恶性疟原虫NADP依赖型异柠檬酸脱氢酶重组蛋白的酶活性及其特异性氨基酸序列

红内期恶性疟原虫对氧化作用十分敏感 ,参与代谢反应的多种酶均需还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NADPH)。异柠檬酸脱氢酶 (ICDH )可催化异柠檬酸氧化脱羧 ,产生 2 酮戊二酸、二氧化碳和NADPH。因此 ,ICDH是催化其代谢反应的关键酶。Chan等克隆了恶性疟原虫ICDH (pfICDH)基因 ,并对其在大肠杆菌中的表达及重组蛋白酶活性进行了研究。根据PlasmoDB数据库中恶性疟原虫基因组信息预测的ICDH开放阅读框设计出一对引物 ,以提取的恶性疟原虫Tan株基因组DNA为模板 ,PCR扩增出ICDH基因。经测序证明 ,其核苷酸序列与PlasmoD…     

异柠檬酸脱氢酶1在肝脏疾病中作用的研究进展

异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)作为胞质和过氧化物酶体中一种依赖NADP的酶,主要促进异柠檬酸转变为α-酮戊二酸,并生成NADPH.IDH1广泛参与肝脏中糖、脂质和氨基酸代谢以及氧化应激的发生,并与多种肝脏疾病的发生发展密切相关.突变的IDH1可将α-酮戊二酸转变为一种肿瘤代谢物-2-羟基戊二酸,参与肝脏肿瘤的代谢重编程及...     

恶性疟原虫的一种过氧化物氧化还原酶的分子克隆和鉴定

恶性疟原虫在人体内的红内期和肝期寄生于富含氧的环境。宿主免疫系统、疟原虫自身代谢(如消耗红细胞中的血红蛋白)以及某些抗疟药的使用而产生的活性氧族(ROS)使疟原虫受到毒性作用。超氧化物歧化酶(SOD))、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、过氧化氢酶是三种主要的抗活性氧酶。在恶性疟原虫中内源性SOD、GPx已得到鉴定,但内源性过氧化氢酶的存在尚无明确的报道。     

通过测定恶性疟原虫乳酸脱氢酶活性来估量原虫血症

恶性疟原虫乳酸脱氢酶(LDH)在催化乳酸生成丙酮酸反应中,能够迅速地利用乙酰吡啶NAD(APAD)作为辅酶,而人红细胞LDH在APAD存在时参与这一反应的速率很慢。基于这一现象,作者设想通过测定寄生虫LDH(pLDH)来反映恶性疟原虫的存在。 所用虫种为多株恶性疟原虫,按常规方法培养。用普通光镜检查吉氏染色的薄血膜和使用benzothiocarboxypurine染料的荧光     

在人体红细胞内生长的恶性疟原虫缺乏α-酮戊二酸脱氢酶活力而有固定CO_2活性

Roth等报道了鸭疟原虫和恶性疟原虫中有谷氨酸脱氢酶,而且感染恶性疟原虫的红细胞的α-酮戊二酸含量要比未感染的约高4倍。红细胞中CO_2固定的其他途径也可能是α-酮戊二酸量增加。倘若能肯定由~(14)C标记的谷氨酸形成的~(14)C α-酮戊二酸代谢到~(14)CO_2,则表示有α-酮戊二酸脱氢酶存在于恶性疟原虫中,它至少是柠檬酸循环的一个功能性步骤。Homewood和Neame报道鸭疟原虫、伯氏疟原虫和诺氏疟原虫可固定CO_2,但是还未确证究竟CO_2是由虫本身固定的还是由宿主细胞固定。如能确定寄生于人体的恶性疟原虫能否固定相当量的CO_2则是非常有意义的。本文主要采用[1-~(14)C]谷     

老年慢性肝病患者血清ICDH、CHE的变化及临床意义

目的：探讨老年慢性肝病患者血清异柠檬酸脱氢酶（ICDH）和胆碱脂酶（CHE）的变化及临床意义。方法：对70例老年慢性肝病患者及54例健康老年人血清中ICDH和CHE活性检测。结果：老年慢性肝病患者血清中CHE活性明显低于正常对照组。且随病情加重降低更为明显（P＜0．01）；血清中ICDH活性明显高于正常对照组，且随病情加重而升高更为明显（P＜0．01）。结论：ICDH和CHE是反映肝实质细胞受损害及其合成代谢能力下降的敏感指标。检测ICDH、CHE的变化可以反映肝病发展的程度，对判定治疗效果及预后有重要意义。     

微量酶联免疫吸附试验测定恶性疟患者抗体的特异性

作者用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定疟疾病人和在流行区居民的抗体。收集恶性疟原虫感染的红细胞(50～100%为滋养体和裂殖体)和游离的原虫,经洗涤、离心超声等处理后,获得抗原。有些试验中用~(35)S-蛋氨酸代谢标记培养中的恶性疟原虫抗原进行试验,另以正常人体红细胞溶血后的细胞膜制备红细胞抗原与疟原虫抗原平行进行试验。抗IgG、抗IgM免疫球蛋白碱性磷酸酶     

消炎痛能部分恢复急性疟疾病人被抑制的体外淋巴细胞增生反应

人体急性感染恶性疟原虫时对恶性疟原虫(P.f)抗原的体外淋巴细胞增生反应受抑制,对其它寄生虫病的研究提示,单核/巨噬细胞来源的前列腺素E可能与该免疫抑制有关。本研究将可阻断前列腺素合成的环氧化酶抑制剂消炎痛加入培养液中观察外周血单核细胞(PBMC)对疟原虫抗原和其它无关抗原及有丝分裂原的增生反应。 30例无并发症的急性恶性疟患儿在治疗前采集5ml静脉血,其中13例在3周后恢复期     

恶性疟原虫大片段DNA在酵母菌人工染色体中稳定克隆

恶性疟原虫大片段DNA在大肠杆菌中克隆不稳定,很可能与恶性疟原虫DNA的A+T含量非常高(82%)有关。酒酿酵母菌与恶性疟原虫的A+T含量较大肠杆菌与恶性疟原虫的A+T接近,因此对100kb以上的恶性疟原虫DNA片段在酵母菌人工染色体(YACs)克隆的稳定性进行了研究。pYAC4经氯化铯标准法纯化,EcoRI和BamHI完全酶切,小牛肠碱性磷酸酶去磷酸化作为载体DNA。恶性疟原虫B8分离株DNA经EcoRI部分酶切,约15μg埋于琼脂糖井内,用EcoRI部分酶切,然后进行脉冲电场梯度凝胶电泳(PFGE),去除<100kb     

线粒体抑制剂对体外培养的红内期恶性疟原虫的作用

人们对于哺乳动物红内期疟原虫线粒体的功能了解很少。由于疟原虫缺乏整套的柠檬酸循环酶,所以一般认为它们是经由糖酵解途径获得能量的。然而目前超微结构及生化的研究表明疟原虫的线粒体可能与能量代谢有关。为进一步了解疟原虫线粒体的功能,本文作者用体外方法研究了线粒体功能抑制剂对红内期恶性疟原虫的作用。     

用专一性针对点突变的多聚酶链反应检测抗乙胺嘧啶恶性疟原虫

恶性疟原虫乙胺嘧啶抗性株的检测,以往大多采用体外微量法。本文报道了用多聚酶链反应(PCR)技术检测乙胺嘧啶抗性株。该检测方法的原理是:恶性疟原虫对乙胺嘧啶产生抗药性的关键在于其二氢叶酸还原酶胸苷酸合成酶(DHFR-TS)基因编码区第323位碱基发生突变,利用该单碱基突变,设计一对专一性引物位于突变部位内,使引物与靶DNA 3’端完全互补,在DNA多聚酶的催化下,靶DNA得到扩增。由于与引物     

恶性疟原虫一种天冬氨酸蛋白酶的序列、表达及模式结构

一个编码天冬氨酸蛋白酶的基因克隆(0075M)已从恶性疟原虫HB_3株基因文库中获得。经双脱氧测序法测定该基因片段长14136bp,含1368bp开放阅读框架。该基因编码的蛋白质与D.Goldberg从红内期恶性疟原虫的消化空泡中分离的天冬氨酸血红蛋白酶ⅡN端氨基酸序列比较无差异,且两酶分子量相似,从而证实了0075M编码的恶性疟原虫天冬氨酸蛋白酶(PFAPD)和天冬氨酸血红蛋白酶Ⅱ是同一种酶。该酶的关键作     

用于恶性疟原虫体外培养的红细胞的贮存

从事恶性疟原虫体外培养的研究人员在使用贮存达4周以上的人红细胞时常有顾虑。按常规,红细胞在4℃贮存于柠檬酸—右旋糖(ACD)、柠檬酸—磷酸—右旋糖     

多胺合成抑制剂放线菌酮及冬虫夏草素的抗约氏疟原虫作用

文献报道疟原虫存在多胺合成代谢的鸟氨酸脱羧酶,还报道该酶的抑制剂二氟甲基鸟氨酸对疟原虫有抑制作用.我们在研究疟原虫多胺代谢时亦观察到人恶性疟Fcc_1株疟原虫存在鸟氨酸脱羧酶活力,并用该酶的抑制剂放线菌酮(Cycloheximide)     

抗环子孢子蛋白保守II~ 区单克隆抗体的制备及鉴定

目的　获得针对恶性疟原虫环子孢子蛋白 (CSP)保守II 区 (RegionII )的单克隆抗体。　方法　采用恶性疟原虫保守II 区十二肽 (EWSPCSVTCGNG)免疫BALB/c小鼠 ,经融合 ,ELISA 3次筛选 ,获得 3株分泌针对保守II 区单克隆抗体的杂交瘤细胞株。　结果　ELISA检测结果显示单抗能与重组表达的恶性疟原虫CSP片段及天然CSP特异性反应。间接荧光抗体检测显示 ,单抗不仅能识别恶性疟原虫子孢子 ,也能识别约氏疟原虫子孢子。　结论　成功地获得了针对恶性疟原虫CSP保守II 区的单克隆抗体     

恶性疟原虫对乙胺嘧啶的抗性机制

作者在体外观察了恶性疟原虫FCR株(乙胺嘧啶敏感株,IC_(50)=3)和W_2株(乙胺嘧啶抗性株,IC_(50)=30000)对[(14)C)乙胺嘧啶的摄入、乙胺嘧啶的代谢以及二氢叶酸还原酶(DHFR)酶促反应的动力学特征。实验采用含8％高度同步化的14小时龄环状体原虫与20μM的[~(14)C]乙胺嘧啶共同孵育24小时,液体闪烁计数器测定[~(14)C]乙胺嘧啶的放射性,并推算疟原虫摄入乙胺嘧啶的量。结果,FCR株与W_2株摄入量无差异。对照组每10~9正常红细胞摄入乙胺嘧啶0.07nmol,感染疟原虫的红细胞摄入0.24nmol,另用放     

恶性疟原虫cDNA克隆(CO111)的序列测定和分析

目的: 测定和分析cDNA 克隆(CO111)与抗恶性疟原虫兔血清和1株单克隆抗体呈阳性反应的序列。方法:采用PCR扩增CO111 克隆的cDNA 片段,纯化后经Klenow 酶补平,与M13m p18 载体连接,转化到大肠杆菌(E.coli) JM109。PCR筛选和鉴定M13单链,PEABI373ADNA自动测序仪测序,PC/GENE和GenBank (EM-BL)等软件进行序列分析和比较。结果:CO111 cDNA克隆含有233对核苷酸对。与GenBank 数据库中恶性疟原虫DNA比较,未发现与该cDNA相同的序列。结论:分离出1 个新的与抗恶性疟原虫抗体呈阳性反应的抗原cDNA克隆     

荧光重组酶聚合酶扩增/CRISPR-Cas12a快速检测恶性疟原虫方法的建立与初步评价

目的 建立一种基于重组酶聚合酶扩增(recombinase-aided amplification,RAA)和CRISPR-Cas12a系统的荧光快速检测恶性疟原虫方法,并对其检测效能进行初步评价。方法 选择恶性疟原虫18S核糖体RNA(rRNA)基因为靶序列,设计和合成3组RAA引物及CRISPR来源RNA(crRNA),选择最佳组合并优化反应条件,建立荧光RAA/CRISPRCas12a检测方法。构建包括靶标区的恶性疟原虫3D7株18S rRNA基因质粒,将质粒浓度分别稀释成1 000、100、10、1拷贝数/μL进行荧光RAA/CRISPR-Cas12a反应,评价荧光RAA/CRISPR-Cas12a法检测敏感度;分别以间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫、乙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、梅毒螺旋体基因组DNA为模板,进行荧光RAA/CRISPR-Cas12a反应,评价荧光RAA/CRISPR-Cas12a法检测特异度。分别采用荧光RAA/CRISPR-Cas12a法和巢式PCR法对50份疟疾临床样本进行检测,比较两种方法检测一致性。体外培养恶性疟原虫3D7株,经培养后获得的培养物...     

PCR检测疟疾混合感染的现场应用研究

目的 评价PCR检测技术在间日疟与恶性疟混合感染区诊断疟疾的现场应用价值。方法 采集海南省疟疾混合感染流行区304份滤纸干血滴样本，根据红内期疟原虫SSUrRNA基因序列，设计合成3条引物．采用PCR技术在同一反应体系中扩增出间日疟原虫和恶性疟原虫不同的DNA片段，检测现场所采样本中的间日疟原虫或恶性疟原虫DNA；同时与镜检法进行比较。结果 在304份样本中，PCR法阳性15份，其中间日疟7份．恶性疟8份；镜检法阳性11份，其中间日疟6份，恶性疟5份。镜检阳性的样本PCR均为阳性；镜检阴性而PCR阳性的4份样本，其扩增产物经限制性酶切鉴定，证实为间日疟原虫或恶性疟原虫DNA。结论 此PCR检测体系灵敏、特异．对诊断或鉴别诊断间日疟原虫和恶性疟原虫混合感染具有实用价值。     

河南省自赤道几内亚输入的恶性疟原虫抗药性基因多态性分析

目的分析河南省自赤道几内亚输入性恶性疟原虫抗药性基因多态性,了解恶性疟原虫基因突变情况,评估其流行特征。方法收集河南省2012—2019年自赤道几内亚输入性恶性疟病例信息和外周血样,提取血样中恶性疟原虫基因组DNA,巢式PCR扩增恶性疟原虫Kelch 13螺旋体(PfK13)基因、恶性疟原虫氯喹抗性转运蛋白(Pfcrt)基因、恶性疟原虫多药物抗性基因1 (Pfmdr1)、恶性疟原虫二氢叶酸还原酶(Pfdhfr)基因和恶性疟原虫二氢蝶酸合酶(Pfdhps)基因,琼脂糖凝胶电泳后进行双向测序。获得的基因序列通过MEGA7软件与参考基因组进行比较获得突变位点信息,参考基因组来自GenBank的恶性疟原虫3D7野生虫株(GenBank登录号分别为PF3D7＿1343700、PF3D7＿0709000、PF3D7＿0523000、PF3D7＿0417200和PF3D7＿1324800)。使用SPPS21.0软件对数据进行统计学分析。结果2012—2019年,河南省共报告输入性疟疾病例1 522例,其中自赤道几内亚输入病例117例,包括恶性疟病例97例、卵形疟病例16例、间日疟和三日疟病例各1例、...