因的重组腺相关病毒（rAAV）载体。方法首先构建携带可溶性肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体（sTRAIL）基因的穿梭质粒腺相关病毒穿梭质粒-可溶性肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体（pAAV-sTRAIL），将穿梭质粒转染入HEK293细胞（人胚肾细胞系）中，采用细胞内质粒DNA同源重组法构建重组腺相关病毒载体rAAV-sTRAIL。以噬斑分析法筛选单克隆rAAV-sTRAIL；PCR法鉴定阳性rAAV-sTRAIL；氯化铯密度梯度离心法纯化rAAV-sTRAIL；紫外分光光度仪测定rAAV-sTRAIL颗粒数及纯度，噬斑分析法测定rAAV-sTRAIL感染滴度；Western免疫印迹检测rAAV-sTRAIL在HEK293细胞中的表达情况。结果成功构建了rAAV-sTRAIL，制备的病毒纯度好、滴度高，且在HEK293转导细胞中能有效表达目的基因sTRAIL。结论构建的重组腺相关病毒载体rAAV-sTRAIL，为研究TRAIL抗肿瘤细胞效应及临床应用提供先进的载体系统。     

携带人CTLA4-Ig融合基因的非增殖腺病毒载体的构建及表达

目的 研究携带人细胞毒T淋巴细胞相关抗原(CTLA)4-Ig融合基因的非增殖腺病毒载体的生物学特性.方法 构建含人CTLA4-Ig的非增殖腺病毒载体质粒pAdTrack-CMV-hCTLA4-Ig,与非增殖腺病毒骨架质粒pAdEasy共转化大肠杆菌DH5α,在细菌内同源重组,获得重组非增殖腺病毒载体质粒pAdTrack-hCTLA4-Ig,转染293细胞,经过包装、扩增、纯化后,获得携带人CTLA4-Ig融合基因的非增殖腺病毒.体外感染人近端肾小管上皮细胞株HK-2细胞,72 h后检测其外分泌性表达.结果 获得携带人CTLA4-Ig融合基因的非增殖腺病毒,滴度为6×1013空斑形成单位/毫升(pfu/ml);在其感染的人近端肾小管上皮细胞株HK-2细胞培养上清液中能检测到可溶性重组蛋白CTLA4-Ig的表达.结论 制备的重组非增殖腺病毒在体外能有效感染人近端肾小管上皮细胞株HK-2细胞,受感染细胞能表达、分泌可溶性蛋白CTLA4-Ig.     

携带hIGF-Ⅰ基因的腺病毒载体构建

目的 探讨构建携带hIG-Ⅰ基因腺病毒载体的可行性.方法 从pcDNA 3.1-hIGF-Ⅰ质粒中克隆出hIGF-Ⅰ基因的编码序列,酶切、连接后,插入腺病毒系统中的穿梭载体pAdshuttle-CMV,获得重组质粒pAdshuttle-CMV-hIGF-Ⅰ,将其转化含有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠杆菌BJ5183,进行同源重组,获得重组子pAdeasy-1-IGF-Ⅰ.鉴定后,将pAdeasy-1-IGF-Ⅰ转染人胚肾细胞(Ad293细胞),获得含hIGF-Ⅰ基因的重组腺病毒(rAd-hIGF-Ⅰ).再鉴定后,Ad293细胞反复感染冻融扩增腺病毒,50%组织培养感染量法(TCID50)检测病毒滴度.将病毒颗粒感染绿猴肾成纤维细胞(COS-7细胞),荧光显微镜观测绿色荧光蛋白(GFP)的表达,RT-PCR分析hIGF-Ⅰ基因在mRNA水平的表达,Western blot分析hIGF-Ⅰ在蛋白水平的表达.结果 成功构建出含有hIGF-Ⅰ基因的腺病毒载体rAd-hIGF-Ⅰ,转染COS-7细胞后发现绿色荧光蛋白表达,同时RT-PCR扩增出318 bp的目的 条带,Western blot得到7.6kDa大小的同的蛋白,证明了腺病毒载体rAd-hIGF-Ⅰ能成功转染COS-7细胞,hIGF-Ⅰ基因能在其中成功表达.结论 成功构建出含有hIGF-Ⅰ基因的腺病毒载体rAd-hIGF-Ⅰ,并且证实其能对COS-7细胞进行有效转染,为组织工程软骨的进一步改良提供了高效的基因载体.     

人PD-1基因克隆及其在L929基因转染细胞上的表达

目的 克隆人PD-1基因,构建含有该目的基因的重组逆转录病毒载体,并转染入L929细胞,获得稳定高表达PD-1分子的L929细胞。方法 用PCR法从pGEX-5X-3-PD-1扩增出PD-1基因,通过双酶切（PstI BamHI）装入逆转录病毒载体pGEZ Term中,脂质体法共转染包装细胞293T,用含有完整病毒颗粒的293T细胞的培养上清感染L929细胞,72h后,加入Zeocin进行筛选,挑选出能稳定表达PD-1分子的L929细胞株。结果 成功克隆了人PD-1基因,构建了含PD-1基因的重组逆转录病毒载体,包装出具有感染能力的重组PD-1逆转录病毒,筛选出具有稳定表达人PD-1分子的L929基因转染细胞。经流式细胞仪检测：PD-1分子在L929基因转染细胞中具有高表达,达到97．6％。结论 构建了含人PD-1基因重组逆转录病毒的载体,筛选出稳定表达人PD-1分子的L929细胞株。     

大鼠 paralemmin-3基因重组慢病毒载体构建及其在肺泡巨噬细胞中的表达

目的 构建大鼠 paralemmin-3（PALM3）基因重组慢病毒载体,探讨转染大鼠肺泡巨噬细胞系 NR8383细胞的最佳感染复数（MOI）值及目的基因 PALM3的表达情况。方法 采用聚合酶链反应技术（PCR）扩增鼠 PALM3基因片段,并将其克隆到 pCV186-Cherry载体上;经 PCR及 DNA测序鉴定后,将重组质粒 pCV186-Cherry-PALM3、辅助包装质粒 pHelper 1.0与 pHelper 2.0共转染至 293T细胞进行重组慢病毒 lenti-CV186-Cherry-PALM3的包装,并用荧光标记法行滴度的测定。将不同 MOI值（0、1、10、20、50）的 lenti-CV186-Cherry-PALM3转染 NR8383细胞,依据转染效率得到最佳 MOI 值,以此 MOI 值感染 NR8383细胞,采用 Western blot 法检测目的基因的表达情况。结果 通过 PCR扩增获得了大小约 2 246 bp的目的基因片段,并成功连接到 pCV186-Cherry重组质粒上。PCR及 DNA测序结果证实重组质粒 pCV186-cherry-PALM3 携带正确的鼠 PALM3 基因并成功包装重组慢病毒颗粒。重组慢病毒 lentiCV186-Cherry-PALM3 的滴度测定为 3×108 TU/mL,感染 NR8383 的最佳 MOI 为 20,慢病毒 lenti-CV186-CherryPALM3 感染后 NR8383 细胞中 PALM3 的蛋白表达水平显著上调（P＜0.05）。结论 本实验成功构建了含大鼠PALM3基因的重组慢病毒载体 lenti-CV186-Cherry-PALM3,并能在 NR8383细胞中高效表达,为进一步研究 PALM3对肺泡巨噬细胞极化的影响奠定了基础。     

携带狂犬病病毒糖蛋白基因的质粒载体能诱导保护性免疫力

作者构建了在SV40早期启动子控制下表达狂犬病病毒糖蛋白的质粒载体pSG5rab.gp.对C3H/He小鼠于左腓肠肌作肌肉注射,用~(51)Cr释放试验测定糖蛋白特异性细胞毒性T(TC)细胞应答.结果表明,150μg质粒免疫1次,不能诱导特异性Tc细胞应答.免疫两次,间隔2～3周,可诱导抗狂犬病病毒G蛋白中抗原决定簇的Tc细胞应